Name: マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 学ぶマイクロプレートアッセイによるヒト血漿中の第V因子活性測定法。フィブリン凝固過程を動的にモニタリングし、凝固異常の診断と研究に有用な高速・高スループット手法を習得できます。

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研究はオンタリオ工科（UOIT）の大学から博士ジョンA. SAMISとイリーナ·レヴィットに保健研究保健専門学生研究賞のカナダの協会にプロフェッショナル開発と研究のスタートアップ資金でサポートされていました。著者らは、ビデオを準備する彼女の援助のためのシャノンエベレット（教育および学習センター、UOIT）を認める。作者は彼の指導、洞察力、および有用な議論博士マイケルE. Nesheim（生化学科、オンクイーンズ大学、キングストンを）認める。著者はまた、研究で使用されDIC患者プラズマを提供するための博士チェンホック桃李（ロアルド·ダールの止血および血栓症センター、ロイヤル·リヴァプール大学病院、リヴァプール、イギリス）を認める。

<ol><li>Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+factor+V+activation+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The factor V activation paradox.</a> J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).</li>
<li>Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+factor+Va+into+prothrombinase+is+required+for+coordinated+cleavage+of+prothrombin+by+factor+Xa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa.</a> J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).</li>
<li>Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+V%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Factor V.</a> Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).</li>
<li>Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+preparation+of+factor+V+deficient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma.</a> Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).</li>
<li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+V+cleavage+and+inactivation+are+temporally+associated+with+elevated+elastase+during+experimental+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis.</a> J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).</li>
<li>Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+in+factors+associated+with+neutrophil+elastase+and+coagulation+in+intensive+care+patients+with+a+biphasic+waveform+and+disseminated+intravascular+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).</li>
<li>Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+11+novel+mutations+in+patients+with+heterozygous+and+homozygous+FV+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Haemophilia%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency.</a> Haemophilia. 16, 937-942 (2010).</li>
<li>Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-sandwich+enzyme+immunoassay+for+one-step+noncompetitive+detection+of+corticosteroid+11-deoxycortisol%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol.</a> Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).</li>
