Name: 分離するために遺伝学的スクリーニングトキソプラズマホストセル出口変異体 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: 学ぶToxoplasma gondiiの宿主細胞出口変異体を分離するための遺伝学的スクリーニング法。化学的変異原処理と温度感受性表現型を用いて、出口欠損変異体を効率的に濃縮・単離する手法を解説します。

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この作品は、米国心臓協会の科学者は開発グラント0635480Nと健康研究助成金AI081220の国民の協会によって資金を供給された。 BICは、テンプル騎士団アイ財団研究助成金によってサポートされています。

<ol><li>Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+acetaldehyde+elevate+intracellular+%5BCa2%2B%5D+and+stimulate+microneme+discharge+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii.</a> Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).</li>
<li>Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+cytoplasmic+potassium+upon+host+cell+breakdown+triggers+egress+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).</li>
<li>Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+activation+of+the+Toxoplasma+gondii+nucleoside+triphosphate+hydrolase+leads+to+depletion+of+host+cell+ATP+levels+and+rapid+exit+of+intracellular+parasites+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells.</a> J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).</li>
<li>Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+dithiol-induced+Ca2%2B+flux+causes+egress+of+parasites+from+the+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole.</a> Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).</li>
<li>Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+induction+of+egress+by+the+potassium+ionophore+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin.</a> Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).</li>
<li>Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+calcium+ionophore+A23187-mediated+exit+of+trophozoites+from+infected+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages.</a> Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).</li>
<li>Hoff, E. F., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Toxoplasma+egress+the+first+step+in+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Is Toxoplasma egress the first step in invasion.</a> Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).</li>
<li>Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+protein+secretion+potentiates+motility+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).</li>
<li>Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+protein+kinase+1+is+an+essential+regulator+of+exocytosis+in+Toxoplasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma.</a> Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).</li>
<li>Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutant+of+Toxoplasma+gondii+reveals+involvement+of+a+sodium%2Fhydrogen+exchanger+in+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation.</a> J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).</li>
<li>Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutants+of+Toxoplasma+gondii+reveal+host+cell+permeabilization+as+an+early+event+in+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).</li>
<li>Chandramohanadas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicomplexan+Parasites+Co-Opt+Host+Calpains+to+Facilitate+Their+Escape+from+Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells.</a> Science. , (2009).</li>
<li>Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screen+to+dissect+Toxoplasma+gondii+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+isolation+and+preliminary+characterization+of+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants.</a> Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba.+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li>
<li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li>
<li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li>
<li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li>
<li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li>
<li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li>
<li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li>
<li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li>
<li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li>
<li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li>
<li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca%282%2B%29+release+from+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+%28IP%283%29%29%2Fryanodine-sensitive+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li>
<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
<li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

<html>記述されているプロトコルは、出口の欠陥とはトキソプラズマの変異体を単離するための効率的な方法を提供する。デュアル侵略の表現13を持っているそのうちのいくつかは我々が正常に、出力経路の様々なステップに沿って変異体を単離した。侵略の潜在的な影響は、差動抗体染色23,24によって非侵略寄生虫から侵入区別いわゆる赤緑のアッセイを用いて決定することができる。侵略と出力の両方のアッセイのためには、寄生虫13,22の細胞質内に自家蛍光タンパク質マーカーを発現するのに便利かもしれません。寄生虫が誘発されている場合は、既にこれは後に免疫による追加の表現型の特性と干渉する可能性蛍光タンパク質を発現する。これは、その分離した後に変異体に蛍光マーカーを追加することは常に可能です。記載されているように、単純な、非蛍光性の代替は、出力用をDiff-Quick染色です。 t &quot;は&gt;歴史的に、変異原ENUは、 トキソプラズマ遺伝学14に印加されていますが、ENUは、優先的に我々はトキソプラズマ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> N3385 </td><td> -20℃でDMSO、ストア内の1 Mストック</td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M0880 </td><td> -20℃でDMSO、ストア内の1 Mストック</td></tr><tr><td>硫酸デキストラン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P8765 </td><td> PBS中100mMのストック</td></tr><tr><td> diffのクイック</td><td> EMDケミカルズ</td><td> 65044から93 </td><td></td></tr><tr><td>フィルターホルダー</td><td>コー​​ル·パーマー</td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3μmのポリカーボネートフィルター</td><td>ワットマンシュライヒャー＆シュル</td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td> Hausser科学</td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2インキュベータ</td><td>さまざまなメーカー</td><td></td><td>加湿5％35 CO 2、37および40°C </td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>さまざまなメーカー</td><td></td><td> 63xまたは100倍の油を目的とした理想的には反転し、広視野</td></tr></tbody></table> HBSSc（ブラックらによると11。） <ul><li> 98.0ミリリットルハンクス平衡塩溶液（ハイクローンのカタログ番号SH30588） </li><li> 100μlの1MのMgCl 2（100mMの端） </li><li> 100μlの1MのCaCl 2（100mMの端） </li><li> 2.0ミリリットル1M Hepes緩衝液pH 7.3（20mMの終わり） </li><li> 84 mgを飽和NaHCO 3（10mMの端） </li></ul>

