マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

次の手順の全体的な目標は、ヒト血漿中のフィブリン血栓の形成中の凝固タンパク質第V因子の活性を測定するマイクロプレートアッセイを開発することでした。傷害に応答して、血液凝固プロセスが活性化され、最終的に凝固酵素トロンビン、トロンビンクリーブス可溶性フィブリノーゲンをフィブリンモノマーに生成する一連のキシモーゲンからプロテアーゼへの変換反応が起こり、その後、不溶性フィブリン塊を形成するために会合します。通常、健康な状態または損傷していない状態では、血液は自由に流れる液体として残り、形成されるフィブリンの量は、分解または分解されたフィブリンの量と等しくなります。

しかし、特定の疾患の状況では、凝固が多すぎると心臓病や脳卒中につながるのに対し、凝固が少なすぎると出血傾向が生じます。これは血友病によく見られます。第V因子は、その活性化された形態のファクター5Aがプロトロンビン酵素複合体の一部としてフィブリン血栓形成中のトロンビン生成の重要な促進剤である血漿中のタンパク質であり、プロトロンビンは第10A因子、プロテアーゼ第5A因子、補因子脂質、表面およびカルシウムの4つの成分で構成されています。メリン因子5Aは、その基質プロトロンビンに対する因子10Aの触媒効率またはkcatを約3000倍増加させ、それによりトロンビン生成とフィブリン血栓形成を大幅に強化します。

マイクロプレートプラットフォームは、利便性、時間コスト、少量のサンプル、継続的なモニタリング、および高いスループットにより、酵素触媒イベントの測定に適しています。フィブリン血栓形成イベントは、フィブリン塊が存在せず、光吸収率が最小の透明な黄色の外観から、フィブリン塊と最大の光吸収率を伴う不透明な曇った外観に変化する血漿の光吸収率の増加を測定することにより、マイクロプレートリーダーで監視できます。この手法は、手動チルトチューブアッセイや自動分析装置によるアッセイなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、この方法が高速で安価で、必要なサンプル量が少なく、スループットが高いことです。

このアッセイは、意図せずに活性化された因子およびトロンビン活性化された第5因子の活性を測定し、その総機能活性の完全な定量的評価を取得します。その技術を実演するのは、研究室の修士課程の学生であるデレク・ティリーです。血漿サンプル中の第5因子活性を測定するためには、第5因子1段階活性、パネルAでのフィブリン血栓形成時間の標準曲線、およびパネルBでのフィブリン血栓形成の初期速度を構築する必要があります。これは、定義上、MLあたり1ユニットの第5因子活性を含む標準として、第5因子欠損血漿を解凍します。 正常なヒト血漿、およびサンプル血漿未知数およびトロンボプラスチンを37度で10分間。

因子5の欠損血漿および血栓形成術トランスファーを穏やかに混合し、別々のプラスチック洗浄トレイに交換し、氷上でインキュベートします。正常なヒト血漿とサンプル血漿未知を氷上に保存した後、穏やかに混合します。塩化カルシウム25ミリモルを蒸留水で保管し、ファクターファイブ1ステージ活動標準曲線の室温で別の洗浄トレイ

1.5 mLのマイクロ遠心チューブを使用して、HBS pH 7.4で0 2 4 8 16 32 64、1 28、2 56、および512倍から正常なヒト血漿の2倍連続希釈をそれぞれ200マイクロリットル調製し、ボルテックスウェルでボルテックスし、氷上でインキュベートします。血漿サンプル未知については、1.5 mLのマイクロ遠心チューブを使用して、HBS pH 7.4の正常なヒト血漿と未知サンプル血漿の40倍希釈液をそれぞれ200マイクロリットル調製します。5つのマイクロウェルストリップをマイクロプレートリーダーのテンプレートホルダーに入れます。

マイクロプレートリーダーをオンにし、マルチチャンネルピペットを使用してSoftmax Proマイクロプレートアプリケーションソフトウェアにアクセスします。1本のピペットを使用して、すべてのサンプルマイクロプレートウェルに50マイクロリットルのファクター5欠損血漿を同時に追加し、準備した正常なヒト血漿の10段階希釈の50マイクロリットルと正常なヒト血漿およびサンプル血漿未知の40倍希釈をマルチチャネルピペットを使用して別々のマイクロプレートウェルに追加し、すべてのサンプルウェルに50マイクロリットルの血栓形成術を追加します。マイクロプレートリーダーで摂氏25度のマイクロプレートリーダーで1分間インキュベートし、1分間のインキュベーションのうち15〜25秒間に振とうします。

MICROPLATEリーダーとインターフェースされたコンピューターを使用して、Softmax Proマイクロプレートアプリケーションソフトウェアにアクセスします。マイクロプレートリーダーを吸光度波長を405ナノメートルモードに設定し、動態温度を摂氏25度に設定し、塩化カルシウム添加後最初の5秒間はマイクロプレートリーダーを振とうするようにプログラムし、5秒ごとに405ナノメートルの吸光度を6分間測定します。その後、5秒間の振とう間隔は、2つのマルチチャンネルピペットを使用して計算された血栓時間に含まれず、サンプルを含む2つのマイクロプレートストリップに50マイクロリットルの塩化カルシウムを同時に加えます。

