単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

この手順の全体的な目標は、マイクロアレイベースのトランスクリプトーム解析のために単一細胞を単離することです。これは、最初に網膜を周囲の組織から解剖し、次にそれを単一の細胞に解離することによって達成されます。2番目のステップは、単一細胞を採取し、溶解バッファーを含むPCRチューブに沈着させることです。

次に、細胞を溶解し、逆転写を使用してCDNAを増幅し、続いてポリメラーゼ連鎖反応を行います。最終的に、A iMatrixマイクロアレイ上のシングルセルCD NAのハイブリダイゼーションを使用して、シングルセルで発現するmRNAを明らかにします。全組織アプローチを使用するのではなく、単一細胞の遺伝子発現をプロファイリングする主な利点は、単一細胞単離により、組織全体を構成する非常に小さな細胞集団にアクセスできることです。

これらの細胞は、さまざまな種類のニューロンから、幹細胞の小さな集団まで、何でもかまいません。シングルセル技術によってこれらの細胞に対してできることは、これらの小さな細胞集団の特定のマーカーである両方の細胞タイプを特定し、これらの非常にまれな細胞のサブセットで発現する遺伝子ネットワークを特定することです。さらに、シングルセルプロファイリング技術により、細胞の非常に小さなサブセットにおける非常にダイナミックな発生遷移中に一過性に発現する遺伝子ネットワークを特定することができます。

この方法は、前駆細胞が分化に関連する遺伝子ネットワークを発現し始める時期や、それらの前駆細胞が互いにどのように異なるかなど、発生遺伝学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、緑内障などの神経変性疾患の細胞治療にまで及び、個々の細胞の発生における主要なネットワークを解明することで、細胞補充療法で使用するための細胞を生成できるようになることに一歩近づくことができます。この手順は、PBSで満たされた皿にマウスの網膜を置くことから始めます。

次に、硝子体とレンズを取り外します。次に、網膜色素上皮をすべて取り除きます。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで網膜を摂氏37度で10分間インキュベー

その後、チューブを軽くたたいて、沈殿した細胞を取り除きます。次に、P 1000ピペッターで10〜20回、穏やかにトライレートします。組織の大きな塊が持続する場合は、摂氏37度でさらに10分間インキュベートし、10〜20回冷蔵します。

次に、5マイクロリットルのDNAを、1マイクロリットルあたり10単位ずつ網膜に加え、5分間インキュベートします。室温で再度P 1000ピペッターで静かに評価し、その後さらに10〜20回加熱します。3000 RPMで3分間遠心分離します。

次に、上澄みを取り除き、底に100〜200マイクロリットルの液体を残します。チューブを軽くたたいてペレットを外します。次に、1ミリリットルのHBSSを加え、ペレットを穏やかに再懸濁します。

3000 RPMで3分間遠心分離します。終わったら、上澄みを慎重に取り除きます。その後、次のステップで0.1%BSAを含む450マイクロリットルのPBSに懸濁し、0.1%BSAを補充した5ミリリットルのPBSを含む2つの6センチメートル皿を準備します。

次のプレートは、解離した細胞を1つの皿に載せます。セルが少なくとも 5 分間落ち着くのを待ちます。その後、解離した細胞の皿を倒立顕微鏡の下に置きます。

吸引チューブ付きの先端の細いピペットを使用して、単一細胞を回収します。次に、マイクロピペットを細胞の近くに置くと、毛細管現象によってマイクロピペットに容易に入ります。その後、細胞を2番目のディッシュに排出し、遺伝子発現プロファイリングのために1つの細胞のみが回収されるようにします。

これは、無関係な細胞を除去するか、新しいマイクロピペットで目的の細胞を別の場所に移動することによって行われます。個々の細胞が隣接する細胞から完全に単離されたら、新しいマイクロピペットを使用して目的の細胞を吸引します。次に、4.5マイクロリットルの細胞溶解バッファーを含む0.2ミリリットルのPCRチューブに直接排出します。

