Name: の成長結核バイオフィルム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶMycobacterium tuberculosisバイオフィルムの培養法と薬剤耐性持続菌の頻度測定法。気液界面での培養技術により、結核菌の薬剤耐性メカニズムを解明し、治療戦略の改善に貢献する。

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作品は、国立衛生研究所と米国肺協会からの財政支援を行った。

1。 Mの成長バイオフィルム250mlのスクリューキャップボトルの結核 <ol><li>メディアの準備：水900mlの中のグリセロールの60mlを、クエン酸第二鉄アンモニウムの0.05グラムのMgSO 4 KH 2 PO 4、0.5グラム、L-アスパラギン4グラム、クエン酸2gの、の0.5グラムに溶解する。 NaOHでpHを7.0に調整します。実験を始める直前に涼しいし、オートクレーブでは、最終濃度0.1％w / vのに滅菌硫酸亜鉛4を追加MC 2 7000パントテン酸要求株であるため、この株は、最終濃度10μg/mlのでパントテン酸を必要とします。 </li></ol> 注：これは、結核のために使用Sautonのメディアの標準的な組成物である。ただし、必要に応じてその他の特殊なメディアは、他のマイコバクテリア種に使用することができます。 <ol start="2"><li>接種の準備：M.グロウ 0.7の一週間で0.05％のTween-80、またはOD 600 1.0〜7H9OADCで結核 。 cuはltureは直接1:100希釈で接種物として使用することができます。 </li><li> 250mlのスクリューキャップ付きポリスチレン瓶（コーニング）にSautonのメディアの25MLを分注する。非常に緊密に培地、キャップボトルに接種の250μlのを追加し、3週間加湿37℃インキュベーターに邪魔されずにそれを置く。全く汚染がないことを確認するために毎日1回瓶を観察します。 </li><li>第三週の終わりに、Mの更なる成長を可能にするためにボトルのキャップを緩め界面での結核 。キャップがこの段階で緩んでいないされている場合、コンテナ内の不十分な酸素濃度は、細菌の更なる成長を遅らせることになります。 </li></ol> 2。 M.の成長12ウェルプレート中の結核バイオフィルム<ol><li>セクションA1とA2で説明したようにMC 2 7000のメディアと接種を準備します。 </li><li>接種の600μlでメディアの60mlを混合します。 4.5メートルディスペンスプレートの各ウェルに混合物のL。蓋付きプレートをカバーしています。パラフィルムでプレートを数回巻き付けます。 5週間37℃で加湿インキュベーター内で邪魔されずに、プレートをインキュベートします。 </li></ol> 3。 M.における薬剤耐性の永続化の頻度を決定する結核のバイオフィルム<ol><li> M.を育てるセクションBで説明したように、12ウェルフォーマットでの結核のバイオフィルムはこれが約5週間の合計になります。 </li><li>バイオフィルムが成熟された後（インキュベーションの5週間後）にピペットでマイクロチップを用いたバイオフィルムの下にメディアに所望の濃度で抗生物質の選択を注入します。 </li></ol>注：ペリクルの下にメディアのボリュームは約3.0mLまで減少します。したがって、研究者はそれに応じて薬の量を計算する必要があります。 <ol start="3"><li>スワール抗生物質を徹底的に培地中に拡散して静かになるようにプレート。統計的に有意な結果を得るためには、抗生物質を注入する4ウェルの耳。並行して、抗生物質が他の4つのウェルに溶解した溶媒と同じボリュームを注入し、手付かずのプレートの最後の4つの井戸を残す。蓋とカバープレートとプレートの周りにパラフィルムの新鮮な層を配置します。希望の期間のインキュベーターに戻します。 </li><li>インキュベーションの終わりに、プレートを開き、各ウェルに0.1％（体積/体積）の最終濃度になるようにトゥイーン-80を追加します。渦巻洗剤の均一分散のために静かにプレート全体。 15分間室温で静置します。その内容全体が均一に15mlのコニカルチューブに移すことができるので、ピペットで数回、各ウェルの内容を混ぜ合わせます。 </li><li>室温で10分間4000RPMでチューブの内容をスピンダウンする。新鮮な洗浄緩衝液（10％グリセロール、0.05％のTween-80を含むPBS）5mLのでペレットを再懸濁します。洗濯を3回繰り返します。洗浄緩衝液の5mLのでペレットを再懸濁します。 