15秒待ってから、すぐにコンピューターからSoftmax Proのスタートアイコンを押して、アッセイを開始します。分析された各血漿サンプルについて、血栓形成の時間が決定され、吸光度の半値の最大増加に達するまでの秒単位の時間として定義されます。血栓形成の初期速度は、時間に対する吸収率の増加の線形部分の最初の5つの時点における吸光度の増加率として定義されます。

血栓形成の程度は、ラン終了時の血栓形成イベント中に達成される最大吸収率と最小吸収率の差として定義されます。Softmax ProのABSORBENCE対時間プロファイルを使用して、正常なヒト血漿の段階希釈の血栓形成の時間、初期速度、および程度を決定します。因子Vの1段階の活動標準曲線を構築するには、40倍に希釈された正常なヒト血漿とサンプル血漿未知数の血餅時間を使用して、因子5の1段階の活動標準曲線からミルあたりの単位で因子5の活性を補間します。

これは、因子5、1段階の活動、またはトロンビンによる意図的な活性化なしの活動を表しています。これは、マイクロプレートリーダーによって生成された第5因子アッセイにおけるフィブリン血栓形成の代表的な例です。このプロファイルは、1 つのマイクロプレートで 32 倍に希釈した正常なヒト血漿を使用したフィブリン血栓形成を表しています。

さて、縦軸は、フィブリン血栓形成の結果として発生した405ナノメートルでの吸収剤の変化を示しています。血栓形成の時間は、吸光度対時間曲線の中点である 36.4 秒として計算されました。血栓形成の初期速度は、毎分611.88ミリ単位として計算されました。

雲の形成範囲は0.35単位として計算されました。Factor 5 Assayは、雲形成の時間、初期速度、および範囲を正確に測定します。アッセイ完了時のウェルの検査により、血栓形成が発生したことが確認されました。

すべての反応は、血栓形成術および塩化カルシウム後の開始吸光度と最大吸光度との間の0.35〜0.45単位の間の405ナノメートルでの吸光度の一般的な変化で、CloudFormationとほぼ同じ程度に達しました。さらに、ファクター5の1段階の活動、血栓時間(秒)とファクター5の活動(単位/ミル)の標準曲線、およびファクター5に対するミリ単位/分の初期爪形成率の代表的な例を挙げます。正常なヒト血漿の単位/milの放射能は、それぞれパネルAとパネルBに示されています。

因子5は通常トロンビンで活性化されるためです。トロンビンを添加してインキュベートした後の活性な第5因子A第2アッセイは、第5因子2ステージアッセイでトロンビンを添加して意図的に活性化する血漿サンプルの第5因子2段階活性を正確に測定するために重要です。HBS pH 7.4で100ナノモルの最終濃度で200〜300マイクロリットルの精製トロンビンを調製し、氷上で上記の正常なヒト血漿の120マイクロリットルを希釈し、40倍から100倍までのサンプル血漿を2.8ミリモルを含むHBS pH 7.4の170マイクロリットルでインキュベー

塩化カルシウム。10マイクロリットルのトロンビンを加えて、各サンプルに10ナノモルの最終濃度を達成します。渦動。37度で混合してインキュベートする 1分間、正常なヒト血漿とサンプル血漿を400マイクロリットルのHBS pH 7.4を加えて500倍に希釈します。

ソフトマックスProの吸光度対時間プロファイルから、各サンプル血漿未知アッセイの正常ヒト血漿の血餅時間を決定します。500倍希釈を考慮に入れて、各サンプルの血餅時間を使用して、血栓時間対活性の第5因子1段階標準曲線から第5因子2段階活性を計算します。これは、第5因子、2段階の活動、またはトロンビンによる意図的な活性化を伴う活動を表しています。

次に、ファクター5のアクティビティの合計は、ファクター5の2段階のアクティビティからファクター5の1ステージのアクティビティを差し引いたものとして計算できます。対数凝固時間と対数因子 5 の活性の標準曲線を使用して、正常なヒト血漿および播種性血管内凝固症候群または DIC の 9 人の患者 (9 人全員の DIC 患者) の血漿中の第 5 因子活性を測定しました。第5因子、1段階活性、および血栓形成の初期速度が平均54および18%減少したことを示しましたDIC患者では、第5因子、第2段階および総活動が、正常なヒト血漿と比較して平均44および42%減少しました。

因子5とDIC患者は、線維血栓形成の時間が長くなり、速度が低下しました。このビデオを見た後、この方法を研究室で実装する方法についてよく理解できるはずです。この方法は、血漿中のあらゆる凝固因子の活性を測定するために容易に適応させることができるため、幅広い研究および臨床応用に適しています。

最終的に、第V因子のこの情報は、DICなどの血栓性または出血性疾患の早期診断と治療を通じて、医療環境にプラスの影響を与えます。