マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

本手順の全体的な目的は、ヒト血漿中でのフィブリン血栓形成時における凝固タンパク質である第V因子の活性を測定するマイクロプレートアッセイを開発することでした。損傷に反応して血液凝固プロセスが活性化されると、一連のザイモゲンからプロテアーゼへの変換反応が起こり、最終的に凝固酵素であるトロンビンが生成されます。トロンビンは可溶性フィブリノゲンをフィブリンモノマーに切断し、それらが結合して不溶性のフィブリン血栓を形成します。通常、健康な状態または損傷のない状態では、血液は自由に流動する液体として維持されており、形成されるフィブリンの量は、分解または消失するフィブリンの量と等しくなります。

しかしながら、特定の疾患においては、凝固が過剰になると心疾患や脳卒中を招き、一方で凝固が不十分な場合は出血傾向を招き、これは血友病でよく見られます。第V因子は血漿中のタンパク質であり、活性化形態である第Va因子は、プロトロンビナーゼ複合体の一部として、フィブリン血栓形成時のトロンビン生成を強力に促進します。プロトロンビナーゼは、プロテアーゼである第Xa因子、コファクターである第Va因子、脂質表面、およびカルシウムの4つの成分で構成されています。膜結合性の第Va因子は、基質であるプロトロンビンに対する第Xa因子の触媒効率（kcat）を約3000倍に向上させ、これによりトロンビン生成とフィブリン血栓形成を大幅に促進します。

マイクロプレートプラットフォームは、利便性、時間コスト、少量のサンプル量、連続モニタリング、およびハイスループットであることから、酵素触媒反応の測定に好適です。フィブリン血栓の形成過程は、血漿がフィブリン血栓のない透明な黄色で光吸収が最小の状態から、フィブリン血栓を伴う不透明な白濁状態で光吸収が最大の状態へと変化する際の光吸収度の増加をマイクロプレートリーダーで測定することで、モニタリングが可能です。手動の傾斜管法や自動分析機を用いた測定などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、迅速で低コストであり、必要サンプル量が少なく、ハイスループットであることです。

このアッセイでは、不随意に活性化された第V因子およびトロンビンによって活性化された第V因子の活性を測定し、その総機能活性を完全に定量的に評価します。この手法の実演は、研究室の修士課程学生であるDerek Tilleyが行います。血漿サンプル中の第V因子活性を測定するには、定義上1 mLあたり1ユニットの第V因子活性を含む正常ヒト血漿（NHP）を標準物質として用い、パネルAではフィブリン凝固形成時間、パネルBではフィブリン凝固形成の初期速度について、第V因子の1段階活性標準曲線を作成する必要があります。第V因子欠損血漿、正常ヒト血漿、未知のサンプル血漿、およびトロンボプラスチンを37°Cで10分間解凍します。

第V因子欠損血漿とトロンボプラスチンを穏やかに混ぜ合わせ、別々のプラスチック製洗浄トレーに移し、氷上でインキュベートします。正常ヒト血漿と未知のサンプル血漿は、穏やかに混ぜ合わせた後、氷上で保存します。第V因子の1段階活性標準曲線に使用する25 mM 塩化カルシウム蒸留水溶液は、別の洗浄トレーに入れ、室温で保存します。

1.5 mlマイクロ遠心チューブを用い、HBS pH 7.4を使用して、正常ヒト血漿を0、2、4、8、16、32、64、128、256、および512倍の2倍段階希釈し、それぞれ200 µLずつ調製します。十分にボルテックスし、氷上で静置します。血漿未知検体については、1.5 mlマイクロ遠心チューブを用い、HBS pH 7.4で正常ヒト血漿および未知試料血漿を40倍に希釈し、それぞれ200 µLずつ調製します。5本のマイクロウェルストリップをマイクロプレートリーダーのテンプレートホルダーに設置します。

マイクロプレートリーダーの電源を入れ、Softmax Proマイクロプレートアプリケーションソフトウェアを起動します。マルチチャンネルピペットを用いて、すべてのサンプルマイクロプレートウェルに50 µLの第V因子欠乏血漿を同時に添加します。単一のピペットを用いて、調製した正常ヒト血漿の10倍段階希釈液、正常ヒト血漿の40倍希釈液、および未知のサンプル血漿の40倍希釈液を、それぞれ別のマイクロプレートウェルに50 µLずつ添加します。マルチチャンネルピペットを用いて、すべてのサンプルウェルに50 µLのトロンボプラスチンを添加します。マイクロプレートリーダー内で25 °Cで1分間インキュベートし、そのうち15〜25秒間は振盪を行います。

MICROPLATEリーダーに接続されたコンピュータを使用して、Softmax Pro Microplateアプリケーションソフトウェアを起動します。Microplateリーダーの吸光波長を405 nmに、キネティック温度を25 °Cに設定し、塩化カルシウム添加後の最初の5秒間は振盪するようにプログラムし、その後6分間、5秒ごとに405 nmの吸光度を測定するように設定します。なお、算出される凝固時間には、この5秒間の振盪間隔は含まれません。2本のマルチチャンネルピペットを同時に使用して、サンプルが入った2枚のマイクロプレートストリップに塩化カルシウムを50 µLずつ加えます。