Oのためにロッカーに保管してください4でvernight℃、 </li></ol> 注意：低温は、もともとM.スメグマチスのために開発（分散時に、その成長を最小限にするため）と同様に結核のために使用されていますが、成長の遅い種が最も可能性の高い結果に影響を与えることなく、室温で揺れることができます。 BSL-3施設で作業している場合、室温でロッキングする必要がある可能性があります。 <ol start="6"><li> 、適切なサイズに、その幅広いエンドをカットするシリンジにフィットし、パラフィルムでそれをラップすることによって、マイクロチップ（2-200μlの）を装備し、滅菌注射器を準備します。先端フィット注射器からチューブの内容全体を渡して、新鮮な15mlのチューブに集める。あなたはかなり均一な懸濁液を観察するまで、このステップを5から6回繰り返します。 </li><li>各ウェル中の生存コロニーの数を決定するために7H11OADCプレート上に懸濁液およびプレート希釈液の希釈系列を準備します。 37℃インキュベーターで3週間培養する。周波数を決定する溶剤処理されたプレート上で得られたものと扱われ、抗生物質で得られたコロニー数の比を計算することにより、バイオフィルムの人口の永続化機構ち消されます。 </li></ol> 4。代表的な結果 M.の瓶で培養し、成長結核は、最初の週の終わりまでにボトルの底で見ることができます。エア·メディア·インターフェイスでの成長は第三週（図1A）の末尾に常に表示されているものの、2週目の終わりまでに、エア·メディア·インターフェイス上の細菌の斑状の成長は、見ることができます。この時点では容器の壁への細菌の付着も観察されています。この時点以降の文化の成長は主にエア·メディア·インターフェイス上で発生します。表面成長の下に液体が明確である。通常、構造体は、5週目（図1B）の終わりまでに成熟する。インキュベーションが長引く場合には、構造体は、容器の底に沈むが開始されます。興味深いことに、第三週の終わりまでキャップの締め付けは、プロセスの重要なステップであり、未知の理由のためにルーズに覆われた瓶は大幅にインターフェイス9上での成長の開始を遅らせる。 12ウェルフォーマットでは、空気媒体の界面で強固なバイオフィルムは、5週間（図2A）の最後にウェルのそれぞれで見られます。プレートは完全にラップされていない場合は、差動、バイオフィルムの成長が観察される。最悪の場合には、重要なメディアの蒸発は、細菌の増殖（図2B）を停止させることができます。したがって、プレートのラッピングは、両方の蒸発を防ぐためだけでなく、バ​​イオフィルム形成（前の段落を参照）環境を提供する必要があります。 この手法で決定バイオフィルム中の生菌数は非常に再現性がある。 M.の応答結核バイオフィルムは抗生物質の性質によって異なります。そのようなリファンピシンとして殺菌性抗生物質については、生存率の低下は、バイファに従う<html> SICの傾向9。人口の割合が小さいに関係なく、抗生物質や曝露時間の濃度の抗生物質に完全に反抗的なままにする永続的な段階に続いた最初の3〜4日の間に生存率の急激な減少。図3は、リファンピシンの50μg/mlの7日間暴露（MICの50倍）の後に成熟したバイオフィルム中の生菌数を示します。 <img alt="図1A。" src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" /> M.の図1A。早期出現インキュベーションの3週間後の細菌のエア·メディア·インターフェイス上で結核菌 。 <img alt="1Bを示しています。" src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" /> 図1Bは、Mのバイオフィルムを成熟インキュベーションの5週間後の空気·メディア·インターフェイス上で結核 。 820/3820fig2A.jpg &quot;/&gt; M.の図2A 5週齢のバイオフィルム結核は、12ウェルフォーマットで増殖させた。 <img alt="図2B。" src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" /> 図2B。パラフィルムなしで12ウェルプレートに結核菌バイオフィルムの成長に失敗した。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" /> M.における薬剤耐性の永続化の頻度を示す図3代表的なプロット結核は、12ウェルフォーマットで成長し、7日間のリファンピシン50μg/mlのにさらされたバイオフィルム。

