単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

この手順の全体的な目的は、マイクロアレイベースのトランスクリプトーム解析のために単一細胞を分離することです。これは、まず周囲の組織から網膜を摘出し、次にそれを単一細胞に解離させることで達成されます。第2のステップでは、単一細胞を回収し、溶解バッファーを含むPCRチューブに分注します。

次に細胞を溶解し、逆転写およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応を用いてcDNAを増幅します。最終的に、AiMatrixマイクロアレイ上で単一細胞のcDNAをハイブリダイゼーションさせ、単一細胞で発現しているmRNAを明らかにします。組織全体を用いた手法ではなく、単一細胞で遺伝子発現をプロファイリングする主な利点は、単一細胞の単離によって、組織全体を構成する非常に少数の細胞集団にアクセスできることです。

これらの細胞は、さまざまな種類のニューロンから、ごく少数の幹細胞集団まで多岐にわたります。シングルセル技術を用いることで、これらの細胞の細胞型や、少数の細胞集団に特有のマーカーを特定できるほか、極めて稀な細胞サブセットで発現している遺伝子ネットワークを特定することが可能になります。さらに、シングルセルプロファイリング技術によって、非常に小さな細胞サブセットにおけるダイナミックな発生移行期に一過性に発現する遺伝子ネットワークを特定することもできます。

この手法は、前駆細胞が分化に関連する遺伝子ネットワークの発現をいつ開始するのか、またそれらの前駆細胞が互いにどのように異なるのかといった、発生遺伝学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術の意義は、緑内障などの神経変性疾患に対する細胞療法にまで及びます。なぜなら、個々の細胞の発達における重要なネットワークを解明することで、細胞置換療法に使用するための細胞を生成することに一歩近づくからです。まず、マウスの網膜をPBSを満たしたディッシュに入れて、この手順を開始します。

次に、硝子体と水晶体を除去します。その後、網膜色素上皮をすべて除去してください。網膜を1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、37 °Cで10分間インキュベートします。

その後、チューブを軽く叩いて沈殿した細胞を分散させます。次に、P 1000 ピペッターを用いて10〜20回、穏やかにトリチュレーション（ピペッティング）を行います。組織の大きな塊が残っている場合は、37 °Cでさらに10分間インキュベートし、再度10〜20回ピペッティングしてください。

次に、10 units/µLのDNA 5 µLをレチナに添加し、室温で5分間インキュベートします。その後、P1000ピペッターを用いて、さらに10〜20回静かにピペッティングします。3000 RPMで3分間遠心分離します。

次に、上清を除去し、チューブの底に100から200 µLの液体を残します。チューブを軽く叩いてペレットを剥離させます。続いて、1 mLのHBSSを加え、穏やかに回転させてペレットを再懸濁します。

3000 RPMで3分間遠心分離します。終了後、上清を注意深く取り除きます。その後、0.1%BSAを含む450 µLのPBSで再懸濁します。次のステップに向けて、0.1%BSAを添加した5 mLのPBSを入れた6 cmディッシュを2枚準備します。

次に、分散させた細胞を1枚のディッシュに播種します。細胞が沈降するまで少なくとも5分間静置してください。その後、分散細胞の入ったディッシュを倒立顕微鏡下に設置します。

アスピレーターチューブを備えた細いチップのピペットを使用して、単一細胞を回収します。次に、マイクロピペットを細胞に近づけると、毛細管現象によって細胞が容易にマイクロピペット内に入ります。その後、細胞を2枚目のディッシュに排出してください。遺伝子発現プロファイリングのために、回収された細胞が1個のみであることを確認してください。

これは、不要な細胞を取り除くか、あるいは新しいマイクロピペットを用いて目的の細胞を別の場所へ移動させることで行います。個々の細胞が周囲の細胞から完全に分離されたら、新しいマイクロピペットを使用して目的の細胞を吸引します。次に、4.5 µLの細胞溶解バッファーが入った0.2 mL PCRチューブに直接排出します。

マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間遠心し、細胞を溶解バッファーに浸します。この遠心操作を5細胞ごとに行い、回収の最後にも再度実施してください。単一細胞の単離中はチューブを氷上に保持し、本手順で最適な結果を得るためには、解離後2時間以内に単一細胞を回収してください。最後に、マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間遠心し、単一細胞が細胞溶解バッファーに確実に浸っていることを確認します。

細胞溶解を促進するため、サーモサイクラーを用いてサンプルを 70 °C で 90 秒間インキュベートします。その後、すぐにチューブを氷上に置き、2 分間静置します。逆転写を行うために、0.33 µL を添加します。

200 units/µLのSuperscript threeを0.05 µL、40 units/µLのインヒビターを0.07 µL、およびT four gene 32 proteinをチューブに加えます。反応混合物をサーモサイクラーを用いて50 °Cで50分間インキュベートし、その後、70 °Cでさらに15分間加熱して酵素を失活させます。

完了後、チューブを氷上に置きます。未反応のプライマーを除去するため、10x exonuclease buffer 0.1 µL、D H2O 0.8 µL、および exonuclease I（20 units/µL）0.1 µLをチューブに加え、サーモサイクラーを用いて37 °Cで30分間インキュベートします。

30分後、反応混合物を80 °Cで25分間インキュベートし、酵素を不活化させます。終了後、チューブを再び氷上に置きます。次に、テイルイング反応混合物を6 µL、サンプルに加えます。

サーモサイクラーを用いて、37°Cで20分間、次いで70°Cで10分間インキュベートし、その後4°Cで保存します。続いて、テイル処理したサンプル10 µLをPCR反応液に加えます。第二鎖合成およびPCR増幅を行い、cDNAを標識します。

iMatrixマイクロアレイで堅牢なハイブリダイゼーションを得るために、まず、1x T4 all buffer 8 µLにシングルセルcDNA 10～20 µLを加えてcDNAを断片化します。次に、この希釈したDNA 1 µLを、80 µLの反応溶液に加えます。続いて、5x TdTバッファー 20 µL、ビオチン化dUTP 2.5 µL、および希釈TdT 1 µLをそこに加えます。

次に、20 µLの5×TDTバッファー、2.5 µLのビオチン標識ddATP、および1 µLのTDTを添加します。混合物を37 °Cで90分間インキュベートした後、65 °Cで5分間インキュベートします。

その後、-20 °Cで保存するか、直ちにa iMatrixマイクロアレイでハイブリダイズさせます。ここでは、単一細胞cDNAスミアおよび遺伝子特異的PCRの代表例を示します。レーンA、F、G、N、Hには強固なcDNAスミアが見られますが、レーンB、C、D、Eはかなり弱くなっています。cDNAは蛍光網膜神経節細胞から単離され、その後、網膜神経節細胞マーカーであるBRN3BおよびPAX6に特異的なPCRプライマー、および視細胞マーカーの遺伝子特異的PCRを用いて試験されました。

単一細胞における汚染レベルを決定するために、CRXが使用されました。tachy kinin one遺伝子の存在をスクリーニングすることにより、CDNAおよび網膜神経節細胞のサブセットを特定しました。22個の異なる単一細胞で発現した選択遺伝子のマイクロアレイ結果を、ヒートマップ形式で示しています。

マイクロアレイ信号の強度は赤色の強度に対応するようにスケーリングされており、黒色はマイクロアレイ上の信号の欠如を示しています。この手順に続いて、QPCRなどの追加の手法を用いて、マイクロアレイで観察された遺伝子発現パターンを確認することができます。また、Cハイブリダイゼーションの結果を用いて、特定の遺伝子を発現している細胞の位置に関するさらなる疑問を解決することも可能です。

このビデオを視聴することで、網膜を解離させ、単一細胞を単離し、それらの単一細胞からマイクロアレイでのハイブリダイゼーションに使用するためのcDNAを調製する方法について、十分な理解を得ることができます。