15秒間待機し、すぐにコンピューターのSoftmax Proにあるスタートアイコンを押してアッセイを開始します。分析した各血漿サンプルについて、凝固形成時間を決定し、吸光度の増加が最大値の半分に達するまでの時間を秒数で定義します。凝固形成の初期速度は、時間に対する吸光度増加の線形部分における最初の5つの時間ポイントにおける吸光度増加率として定義されます。

凝固の程度は、測定終了時の凝固過程において得られた最大吸光度と最小吸光度の差として定義されます。Softmax Proの吸光度対時間プロファイルを用いて、正常ヒト血漿の連続希釈における凝固時間、初期速度、および凝固の程度を決定してください。第V因子ワンステージ活性標準曲線を作成するには、40倍希釈した正常ヒト血漿および未知のサンプル血漿の凝固時間を用い、第V因子ワンステージ活性標準曲線から第V因子活性をunits per mLで補間します。

これは、トロンビンによる意図的な活性化を行わない、第V因子の一段階活性を示しています。これは、マイクロプレートリーダーを用いて測定した、第V因子アッセイにおけるフィブリン凝固形成の経時的な代表例です。このプロファイルは、単一のマイクロプレート内で32倍に希釈した正常ヒト血漿を用いてフィブリン凝固を形成させた結果を示しています。

縦軸は、フィブリン凝固の結果として生じた 405 nanometers における吸光度の変化を示しています。凝固時間は、吸光度対時間の曲線のの中点として算出され、36.4 seconds でした。凝固の初期速度は 611.88 milli units per minute と算出されました。

白濁形成の程度は0.35ユニットとして算出されました。ファクターファイブアッセイにより、初期速度および白濁形成の程度を正確に測定できます。アッセイ完了後にウェルを確認したところ、凝固形成が起こっていることが確認されました。

すべての反応において、血栓形成および塩化カルシウム添加前の開始吸光度と、その後の最大吸光度の差（405ナノメートルにおける吸光度の変化量）が0.35から0.45ユニットの間であり、ほぼ同程度の凝固形成度に達しました。正常ヒト血漿における第V因子の一段階活性の代表例として、凝固時間（秒）に対する第V因子活性（units/mL）の標準曲線および、第V因子活性（units/mL）に対する凝固形成初期速度（milli units/分）が、それぞれパネルAとパネルBに示されています。

第V因子は通常、トロンビンによって活性化されます。活性化共因子である第V因子Aを測定するため、トロンビンを添加しインキュベーションした後の2回目のアッセイが、血漿サンプルの第V因子2段階活性を正確に測定するために不可欠です。第V因子2段階アッセイ用のトロンビンによる意図的な活性化について、HBS pH 7.4中で最終濃度100 nMの精製トロンビンを200～300 µL調製し、氷上でインキュベーションします。上記の結果得られた正常ヒト血漿およびサンプル血漿120 µLを、2.8 mMを含むHBS pH 7.4の170 µLで40倍から100倍に希釈します。

塩化カルシウム。各サンプルに、最終濃度が10 nanomolarになるようにthrombinを10 µL加える。ボルテックスミキサーで混和し、37 °Cで1分間インキュベートする。正常ヒト血漿およびサンプル血漿にHBS pH 7.4を400 µL加え、500倍に希釈する。

SoftMax Proにおける吸光度対時間のプロファイルから、各未知試料血漿の正常ヒト血漿における凝固時間を決定します。500倍希釈を考慮し、各試料の凝固時間を用いて、凝固時間対活性の第V因子1段階標準曲線から第V因子2段階活性を算出します。これは、第V因子の2段階活性、すなわちトロンビンによる意図的な活性化を伴う活性を表します。

全第V因子活性は、第V因子2段階活性から第V因子1段階活性を差し引くことで算出できます。対数凝固時間対対数第V因子活性の標準曲線を用いて、正常ヒト血漿および播種性血管内凝固症候群（DIC）患者9名の血漿中の第V因子活性を測定しました。DIC患者9名全員において、第V因子1段階活性および凝固形成の初期速度が、平均でそれぞれ54%および18%低下していました。また、DIC患者における第V因子2段階活性および全活性は、正常ヒト血漿と比較して平均で44%および42%低下していました。

第V因子欠乏症およびDIC患者では、線維素血栓の形成時間が延長し、形成速度が低下するという結果になりました。このビデオを視聴することで、この方法を研究室でどのように実施すべきかについて十分な理解が得られるはずです。この方法は、血漿中のあらゆる凝固因子の活性測定に容易に適応させることができ、幅広い研究および臨床応用に適しています。

最終的に、この第V因子に関する情報は、DICなどの血栓性または出血性疾患の早期診断および治療を通じて、医療現場に好影響を与えることになります。