<ol><li>Saltini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+and+diagnosis+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis.</a> Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+dispersal+and+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens.</a> Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).</li>
<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
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<li>Carter, G., Wu, M., Drummond, D. C., Bermudez, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biofilm+formation+by+clinical+isolates+of+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium.</a> J. Med. Microbiol. 52, 747-752 (2003).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+rapidly+growing+mycobacterial+species+Mycobacterium+fortuitum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum.</a> FEMS Microbiol. Lett. 168, 77-84 (1998).</li>
<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+regulation+of+mycolic+acid+cyclopropanation+in+saprophytic+mycobacteria%3A+role+of+the+Mycobacterium+smegmatis+1351+gene+%28MSMEG_1351%29+in+CIS-cyclopropanation+of+alpha-mycolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent regulation of mycolic acid cyclopropanation in saprophytic mycobacteria: role of the Mycobacterium smegmatis 1351 gene (MSMEG_1351) in CIS-cyclopropanation of alpha-mycolates.</a> J. Biol. Chem. 285, 21698-21707 (2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

結核菌の感染によって引き起こされる結核（TB）は、世界の公衆衛生にとって大きな脅威となっている。世界の人口の3分の1近くが無症候病原体に感染すると推定され、約900万の新しいケースは、結核や感染症の約170万、ダイの症状は毎年11で毎年診療所に表示されます。病気の大きな負担には、主にワクチンと六から九ヶ月にわたって投与多剤併用療法を含む非常に複雑な化学療法の不足によって寄付されます。長期化学療法は、主に抗生物質12の拡張された露出を必要と病原体の小集団の表現型の耐性に起因しています。これらの永続化機構を標的とする結核の短期かつ効果的な治療のために重要であるが、これらの永続化の発展の基礎となるメカニズムは不明である。 ほとんどの微生物の仕様その自然の生息地でESが自発的に自己の成長、表面接続された多地域は、抗生物質3から非常に寛容であるバイオフィルムと呼ばれる。最近では、いくつかのマイコバクテリア種は、薬剤耐性の永続化9,13-15の開発を促進する微小環境を提供するバイオフィル...

<table><tbody><tr><td>インキュベーター</td><td>VWR international</td><td>Model # 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン培養ボトル</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>12ウェル組織培養プレート</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>50-mL コニカルチューブ</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>ロッカール</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>クロマトグラフィー用冷蔵庫</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（一塩基性）</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸アンモニウム鉄(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-パントテン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 液体培地</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook OADC 濃縮液</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>250mL 保存ボトル</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>10mL シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>1-200&amp;mu;L ピペットチップ</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>15mL 遠心チューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>Difco Mycobacteria 7H11 寒天培地</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（二塩基性）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

の成長結核バイオフィルム

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

結核菌は、ヒト結核の病原体は、抗生物質を含む環境ストレスに対して生き残るためには並外れた能力を持っています。ただしMのストレス耐性結核は、結核の1 6ヶ月の長期化学療法への可能性が高い貢献の一つであり、病原体のこの特徴的な表現型の根底にある分子メカニズムは不明である。多くの微生物種がバイオフィルム2から4と ​​呼ばれる高度に組織化され、接続された表面、およびマトリックスカプセル化された構造に自己組織化によるストレスの多い環境で生き残るために進化してきました。コミュニティの成長は、微生物の好適な生存戦略であることが表示され、表面の付着、細胞間コミュニケーション、細胞外高分子物質の合成（EPS）5,6を制御する遺伝的要素によって実現されます。環境ストレスに対する耐性はおそらくEPSによって、おそらくphysioloによって促進されるバイオフィルム7の複雑なアーキテクチャ内で異種の微小環境に個々の菌のgical適応。 最近の一連の論文では、確立されているM.結核と結核スメグマチスは、抗結核薬イソニアジドとリファンピシン8-10 50回以上最小発育阻止濃度を許容できるバイオフィルムと呼ばれる組織的な多構造で成長する強い傾向を持っています。M.結核は、しかし、興味深いことにヘッドスペースの特定の午前9時01分比で、成熟したバイオフィルムを形成するために特定の条件を満たす必要があります。メディアのほか、大気9空気の限られた交換。特殊な環境条件の要件は、おそらくそのM.実際にリンクすることができます結核は絶対ヒト病原体であり、したがって、組織の環境に適応している。この文書では、培養M.ための方法を実証する結核ボトルや細菌などの遺伝子研究のための便利な12ウェルプレートフォーマットでのバイオフィルム。我々は、M.の弱毒株のためのプロトコルを説明した病原体9のin vivo増殖に重要である2つの遺伝子座、panCDとRD1、欠失を持つ結核、MC 2 7000、。この株は、安全に、高価なBSL-3施設の要件を回避し、結核の病原体の基礎生物学を理解するためのBSL-2の封じ込めに使用することができます。メソッドは、他の培養可能なマイコバクテリア種のバイオフィルムを成長させるために、メディアの適切な変更で、拡張することができます。 全体的に、培養抗酸菌バイオフィルムの均一なプロトコルは、マイコバクテリアの基本的な弾力性のある特性の研究に興味を持って捜査に役立ちます。さらに、成長マイコバクテリアバイオフィルムの明確かつ簡潔な方法は、臨床や製薬INVを助けるestigators潜在的な薬剤の有効性をテストします。

特定の条件下で培養すると結核菌は、薬剤耐性バイオフィルムを形成します。ここでは、培養M.ための方法を説明結核のバイオフィルムと薬剤耐性の永続化の頻度を決定する。これらのプロトコルは、M.の薬剤耐性のメカニズムにさらなる研究のために有用であろう結核 。