<li>Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+key+metabolic+enzyme+activities+in+mammalian+cells+using+rapid+and+sensitive+microplate-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).</li>
<li>Beebe, D. P., Aronson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+fibrinolytic+assay+performed+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Res%22%5BJournal%5D)">An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates.</a> Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).</li>
<li>Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+platelet+aggregation+with+microplate+reader.+A+new+technical+approach+to+platelet+aggregation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies.</a> Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).</li>
<li>Pratt, C. W., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+coagulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Microplate coagulation assays.</a> Biotechniques. 13, 430-433 (1992).</li>
<li>Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microplate+coagulation+assay+for+Factor+V+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+J%22%5BJournal%5D)">Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma.</a> Thromb. J. 9, 11-16 (2011).</li>
<li>Toh, C. H., Downey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+future%3A+Testing+in+disseminated+intravascular+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Coagul.+Fibrinolysis%22%5BJournal%5D)">Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation.</a> Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).</li>
<li>Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disseminated+intravascular+coagulation%3A+Findings+in+346+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients.</a> Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).</li>
<li>Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoassay+of+factor+V+in+human+plasma+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets.</a> Blood. 60, 59-63 (1982).</li>
<li>Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+prothrombinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Meths.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assembly of prothrombinase complex.</a> Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).</li>
<li>Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+TAFI%2C+a+thrombin-activable+fibrinolysis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor.</a> J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).</li>