分離するために遺伝学的スクリーニングトキソプラズマホストセル出口変異体

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

広く、偏性細胞内、原虫寄生虫トキソプラズマ原虫は、免疫不全患者に日和見疾患を引き起こす先天性感染症に先天性欠損症を引き起こす。 1：溶菌複製サイクルは3つの段階によって特徴づけられる。核宿主細胞の積極的な侵攻2。宿主細胞内で複製、3。宿主細胞からのアクティブな出口。出口のメカニズムは、ますますまだ不十分分子レベルで理解されている、ユニークで高度に調節されたプロセスとして、高く評価されています。出口の根底にあるシグナル伝達経路は、経路1-5のさまざまな側面に作用する薬剤の使用によって特徴づけられている。このように、出口のいくつかの独立したトリガーはすべての細胞内Ca 2 +、また、宿主細胞の浸潤6-8重要である信号のリリースに収束するが同定されている。この洞察は、識別子につながった候補遺伝子アプローチを通知出口9に関与するカルシウム依存性プロテインキナーゼ（CDPK）のような植物のfication。さらに、理解の出口における最近のいくつかのブレークスルーが（化学）遺伝的アプローチを10-12を使用して行われています。 トキソプラズマの増加遺伝アクセシビリティと薬理学の豊富な情報を結合するために我々は最近、宿主細胞の出口13の欠陥を持つ寄生虫変異体の濃縮を可能にする画面を設立しました。 N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）またはエチルメタンスルホネート（EMS）を使用して、化学的突然変異誘発はトキソプラズマ生物学11,14,15の研究に何十年も使用されているが、ごく最近の基礎となる突然変異の遺伝子マッピングを持つ表現型は、ルーチン16になる-18。さらに、温度​​感受性変異体を生成することにより、本質的なプロセスは、解剖することができ、基礎となる遺伝子が直接識別されます。これらの変異体は、許容温度（35℃）下で野生型として動作するが、pに失敗する問題の突然変異の結果として、制限温度（40℃）でroliferate。ここでは、温度に敏感な出力表現型13に突然変異体を単離するための新たな表現型のスクリーニング方法を示しています。出力画面の課題は、宿主細胞に寄生虫の再侵攻、高速かつ一般的な粘りによって複雑にされた非egressed寄生虫からegressed分離することである。以前に確立された出力画面は、細胞外寄生体11から細胞を分離するビオチン化手順の面倒なシリーズに基づいていた。また、このメソッドは、弱い表現型の結果、条件付き変異体を生成しませんでした。ここで説明する方法は、宿主細胞19に付着する寄生虫を防ぐことが糖鎖のライバル、デキストラン硫酸（DS）を含めることによって寄生虫をegressingの強い愛着を克服しています。また、細胞外寄生体は、特に細胞内寄生体を残しピロリジンジチオカルバメート（PDTC）でオフに殺される20無傷。したがって、具体的に誘発される出口の欠陥で寄生虫の変異体を単離するための新たな表現型の画面で、遺伝学の力は完全に宿主細胞の出口の根底にある分子メカニズムを解明するために展開することができます。