ヒト結核の病原体である結核菌（*Mycobacterium tuberculosis*）は、...を含む環境ストレスに対して生存する極めて高い能力を有している。

本手順の全体的な目的は、気液界面でm tuberculosisバイオフィルムを育成する方法を実証し、バイオフィルム内における薬剤耐性分画の頻度を決定することです。これは、まず適切な培地および接種液を調製することで達成されます。次のステップでは、12ウェルプレートを用いてm tuberculosisバイオフィルムを育成します。次に、目的の濃度で試験用抗菌薬を添加し、薬剤耐性パーシスターの頻度を測定します。M tuberculosisにおいて、バイオフィルムを判定することが可能です。最終的に、この手法はバイオフィルム形成の根拠を理解し、M tuberculosisにおける薬剤耐性のメカニズムを解明するのに役立てることができます。界面活性剤を含まない培地でM tuberculosisのin vitroバイオフィルム培養を行う主な利点は、基底状態の複雑な多細胞構造が自発的に形成されることで、プランクトン培養では見られないこの生物固有の特性が明らかになることです。これらには、表面への付着、細胞間相互作用、補助マトリックスの合成、およびこの構造の不均一な微小環境内における生理学的適応が含まれます。重要なことに、これらの情報は、空洞などの特定の特殊なニッチにおけるM tuberculosisの持続性の根拠を理解する上で非常に重要となります。そこでは、多細胞構造内の補助的環境において、菌の過剰な増殖が起こりやすいと考えられます。この手法の意義は、結核の治療期間の短縮にまで及びます。なぜなら、バイオフィルムに関連する因子を特定し標的とすることで、バイオフィルム内における薬剤耐性亜集団の出現頻度を減少させることができるためです。本プロトコルでは、M tuberculosisの培養に標準的な組成のsoans培地を使用します。ただし、他のマイコバクテリウム種のバイオフィルムを増殖させる場合は、それぞれの適切な専用培地を使用してください。15 mLの液体培地を入れた125 mLのプラスチックボトルを用いて、M tuberculosisの一次接種液を調製します。80の増殖の間。標準条件下で培養し、OD 600が0.7から1.0の間になるまで待ちます。これには約1週間かかります。この密度に達した培養液は、100倍希釈してそのまま接種源として使用できます。接種源を準備したら、600 µLを60 mLのsawtons mediaに加えます。接種物を培地に穏やかに混合した後、混合液を12ウェルプレートの各ウェルに4.5 millilitersずつ分注し、プレートに蓋をしてパラフィルムで数回巻き付けます。その後、プレートを37 °Cの加湿インキュベーターで培養します。5週間の静置培養後、薬剤耐性パーシスターの試験に進みます。5週間の成熟後、培地量は1ウェルあたり約3mLまで減少しており、4つのウ

growth-of-mycobacterium-tuberculosis-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

本論文では、成長の異なる方法を説明します...

共培養モデルの緑膿菌</emライブヒト気道細胞上に成長した>バイオフィルム

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微生物のバイオフィルムは、一般的に特殊化した細胞の異なる集団によって構成されています。これらの集団の単一細胞解析では、蛍光レポーターを使用する必要があります。ここでは、いくつかのsubpopulationswithinを視覚化し、監視するためのプロトコルについて説明します。...

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

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設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

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チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

このプロトコルは、ハイスループットの96ウェルペッグ蓋静的バイオフィルムスクリーニングのための自己組織化ディープウェルPCRプレート装置を使用してバイオフィルム成長およびバイオマス測定を実行する方法論を提示する。...

PCRプレートディープウェルマイクロプレートデバイスを用いた細菌バイオフィルムバイオマスの生成

このプロトコルは、ペリクルバイオフィルムを開発するための堅牢な方法を説明しています。この分析法は、さまざまな培養量に拡張可能であり、さまざまな実験目的に容易に採用できます。この分析法の設計により、いくつかのマイコバクテリア種のバイオフィルム形成能を定性的または定量的に評価することができます。...

抗菌薬耐性研究のモデルとしてのマイコバクテリアバイオフィルムの増殖

この方法論により、研究および臨床検査室での抗菌剤感受性試験のための嚢胞性線維症における多微生物バイオフィルムモデルの確立が可能になります。このモデルは、さまざまな出力に対して正確で信頼性の高い結果を提供します。...

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

この記事では、 Proteus mirabilis...

膨張顕微鏡による Proteus mirabilis バイオフィルムの超解像イメージング

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の成長結核バイオフィルム

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