<li>Mammen, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disseminated+intravascular+coagulation+%28DIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Sci%22%5BJournal%5D)">Disseminated intravascular coagulation (DIC).</a> Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).</li>
<li>Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+thrombophilia+due+to+a+previously+unrecognized+mechanism+characterized+by+poor+anticoagulant+response+to+activated+protein+C%3A+prediction+of+a+cofactor+to+activated+protein+C%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C.</a> PNAS. 90, 1004-108 (1993).</li>
<li>Dahlbäck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+pathogenic+mechanisms+of+thrombophilic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders.</a> Blood. 112, 19-27 (2008).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

カイネティックマイクロプレートアッセイ法は、安価、迅速、小説の展開について概説、およびFv凝固活性を測定するための便利な手法ではない持っているヒト血漿の試料（FV 1段階アッセイ）で、または意図的に添加トロンビン（FVで活性化されている2段アッセイ）。アッセイは、キネティックマイクロプレートリーダーを利用し、必要なすべての材料および試薬は市販されているか、社内で行うことができる。アッセイは、継続的に405nmのフィブリン塊形成時のプラズマの光散乱の変化をモニタします。マイクロプレートアッセイは、小さな血漿サンプルボリューム（μl）を使用することの利点を持っており、同時に複数のサンプル（最大12）の分析のために適している。高価な機器や試薬は（自動分析および因子欠損プラズマ）を使用している場合は、これらのアッセイの属性が有利であり、わずかなサンプル量が利用可能です（患者プラズマ）またはFV浄化fの間に多数のサンプルを（分析ROMプラズマ）。 FVマイクロプレートアッセイは、高速、便利であることが追加された利点を持っており、必要な構成成分の単離·精製を必要としません。マニュアルチルトチューブ3、4と報告されている自動化された5月7日 、FVアッセイと比較して、FVマイクロプレートアッセイでは、血栓倍の匹敵する有用な範囲（25から75秒）と、試料中の対応するFVレベル（0.5から0.005単位を持っている/ ml）を加え、感度/検出限界（20〜80pM）。血栓形成3、4の主観的な視覚的評価に苦しむマニュアルチルトチューブFVアッセイと比較して、FVマイクロプレートアッセイでは、凝固時間の客観的かつ定量的な測定は、初期速度、およびフィブリンクロット形成の程度を可能にします。 5月7日高価な分析器と試薬の要件に苦しむ自動FVアッセイと比較して、FVマイクロプレートアッセイ試薬および材料は、安価であり、必要なすべての材料がpurchaかもしれません市販sedや社内で行われた。マニュアルチルトチューブ3、図4および5月7日自動FVアッセイは、一般のみ血栓形成のための時間を提供し、時間ではなく、初速度、およびすべての正確FVマイクロプレートアッセイに分光光度計で測定され、フィブリン塊形成の程度。最後に、3,4チルトチューブ、手動および自動の5から7のFVアッセイは血漿検体ずつではFV活性を測定することができるという苦しむ; FVマイクロプレートアッセイ、ハイスループットに従順であり、12のサンプルは、かもしれないのに対し、同時にアッセイ。 マイクロプレートアッセイは9 DIC患者プラズマにおけるFVは遅れのため凝固時間とFV 1段アッセイにおける血栓形成の低い初期レートの組み合わせのNHPに比べて活性が低かったことを証明するために使用されていました。 DIC患者プラズマにおけるFV 2段アッセイにおける血栓形成の初期のレートはNHPから変更されていませんでした。 DIC patienにおける血栓形成のエクステントトンプラズマはまた、FV 1段と2段のアッセイでNHPから変更されていませんでした。減少し、FV 1段、2段、合計活動はこの買収血液疾患の病態時に他の研究に応じて増加FV消費19および/ ​​または不活化6に起因している可能性があります。 NHPで観察されたように、DICプラズマにおける血栓形成の程度を考えると同じだった、この変数には、最も可能性の高い患者プラズマの特性に関連し、FV欠乏血漿およびnot inフィブリノーゲン濃度の結果であった。 マイクロプレートアッセイからの結果は、ヒト血漿試料中のFV活性の測定は、時間とFV 1段アッセイとFV 2からの血栓形成および総活性の時から血栓形成の初期速度から得ることができることが示された - 段階アッセイ。これは、tの血栓形成の程度に基づいて、血漿試料中のFV活性の定量的な測定値を得ることができませんでした彼FV 1 - および2段アッセイまたはFV 2段アッセイにおける血栓形成の初期速度。約0.35の血栓形成の同程度に達し、すべての反応を考えると - トロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後、初期吸光度の間に0.45ユニットの前と最大の吸光度を、血栓形成の程度の測定がでFV活動の定量的評価を提供していません血漿試料を与えられた。 