フォワード遺伝学はどのように分子レベルで解明するための強力な方法です<em&gt;トキソプラズマ</em&gt;その宿主細胞から出力する。プロトコルは化学的に寄生虫を突然変異を起こさせるために提供され、誘導される出口の欠陥を持つ変異体を濃縮し、クローニングした変異体の表現型を検証します。

広範囲に分布し、絶対性細胞内寄生を行う原生動物寄生虫であるToxoplasma gondiiは、免疫不全患者に日和見感染症を引き起こし、また出生時の……

このビデオでは、温度感受性の脱出表現型を持つ変異体を単離するための、新しい表現型スクリーニング方法について解説します。変異原と寄生虫を、トキソプラズマに感染したヒト包皮線維芽細胞の培養物に添加します。2時間後、侵入しなかった寄生虫を除去し、フラスコを40 °Cに移して表現型の発現を誘導します。26時間後、空胞内には8〜16個の寄生虫が含まれます。次に、細胞を脱出誘導化合物で刺激します。脱出能に欠損がある変異寄生虫は細胞内に留まりますが、野生型寄生虫は培地中へ脱出します。洗浄によって野生型寄生虫を除去し、残った細胞を再び35 °Cでインキュベートして変異株集団を濃縮します。最後に、変異表現型を確認し、限界希釈法を用いて濃縮集団から単一の寄生虫クローンを分離します。生物学的吸入法などの既存の方法と比較した本手法の主な利点は、脱出変異株の特異的な濃縮効率がはるかに高いことです。私たちは、成長欠損を持つ変異体パネルから脱出変異体を特定した際に、初めてこの手法のアイディアを得ました。その変異体を用いて、野生型寄生虫と様々な比率で混合させることで、スクリーニング手順を最適化しました。本手順の実演は、私の研究室のポストドクターであるBradley Colemanが行います。この手順では、強力な変異原性化合物および液体、ならびに感染性寄生虫であるToxoplasma gondiiを使用します。白衣、二重手袋、および生物学的安全キャビネットを含む適切な保護具の使用が不可欠です。発生した液体廃棄物は、適切に処理するために個別に回収してください。まず、コンフルエントなヒト前皮線維芽細胞（HFF細胞）に、新鮮に溶解したTachyzoitesを1 mLのed one培地で接種します。次に、フラスコを5% CO2を含む37 °Cの加湿インキュベーターで18〜25時間培養します。翌日、培地を10 mLの0.1%胎児牛血清含有培地へと交換し、37 °Cで10分間インキュベートします。インキュベーション後、各フラスコにENU変異原を0、12.5、25、50、または100 µL添加します。このときの作業希釈濃度は、それぞれ1.25、2.5、および10 mMとなります。さらに、各フラスコにDMSOを最大100 µLまで添加します。37 °Cのインキュベーターで4時間インキュベートします。モノレイヤーを冷PBS 10 mLで10秒間、3回洗浄します。PBS 5 mLを加え、セルスクレーパーを用いてモノレイヤーを剥離させます。次に、強力なハサミを使用して、針が露出しないように針キャップの端を切り取ります。続いて、細胞をシリンジに移し、26.5ゲージの針を通過させます。線維芽細胞から寄生虫を物理的に除去するため、針によるパス回数を増やすことで、宿主細胞からの寄生虫の放出効率を高めることができます。3.0 µmのポリカーボネートフィルターをシリンジに取り付けます。細胞より先にニードルをシリンジに挿入し、フィルターを通してチューブへと押し出します。その後、寄生虫を血球計数器に移して計数します。この手順で最も困難な点は、寄生虫とデブリを区別することです。成功させるためには、カウントする前に寄生虫を沈殿させることが重要です。寄生虫を5分間沈殿させた後、それらをカウントします。トキソプラズマの濃度が決定したら、ED oneを用いて10 mLあたり3,333 parasites/mLに希釈します。寄生虫を33,333個用意します。HFF細胞を播種した6ウェルプレートの最初のウェルに3 mL加え、10,000個の寄生虫を接種します。