サンプルをマイクロ遠心分離機で短時間回転させ、細胞を溶解バッファーに浸します。このスピンは、5 番目のセルごとに回転し、コレクションの最後に再度行います。この手順で最適な結果を得るためには、シングルセル単離の期間中チューブを氷上に保持し、解離後2時間以内にシングルセルを採取することを忘れないでください。マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間回転させて、シングルセルが細胞溶解バッファーに浸されていることを確認します。

細胞溶解を促進するには、サンプルを摂氏70度でサーモサイクラーで90秒間インキュベートします。その後、すぐにチューブを氷の上に2分間戻します。逆転写を行うには、0.33マイクロリットルを追加します。

マイクロリットルあたり200単位、マイクロリットルあたり40単位、および0.07マイクロリットルで0.05マイクロリットルの阻害剤で3つの上付き文字。T 4遺伝子32タンパク質をチューブに。反応混合物を50°Cで50分間インキュベートし、50分後にサーモサイクラーで、さらに15分間、70°Cで酵素を不活性化します。

それが完了したら、チューブを氷の上に戻します。遊離プライマーを除去するには、0.1マイクロリットル、10 xエキソヌクレアーゼ緩衝液、0.8マイクロリットル、D H2Oおよび0.1マイクロリットルを添加する。エキソヌクレアーゼ、チューブに1マイクロリットルあたり20ユニットで1つを、サーモサイクラーで摂氏37度で30分間インキュベートしました。

30分後、反応混合物を摂氏80度で25分間インキュベートすることにより、酵素を不活性化します。最後に、チューブを氷の上に戻します。次に、6マイクロリットルのテーリング反応混合物をサンプルに加えます。

サーモサイクラーで37°Cで20分間、70°Cで10分間インキュベートし、その後4°Cに保ちます。続いて、テールサンプルの10マイクロリットルをPCR反応混合物に加えます。二本鎖合成とPCR増幅を行い、CDNAを標識します。

iMatrixマイクロアレイ上でロバストなハイブリダイゼーションを得るためには、まず、10〜20マイクロリットルの単一細胞CD NAを8マイクロリットル(1×1)を全てのバッファーに添加してCD NAをフラグメント化する。次に、この希釈したDNAの1マイクロリットルを80マイクロリットルの反応溶液に加えます。次に、20マイクロリットル、5つのXTDTバッファー、2.5マイクロリットルのビオチン、6つのD-D-A-T-Pと1マイクロリットルの希釈TDTをそれに加えます。

次に、20マイクロリットル、5つのXTDTバッファー、2.5マイクロリットル、ビオチン、および6つのD-D-A-T-Pと1マイクロリットルのTDTを追加します。混合物を摂氏37度で90分間インキュベートします。その後、摂氏65度で5分間。

その後、マイナス20°Cで保存するか、すぐにiMatrixマイクロアレイにハイブリダイズします。これは、シングルセル CD NA 塗抹標本と遺伝子特異的 PCR レーン A-F-G-N-H には堅牢な CD NA 塗抹標本が含まれていますが、レーン B、C、D、および E の堅牢性はかなり低い代表的な例です。CDNAは蛍光網膜神経節細胞から単離され、次いで、網膜神経節細胞マーカーに特異的なPCRプライマー、BRN 3 BおよびPAC 6、光受容体マーカーの遺伝子特異的PCRを用いて試験した。

CRXを使用して、シングルセルの汚染レベルを決定しました。CDNAおよび網膜神経節細胞のサブセットは、遺伝子tachy kinin oneの存在をスクリーニングすることによって同定された。22の異なる単一細胞で発現した選択した遺伝子のマイクロアレイ結果をヒートマップ形式で示します。

マイクロアレイ信号からの強度は赤色の強度に対応するようにスケーリングされており、黒はマイクロアレイ上に信号がないことを示します。この手順に続いて、QPCRなどの追加の方法を使用して、マイクロレイで見られる遺伝子発現パターンを確認できます。Cハイブリダイゼーションの結果は、特定の遺伝子を発現する細胞の位置に関する追加の質問に答えるためにも使用できます。

このビデオを見た後、網膜を解離し、単一細胞を分離し、それらの単一細胞からCDNAを生成する方法についてかなりよく理解できるはずです。マイクロアレイでのハイブリダイゼーション用。