小説マイクロプレートアッセイは、ヒトおよび動物の血漿からの精製過程でヒト血漿と分数のサンプルではFV活性の測定のための研究と臨床の現場で使用されています。マイクロプレートアッセイは、時間、初期速度、及び血栓形成の程度を測定するために使用されるかもしれません。パラメータは、通常、手動チルトチューブアッセイおよび自動血液凝固分析器で同時に監視されません。この情報は、血栓形成イベント中にFVの関与を完全に定量的評価の多くを提供していますヒト血漿中には、以前よりも3-7を報告されている。血漿のサンプルにおいてまたは精製FVまたはFVAとFV活性の有意な変化を測定する際に、この情報は、研究と臨床検査室の両方で特に重要です。 FVマイクロプレートアッセイはまた、特徴づけ、測定FVおよびFVAをアクティブまたは非アクティブにすることができる化合物を、静脈血栓症のリスクがある患者では、FV活性を測定FVライデン変異の結果として、20、21との活動を監視するために使用されるかもしれませんプラズマからの精製中FV。 FVマイクロプレートアッセイは、適切な因子欠乏血漿を使用していて、フィブリン形成のための試薬を開始する外因性、内因性、または共通の経路に任意の凝固因子の活性を測定することは容易に適応可能である。アッセイは、研究と臨床の研究室で、その活動をより正確かつ完全な測定を通して、FV生化学の我々の理解を増加します。究極のLYは、この情報は積極的に早期診断やDICなど凝固障害、に苦しんで個人のためのより効果的な治療法の開発を通じて医療環境に影響を与えるでしょう。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>キネティックマイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td>スペクトラマックス190 </td><td> SOFTMAX PRO 4.3 LSのソフトウェア</td></tr><tr><td>通常のプールしたヒト標準血漿</td><td>精密バイオ</td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTAを</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-欠乏ヒト血漿4 </td><td></td><td></td><td>新鮮なヒト血漿から作られており、-70℃でアリコートに格納℃の</td></tr><tr><td> 3と60mLシリンジ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309585と136898 </td><td></td></tr><tr><td>バタフライ装置</td><td>バキュテイナー</td><td> 367251 </td><td> 20ゲージ</td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フィッシャー</td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td>トロンボプラスチン</td><td>トリニティバイオテック</td><td> T1106 </td><td>透析した対HBS、pHは7.4、-70℃でアリコートに格納℃、 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトトロンビン15 </td><td></td><td></td><td>ヒト血漿から、50％で-20℃（v / v）グリセロールで保存した。 </td></tr><tr><td>透析膜</td><td>フィッシャー</td><td> 21-152-6 </td><td> 6 8kDaの分子量カットオフ; 50ミリメートル×3mの。 </td></tr><tr><td>テンプレートホルダーと取り外し可能な8ウェルストリップ。 </td><td>ヌンク</td><td> 14-245-63と469957 </td><td></td></tr><tr><td> ELISAの洗浄トレー</td><td> BioRad社</td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ml微量と15mlのスクリューキャップチューブ。 </td><td>ザルスタット</td><td> 72690と62554205 </td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 2703630 </td><td> 8チャンネルモデル。 </td></tr></tbody></table>

マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第v因子活性の測定

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