その後、各ウェルから次のウェルへ300 µLずつ移し替えることで、続く3つのウェルにわたって寄生虫を10倍段階希釈します。プレートを37 °Cのインキュベーター内で7日間静置します。1週間後、培地を吸引し、各ウェルに100%エタノールを3 mL加えて15分間細胞を固定します。エタノールを除去した後、各ウェルにクリスタルバイオレット溶液を3 mL加えて15分間細胞を染色します。最後に、各ウェルを3 mLのPBSで1分間すすぎます。プレートが乾いたら、プラーク数を数え、曝露した寄生虫の生存率が30%になるように必要な変異原の濃度を選択します。歴史的に70%の致死量（killing）が用いられており、これによりゲノムあたり100個未満の点突然変異が誘導されます。手順の次のステップは、集団内のエグレス変異体を濃縮することです。集団を拡大させた後、10 mL中のコンフルエントなHFF細胞に、新鮮に溶解させたパラサイトを120,000個添加します。その後、35 °Cで2時間インキュベートします。これにより、侵入時間を制限して細胞集団を同期させます。インキュベーション後、培地を吸引し、10 mLの冷PBSで細胞を10秒間洗浄します。25 mg/mLのデキストラン硫酸を添加したEDTA含有培地を10 mL加えます。これにより、寄生虫のグリカン結合表面タンパク質が飽和し、宿主細胞への再付着および再感染ができなくなります。フラスコを40 °C、5% CO2の加湿インキュベーターで26時間インキュベートします。この間に、正常に折り畳まれたタンパク質が、温度感受性のミスフォールドタンパク質に置き換わります。翌日、選択した放出誘導剤を、25 mg/mLのデキストラン硫酸を添加した10 mLのHBSS-Ca²⁺を含む15 mLチューブ内で、使用濃度まで希釈します。これをウォーターバスに入れ、溶液を30分間予熱します。寄生虫に感染させたフラスコから培地を吸引し、あらかじめ加温した脱出誘導溶液を加えます。付属文書の指示に従い、37 °Cでインキュベートします。次に、培地を吸引し、10秒間洗浄します。10 mLの冷PBSに、25 mg/mLのdextran sulfateと50 µMのpyridine DIO carbamateを添加した10 mLのED oneを加え、35 °Cで5時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を吸引し、PBSで10秒間1回洗浄します。次に10 millilitersのEED培地を加え、フラスコを35 degree Celsiusのインキュベーターに戻します。毎日振盪して、放出された寄生虫を分散させます。寄生虫が単層を破壊するまでインキュベーションを継続します。濃縮スクリーニングから約7日後、個体群を1回継代して増殖させます。その後、エグレスアッセイによって表現型を確認します。カバーガラス上でコンフルエントに増殖させたHFF細胞を含む24ウェルプレートの各ウェルに、20,000個の寄生虫を接種し、許容温度にて培地中のすべての寄生虫が侵入できるよう、35 °Cのインキュベーターで8時間インキュベートします。次に、各ウェルを1 mLのPBSで10秒間洗浄した後、表現型を誘導し、8〜24個の寄生虫を含む空胞を増殖させるため、プレートを40 °Cのインキュベーターに移して24時間保持します。室温にて、あらかじめ加温しH-B-S-S-Cで希釈した1 mLのエグレス誘導剤を添加し、付属の書面プロトコルに記載された時間インキュベートします。培地を吸引し、各ウェルに100% methanolを1 mL加えて固定し、室温で15分間インキュベートします。その後、室温のPBS 1 mLで洗浄します。洗浄後、スライドを封入し、40〜60倍の対物レンズを備えた顕微鏡を用いて、細胞内空胞に対するSの脱出率（%）をカウントします。濃縮された脱出変異株集団の表現型を確認した後、ポリクローナルな集団をクローニングして単一の寄生虫クローンを得ます。