損傷に応答して、血液凝固が活性化され、凝固プロテアーゼ、トロンビンの生成をもたらす。トロンビンは、出血を停止不溶性血餅を形成するフィブリンにフィブリノゲンを切断する。その活性化された形態、FVA、でV因子（FV）はナーゼ 1、2の一部としてフィブリン塊形成時のトロンビン生成のプロテアーゼFXaおよびアクセラレータのための重要な補因子である。マニュアルのFVアッセイは3、4に記載されているが、彼 ​​らは時間を要し、主観的である。自動化されたFVアッセイは5-7報告されていますが、アナライザおよび試薬は高価であり、一般的に凝固時間ではなく、フィブリン形成の速度と程度を提供してきた。マイクロプラットフォームがあるため利便性の酵素触媒イベントを測定するために好まれる、時間、コスト、小音量、継続的監視、9、8、高スループット。マイクロプレートアッセイは、血栓溶解10、血小板凝集のために報告されている11、および凝固因子12ではなく、ヒト血漿中のFV活性のために。メソッドの目的は、ヒト血漿中のフィブリン形成時のFV活性を測定マイクロプレートアッセイを開発することでした。 この小説マイクロプレート法は、ヒト血漿中のFV活性の、シンプルで安価、かつ迅速な分析方法を概説します。アッセイは、ヒト血漿中のフィブリン形成（ 図1）は、13時の405nmの吸光度変化を監視するために運動をマイクロプレートリーダーを利用しています。アッセイは、正確時刻、初速度、およびフィブリンクロット形成の程度を測定します。これは、プラズマの唯一の添加量が必要で6分で完了し、高スループットであり、24 80pM FVに敏感であり、意図せずに活性化量（1段活性）とトロンビン活性化FV（2段活性を測定1段活動） - ）は、その合計機能活性（2段活動の完全な評価を得ることができる。 播種intravascular凝固症候群（DIC）が最も多く、既存の感染症14から発達取得凝固障害である。 DICは、既存の病理15上記の予後不良と増加の死亡率に関連付けられています。アッセイは、DIC、FV 1段、2段、合計活動患者9例で、通常のプールされたヒトと比較して、それぞれ、54％、44％、42％、平均的には、減少していたことを示すために使用されました参照血漿（NHP）。 FVマイクロプレートアッセイは、どの凝固因子の活性を測定することは容易に適応可能である。このアッセイは、研究と臨床の現場での活動をより正確かつ完全な測定を通して、FV生化学の我々の理解を増加します。この情報は、積極的に早期診断やDICなど凝固障害、のためのより効果的な治療法の開発を通じて医療環境に影響を与えるでしょう。

代表的な結果 - FV 1段マイクロ凝固アッセイアクティビティ標準曲線の作製マイクロプレートリーダーを用いて生成された時間以上のFVアッセイにおけるフィブリン血栓形成の代表的な例を図1に示します。 FVアッセイは、正確時刻、初速度、およびフィブリンクロット形成の程度を測定します。アッセイの終了時に井戸の検査は血栓形成が起きていることを確認した。以前に開始された吸光度とトロンボプラスチン及び塩化カルシウムを添加した後の最大吸光度の間に0.45単位 - 全ての反応は0.35の405nmでの吸光度の一般的な変化に伴う血栓形成とほぼ同じ程度に達した。 FVの代表的な例としては、1段ログクロット時間の活動の標準曲線（秒単位）とログのFV活性（単位/ ml）と血栓形成の初期速度をログに記録する（mUnits /分）とログのFV活性（単位/ ml NHPの連続希釈用）は、以下の例で示され<stronそれぞれグラム&gt;図2Aおよび図2B、。 FV対凝固時間のlog-logプロットをフィット1-活性（ 図2A、R 2 = 0.980）線形回帰分析の後に、これらの変数の間に強い関係を示した。 FV活動対血栓形成の初期速度のlog-logプロットをフィッティングすることも（であり、R 2 = 0.983 図2B）線形回帰分析した後、これらの変数の間に強い関係を示した。両方のログ餅時間の関係と初期血栓形成のレート対ログFVのアクティビティをログには、512倍まで希釈NHPに対してリニアに推移しました。 FVは約12-40nmの16でNHPに循環するので、マイクロプレートアッセイはNHPで約24 80pM FVに敏感です。 ナーゼでFVA-FXA-脂質の相互作用の解離定数は約1nmの17であることを考えると、FVマイクロプレートアッセイは、生理学的にrelevanでFVレベルの測定のために完全に適していますナーゼでFVA関数のtのnM範囲。 FVマイクロプレートアッセイを使用して、それはまた、15人の健康な対照プラズマのFV 1段活性アッセイ（男性と女性、年齢18-20yrs）でFV活動の正常範囲（平均値±標準偏差、範囲）であったことが判明した： 0.96±0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml。これはカトラーらによって報告され、通常の健康なFVの活動および範囲（0.66-1.14U/ml）とよく一致している。自動分析装置7で決定FV 1段活性のために。時間のアッセイ内変動性、範囲、および8つの異なる日に6ウェル内のFV 1段階アッセイにおける血栓形成の初期速度は、それぞれ3.4％、4.4％、および3.1％であった。時間のアッセイ間変動性、範囲、および8つの異なる日には8つの異なる実験の6ウェル内のFV 1段階アッセイにおける血栓形成の初期速度は、それぞれ7.1％、7.8％、および9.2％であった。したがって、これら3 measuのイントラ及びアッセイ間変動性赤変数（最大12）内と、同時に複数のサンプルのマイクロプレートアッセイの間に強固なアッセイ性能は低く、許容できるレベルであった。 代表的な結果 - FV 1段と2段のマイクロ凝固アッセイによるヒト血漿サンプルをアッセイログ餅時間とログのFV活性の標準曲線（ 図2A）を意図的に添加されたトロンビン（FV 1段活性）により活性化されていなかったか、意図的に活性化したNHPと9 DIC患者プラズマ中のFV活性を測定するために使用されたトロンビン（FV 2段活性）を追加し、結果を表1に示す。全9 DIC患者プラズマは、FV 1ステージ活動およびNHPから、それぞれ、54％、18％、平均で減少した血栓形成の初期速度を示した。 DIC患者におけるFV 1段階アッセイにおける血栓形成のエクステントがNHPと大きく異なっていなかった、とNHPから13％、平均で増加した。 <html>トロンビンとNHPのアクティベーションは、FVで約8倍に増加して生成されたFV 1段階の活動（表1）上記2段活動。これはNHPでFVはその活性化されていない形で主に存在していたと5-7マニュアルチルトチューブFVアッセイ3,4、および自動FVアッセイを使用して以前に報告された結果と一致することを示しています。 FV 2段、総活性はまた、NHPから、それぞれ、44％および42％、平均でDIC患者で減少した。 DIC患者におけるFV 2段アッセイにおける血栓形成の初期速度、エクステントはNHPで観察されたものから、それぞれ、NHPから有意差は認められなかったと、約9％と4％で、平均的に変化した。これらの結果は、NHPでFVと比べて、DIC患者プラズマにおけるFVは長時間をもたらし、フィブリン塊形成の速度を低下させ、患者FVは同様にトロンビンで活性化可能なように、平均でわずか56％であったことが示された。 ENT &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot; always &quot;を&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="図1" /> 図1運動マイクロFV 1段階凝固アッセイを用いて測定し、通常のプールされたヒト標準血漿における血栓形成。 NHPにおけるフィブリン血栓形成を連続キネティックマイクロプレートリーダーを用いて405nmでモニターした。プロットはウェルマイクロプレートでFV欠乏血漿、トロンボプラスチン、塩化カルシウム、32倍希釈したNHPの6分間反応のマイクロプレートリーダーの出力です。縦軸は、血漿中のフィブリン形成の結果として発生した波長405nmにおける吸光度の変化を表しています。フィブリン形成の時間は吸光度や曲線の中点（36.40秒）の半分の最大増加に達するまでの時間として定義されていました。血栓形成の初期速度は曲線（611.88 mUnits /分）の吸光度の部分の線形増加の最初の5つの時点にわたって405nmでの吸光度の変化率と定義した。前の血栓形成のテントは405 nm（0.35単位）での最大値と最小値の吸光度の差として定義されていました。 <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：時間とFV 1段マイクロプレートアッセイを使用して、通常のプールされたヒト標準血漿における血栓形成対V因子活性の初期速度の標準曲線。 NHPは連続的に希釈した（0から512倍までHBS中）され、プロトコルで説明したように、FV 1段マイクロプレートアッセイでアッセイ。 FV 1段マイクロプレートアッセイにおける血栓形成対FV活動の時間と初期速度のlog-logプロットはそれぞれ、パネルAおよびBのデータの線形回帰モデルの後に表示されています。 <table border="1"><tbody><tr><td> サンプル </td><td> 1段アッセイ活性（単位/ ml） </td><td> 1段アッセイ範囲（単位） </td><tD&gt; 1段検定初速度（mUnits /分） </td><td> 2段検定アクティビティ（単位/ ml） </td><td> 2段アッセイ範囲（単位） </td><td> 2段検定初速度（mUnits /分） </td><td> 総活性（単位/ ml） </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1.02 </td><td> 0.363 </td><td> 744.96 </td><td> 7.93 </td><td> 0.433 </td><td> 375.84 </td><td> 6.91 </td></tr><tr><td> 患者1 </td><td> 0.36 </td><td> 0.404 </td><td> 583.80 </td><td> 3.84 </td><td> 0.432 </td><td> 249.96 </td><td> 3.48 </td></tr><tr><td> 患者2 </td><td> 0.67 </td><td> 0.416 </td><td> 704.04 </td><td> 5.28 </td><td> 0.469 </td><td> 323.16 </td><td> 4.61 </td></tr><tr><td><strong&gt;患者3 </td><td> 0.31 </td><td> 0.435 </td><td> 562.08 </td><td> 3.92 </td><td> 0.453 </td><td> 294.96 </td><td> 3.61 </td></tr><tr><td> 患者4 </td><td> 0.39 </td><td> 0.435 </td><td> 617.04 </td><td> 4.14 </td><td> 0.462 </td><td> 372.60 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> 患者5 </td><td> 0.73 </td><td> 0.401 </td><td> 641.40 </td><td> 5.91 </td><td> 0.433 </td><td> 354.24 </td><td> 5.18 </td></tr><tr><td> 患者6 </td><td> 0.45 </td><td> 0.403 </td><td> 600.72 </td><td> 4.16 </td><td> 0.445 </td><td> 393.96 </td><td> 3.71 </td></tr><tr><td> 患者7 </td><td> 0.49 </td><td> 0.395 </td><td> 575.40 </td><td> 4.89 </td><td> 0.449 </td><td> 357.48 </td><td> 4.40 </td></tr><tr><td> 患者8 </td><td> 0.19 </td><td> 0.448 </td><td> 489.00 </td><td> 2.89 </td><td> 0.450 </td><td> 330.48 </td><td> 2.70 </td></tr><tr><td> 患者9 </td><td> 0.64 </td><td> 0.423 </td><td> 699.48 </td><td> 5.11 </td><td> 0.455 </td><td> 417.24 </td><td> 4.47 </td></tr></tbody></table> 表1 NHPと播種性血管内凝固症候群（DIC）を開発9患者におけるFVの活動。