HFF細胞のコンフルエントな単層を含む3枚の84ウェルプレートにおいて、寄生虫濃度をED one培地で1mLあたり500個に希釈した後に決定します。マルチチャンネルピペットを用いて、各ウェルの培地を40 µLのED one培地で置換します。赤、青、黄、緑で表される4つのポリクローナル集団を用います。この図のように、ピペットを用いてプレート上のクローニングを行います。希釈したミュータント1をウェルC3からC12へ、ミュータント2をウェルC13からC22へ、ミュータント3をウェルH3からH12へ、そしてミュータント4をウェルH13からH22へ、それぞれ1ウェルあたり 40 µL ずつ分注します。これにより、各ウェルの総液量は 80 µL となります。次に、マルチチャンネルピペットを使用して溶液を5回ピぺッティングし、40 µLを始点行の下の行に分注します。この2倍段階希釈を、行Hの変異体1および2、または行Nの変異体3および4まで繰り返します。最終行から余分な40 µLを廃棄します。プレートを動かさずに、35 °Cのインキュベーターで7〜10日間培養します。翌週、倒立顕微鏡の10〜20倍対物レンズを用いてウェルを確認し、単層内の穴として観察される単一プラークの有無を確認します。単一プラークが存在するウェルを変異株あたり4つ選び、寄生虫をHFF細胞がコンフルエントに増殖し、5 mLの培地で満たされたT 12.5組織培養フラスコに移します。ED one mediumを用いて、35 °Cのインキュベーター内で寄生虫を培養します。細胞外に存在する寄生虫を分散させるため、フラスコを毎日振盪してください。通常、これには7日間かかります。プラークアッセイは、さまざまな濃度のEMS変異原およびウェルあたりの異なる寄生虫数を用いて、6ウェルプレートで実施されました。本ビデオに示すように、ここに表示されているウェル内の白いスポットは、EMSで処理したプレート上のHFF単層に形成された寄生虫プラークです。これらのプラークアッセイの結果を用いて、EMSおよびENUの投与量増加に伴う寄生虫の生存曲線を作成しました。その後、70%の死滅を誘導する用量を変異導入実験に採用しました。別の実験では、濃縮後の集団における脱出変異表現型の割合を、ここに示すようにフローサイトメトリーで評価しました。脱出変異株と野生型原虫の開始比が10,000分の1の場合、濃縮によって80%の純度が達成されました。しかし、初期比率が寄生虫100,000匹に1匹であった場合、単離された集団はわずか1〜2%でした。このデータは、スクリーニングの濃縮能が1,000倍であることを示唆しています。3番目の実験では、カルシウムイオン輸送体 A23187を用いて脱出を誘導しました。これらの画像において、矢印はコントロール群でYFPを発現する4〜8匹の寄生虫を含む4つの異なるVAEを示しています。しかしながら、矢印は4つの散在した寄生虫のグループを示しており、これは4つの独立した脱出VAを反映しています。したがって、この手順に従ってカウントすることで、変異型と野生型の表現型の比率を容易に決定できます。原因となる変異、ひいては目的の遺伝子を特定するために、コズミック相補性試験や全ゲノムシーケンシングなどの追加手法を実施することが可能です。このビデオを視聴することで、目的の変異原のタイトレーション方法、トキソプラズマ原虫集団への変異原処理、およびその変異原処理集団からの個別の温度感受性脱出変異株の分離方法について十分に理解できるはずです。パラメシン耐性トキソプラズマ原虫を扱う際は非常に危険を伴う可能性があるため、この手順を行う間は常に安全ゴーグルなどの予防策を講じることを忘れないでください。

a-genetic-screen-to-isolate-toxoplasma-gondii-host-cell-egress-mutants

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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