FV 1段、2段、およびNHPと9 DIC患者プラズマの総活性は、FV 1段マイクロプレートアッセイ標準から決定した血栓形成対FV活動の時間の曲線（ 図2A）と単位/ mlで与えられる。初期速度（mUnits /分の最初の5つの時間点以上A405nmの増加の初期速度）およびエクステント（最大A405nm - 最小A40FV 1における血栓形成の5nmの） - および2段マイクロプレートアッセイも示されている。

この研究では、以前に報告されていないヒト血漿中のフィブリンクロット形成の間のFV凝固活性を測定した新規マイクロプレートアッセイを説明しています。この方法は、継続的にヒト血漿中のフィブリン塊形成時の405nmでの吸光度の変化を測定するために運動をマイクロプレートリーダーを使用しています。

マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

損傷に反応して血液凝固が活性化され、凝固プロテアーゼであるトロンビンが生成されます。トロンビンはフィブリノゲンを切断してフィブリンへと変化させます...

本手順の全体的な目的は、ヒト血漿中でのフィブリン血栓形成時における凝固タンパク質である第V因子の活性を測定するマイクロプレートアッセイを開発することでした。損傷に反応して血液凝固プロセスが活性化されると、一連のザイモゲンからプロテアーゼへの変換反応が起こり、最終的に凝固酵素であるトロンビンが生成されます。トロンビンは可溶性フィブリノゲンをフィブリンモノマーに切断し、それらが結合して不溶性のフィブリン血栓を形成します。通常、健康な状態または損傷のない状態では、血液は自由に流動する液体として維持されており、形成されるフィブリンの量は、分解または消失するフィブリンの量と等しくなります。しかしながら、特定の疾患においては、凝固が過剰になると心疾患や脳卒中を招き、一方で凝固が不十分な場合は出血傾向を招き、これは血友病でよく見られます。第V因子は血漿中のタンパク質であり、活性化形態である第Va因子は、プロトロンビナーゼ複合体の一部として、フィブリン血栓形成時のトロンビン生成を強力に促進します。プロトロンビナーゼは、プロテアーゼである第Xa因子、コファクターである第Va因子、脂質表面、およびカルシウムの4つの成分で構成されています。膜結合性の第Va因子は、基質であるプロトロンビンに対する第Xa因子の触媒効率（kcat）を約3000倍に向上させ、これによりトロンビン生成とフィブリン血栓形成を大幅に促進します。マイクロプレートプラットフォームは、利便性、時間コスト、少量のサンプル量、連続モニタリング、およびハイスループットであることから、酵素触媒反応の測定に好適です。フィブリン血栓の形成過程は、血漿がフィブリン血栓のない透明な黄色で光吸収が最小の状態から、フィブリン血栓を伴う不透明な白濁状態で光吸収が最大の状態へと変化する際の光吸収度の増加をマイクロプレートリーダーで測定することで、モニタリングが可能です。手動の傾斜管法や自動分析機を用いた測定などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、迅速で低コストであり、必要サンプル量が少なく、ハイスループットであることです。このアッセイでは、不随意に活性化された第V因子およびトロンビンによって活性化された第V因子の活性を測定し、その総機能活性を完全に定量的に評価します。この手法の実演は、研究室の修士課程学生であるDerek Tilleyが行います。血漿サンプル中の第V因子活性を測定するには、定義上1 mLあたり1ユニットの第V因子活性を含む正常ヒト血漿（NHP）を標準物質として用い、パネルAではフィブリン凝固形成時間、パネルBではフィブリン凝固形成の初期速度について、第V因子の1段階活性標準曲線を作成する必要があります。第V因子欠損血漿、正常ヒト血漿、未知のサンプル血漿、およびトロンボプラスチンを37°Cで10分間解凍します。第V因子欠損血漿とトロンボプラスチンを穏やかに混ぜ合わせ、別々のプラスチック製洗浄トレーに移し、氷上でインキュベートします。正常ヒト血漿と未知のサンプル血漿は、穏やかに混ぜ合わせた後、氷上で保存します。第V因子の1段階活性標準曲線に使用する25 mM 塩化カルシウム蒸留水溶液は、別の洗浄トレーに入れ、室温で保存します。1.5 mlマイクロ遠心チューブを用い、HBS pH 7.4を使用して、正常ヒト血漿を0、2、4、8、16、32、64、128、256、および512倍の2倍段階希釈し、それぞれ200 µLずつ調製します。十分にボルテックスし、氷上で静置します。血漿未知検体については、1.5 mlマイクロ遠心チューブを用い、HBS pH 7.4で正常ヒト血漿および未知試料血漿を40倍に希釈し、それぞれ200 µLずつ調製します。5本のマイクロウェルストリップをマイクロプレートリーダーのテンプレートホルダーに設置します。マイクロプレートリーダーの電源を入れ、Softmax Proマイクロプレートアプリケーションソフトウェアを起動します。マルチチャンネルピペットを用いて、すべてのサンプルマイクロプレートウェルに50 µLの第V因子欠乏血漿を同時に添加します。単一のピペットを用いて、調製した正常ヒト血漿の10倍段階希釈液、正常ヒト血漿の40倍希釈液、および未知のサンプル血漿の40倍希釈液を、それぞれ別のマイクロプレートウェルに50 µLずつ添加します。マルチチャンネルピペットを用いて、すべてのサンプルウェルに50 µLのトロンボプラスチンを添加します。マイクロプレートリーダー内で25 °Cで1分間インキュベートし、そのうち15〜25秒間は振盪を行います。MICROPLATEリーダーに接続されたコンピュータを使用して、Softmax Pro Microplateアプリケーションソフトウェアを起動します。Microplateリーダーの吸光波長を405 nmに、キネティック温度を25 °Cに設定し、塩化カルシウム添加後の最初の5秒間は振盪するようにプログラムし、その後6分間、5秒ごとに405 nmの吸光度を測定するように設定します。なお、算出される凝固時間には、この5秒間の振盪間隔は含まれません。2本のマルチチャンネルピペットを同時に使用して、サンプルが入った2枚のマイクロプレートストリップに塩化カルシウムを50 µLずつ加えます。15秒間待機し、すぐにコンピューターのSoftmax Proにあるスタートアイコンを押してアッセイを開始します。分析した各血漿サンプルについて、凝固形成時間を決定し、吸光度の増加が最大値の半分に達するまでの時間を秒数で定義します。凝固形成の初期速度は、時間に対する吸光度増加の線形部分における最初の5つの時間ポイントにおける吸光度増加率として定義されます。凝固の程度は、測定終了時の凝固過程において得られた最大吸光度と最小吸光度の差として定義されます。Softmax Proの吸光度対時間プロファイルを用いて、正常ヒト血漿の連続希釈における凝固時間、初期速度、および凝固の程度を決定してください。第V因子ワンステージ活性標準曲線を作成するには、40倍希釈した正常ヒト血漿および未知のサンプル血漿の凝固時間を用い、第V因子ワンステージ活性標準曲線から第V因子活性をunits per mLで補間します。これは、トロンビンによる意図的な活性化を行わない、第V因子の一段階活性を示しています。これは、マイクロプレートリーダーを用いて測定した、第V因子アッセイにおけるフィブリン凝固形成の経時的な代表例です。このプロファイルは、単一のマイクロプレート内で32倍に希釈した正常ヒト血漿を用いてフィブリン凝固を形成させた結果を示しています。縦軸は、フィブリン凝固の結果として生じた 405 nanometers における吸光度の変化を示しています。凝固時間は、吸光度対時間の曲線のの中点として算出され、36.4 seconds でした。凝固の初期速度は 611.88 milli units per minute と算出されました。白濁形成の程度は0.35ユニットとして算出されました。ファクターファイブアッセイにより、初期速度および白濁形成の程度を正確に測定できます。アッセイ完了後にウェルを確認したところ、凝固形成が起こっていることが確認されました。すべての反応において、血栓形成および塩化カルシウム添加前の開始吸光度と、その後の最大吸光度の差（405ナノメートルにおける吸光度の変化量）が0.35から0.45ユニットの間であり、ほぼ同程度の凝固形成度に達しました。正常ヒト血漿における第V因子の一段階活性の代表例として、凝固時間（秒）に対する第V因子活性（units/mL）の標準曲線および、第V因子活性（units/mL）に対する凝固形成初期速度（milli units/分）が、それぞれパネルAとパネルBに示されています。第V因子は通常、トロンビンによって活性化されます。活性化共因子である第V因子Aを測定するため、トロンビンを添加しインキュベーションした後の2回目のアッセイが、血漿サンプルの第V因子2段階活性を正確に測定するために不可欠です。第V因子2段階アッセイ用のトロンビンによる意図的な活性化について、HBS pH 7.4中で最終濃度100 nMの精製トロンビンを200～300 µL調製し、氷上でインキュベーションします。上記の結果得られた正常ヒト血漿およびサンプル血漿120 µLを、2.8 mMを含むHBS pH 7.4の170 µLで40倍から100倍に希釈します。塩化カルシウム。各サンプルに、最終濃度が10 nanomolarになるようにthrombinを10 µL加える。ボルテックスミキサーで混和し、37 °Cで1分間インキュベートする。正常ヒト血漿およびサンプル血漿にHBS pH 7.4を400 µL加え、500倍に希釈する。SoftMax Proにおける吸光度対時間のプロファイルから、各未知試料血漿の正常ヒト血漿における凝固時間を決定します。500倍希釈を考慮し、各試料の凝固時間を用いて、凝固時間対活性の第V因子1段階標準曲線から第V因子2段階活性を算出します。これは、第V因子の2段階活性、すなわちトロンビンによる意図的な活性化を伴う活性を表します。全第V因子活性は、第V因子2段階活性から第V因子1段階活性を差し引くことで算出できます。対数凝固時間対対数第V因子活性の標準曲線を用いて、正常ヒト血漿および播種性血管内凝固症候群（DIC）患者9名の血漿中の第V因子活性を測定しました。DIC患者9名全員において、第V因子1段階活性および凝固形成の初期速度が、平均でそれぞれ54%および18%低下していました。また、DIC患者における第V因子2段階活性および全活性は、正常ヒト血漿と比較して平均で44%および42%低下していました。第V因子欠乏症およびDIC患者では、線維素血栓の形成時間が延長し、形成速度が低下するという結果になりました。このビデオを視聴することで、この方法を研究室でどのように実施すべきかについて十分な理解が得られるはずです。この方法は、血漿中のあらゆる凝固因子の活性測定に容易に適応させることができ、幅広い研究および臨床応用に適しています。最終的に、この第V因子に関する情報は、DICなどの血栓性または出血性疾患の早期診断および治療を通じて、医療現場に好影響を与えることになります。

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