Name: 単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶ単一細胞のトランスクリプトーム解析法。網膜細胞を単離しcDNA増幅とマイクロアレイ解析で発現プロファイリングを行い、希少細胞集団のマーカー遺伝子と分化過程の遺伝子ネットワークを同定する技術です。

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1。細胞解離<ol><li>示されているプロトコルをまとめたフローチャートは、 図1である。このプロトコルを通して使用される特定の試薬 ​​のカタログ番号については、 表1を参照してください。 PBS浴中の網膜を分析。解剖中には、網膜が解離を阻害することができ、それらを維持するので、硝子体、レンズを取り外すことをお勧めします。網膜色素上皮（RPE）のすべてを削除するには、いくつかのインスタンスでは、それが完全にそれを削除することは不可能かもしれませんが常に非常に重要なことではありません。しかし、視細胞の単一細胞のプロファイリング実験のために、RPEを削除する必要があります。 RPEを削除に失敗すると、RPEに発現遺伝子を持つロッドセル·プロファイルの汚染につながる可能性があります。これは、おそらく感光体とRPEとの間の接続によるものです。 解離については、全体の大人のマウスの網膜は、20を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに10分間37℃でインキュベートするμlの活性化パパイン、5mMのEDTAの20μlの25mMのシステイン、および10mM HEPESを添加した360μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）。フィルター付きピペットチップは、潜在的な汚染を最小限に抑えるためのプロトコル全体のすべての手順を実行するために使用されます。パパイン濃度とインキュベーション時間は、年齢や組織の性質に応じて異なります。たとえば、生後0日（P0）で分離された網膜を開発して解離し、10μlの活性パパイン、5mMのEDTAの10μlの25mMのシステイン、および10mM HEPESを添加した380μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）で網膜をインキュベート37℃で10分間異なる種からの網膜もわずかに異なる条件が必要になります。鶏の網膜は、開発のほとんどの段階で、マウスの網膜よりも薄いです。 10μlの活性化パパイン、5mMのEDTAの10μlの25mMのシステイン、および37℃で5分間、10mMのHEPESを添加した380μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）°Cを使用すると、tを解離するのに十分であるhese網膜。 </li><li>穏やかに、任意の和解の細胞を取り除くために、チューブをタップして、P1000ピペットで軽く10〜20倍粉薬。 37℃でさらに10分間インキュベート°C組織の大きな塊が10〜20倍を保持して再粉薬の場合。 </li><li> DNアーゼI（10 U /μl）を5μlを加え、室温で5分間インキュベートする。 P1000ピペットで軽くひいて粉にする。回数の正確な数は経験的に決定する必要がありますが、一般的に10から20の間にあるでしょう。 </li><li> 3分間3000rpmでテーブルトップ遠心機で遠心分離し下部に液体の100〜200μlの溶液を残し、上清を取り除き、ペレットを取り除くために、チューブをタップします。 HBSS 1 mLを加え、穏やかな粉砕でペレットを再懸濁します。チューブをタップすると、単に網膜の細胞の多くを溶解してペレットを再懸濁し、ここが重要です。これが大人のマウスの網膜に特に当てはまります。 </li><li> 3分間3000rpmで遠心分離し、慎重に含むPBS 450μlの上清と再懸濁しを削除するる0.1％BSA。それは、将来の反応を阻害することができた解離から溶解した細胞とされた製品からのmRNAの存在を最小限に抑えるためにできるだけ多くの上清を除去することが重要です。 </li></ol> 2。単一細胞を収穫<ol><li> 0.1％BSAを添加した5mlのPBSを含む2つの6 cmの皿を準備します。皿一皿の上に解離細胞と細胞が少なくとも5分のために解決することができます。使用される細胞密度は、プロファイルされ、単一の細胞の性質に大きく依存します。例えば、蛍光マーカーのようなGFPで標識された非常に希少な細胞のために、全体の解離網膜は、単一の6cmのディッシュ上に播種されています。やや豊富に存在する細胞については、より少ない細胞が最初にそれが簡単に第一マイクロピペットで1（または1に非常に近い）は、細胞を収穫できるようにメッキされています。 </li><li>倒立顕微鏡上に解離された細胞のプレートを置きます。我々は、オリンパスからIMT-2モデルを使用しています。 fiに描かれているマイクロピペットを用いてNEの先端（内径0.5ミリメートル、外径1.04ミリメートル）（ 図2）と一緒に吸引管とは、単一のセルを収穫。細胞は容易にそれが皿の上に近くに配置されているマイクロピペットを入力してください。それは吸引チューブが長すぎたり、倒立顕微鏡（私たちは倒立顕微鏡で使用する吸引チューブは38.1 cmの長さです）に関連付けられているステージまでの距離が短すぎるものでもないことが重要です。チューブが長すぎる場合、細胞をコレクションチューブにマイクロピペットから効率的に追放することはできません。我々は古いIMT-2モデル倒立顕微鏡を使用して主な理由は、我々はそれが私たちの吸引器アセンブリ管のステージに理想的な距離を持って発見したことである。マイクロピペットを入力した後、セル（またはセル）がただ一つの細胞が遺伝子発現プロファイリングのために採取されていることを確認する2番目の板（洗濯板）に追放されています。第二の板の上には、新しいマイクロピペットで余分な細胞を除去することがしばしば必要です。または、単一のセルはマイクロピペットに入ることを確認するために別の場所に興味のあるセルを移動します。 </li><li>個々の細胞が完全に隣接する細胞から単離されたとき、2.2節のように、目的の細胞を吸引するための新しいマイクロピペットを使用し、4.5μlのCell Lysis緩衝液を含む0.2ミリリットルのPCRチューブに直接排出します。セルは、チューブにマイクロピペットの先端を断つないように注意しながら、チューブの側に排出されます。サンプルは溶解バッファーで細胞を浸すためにベンチトップ遠心で簡単にスピンすることができます。この回転は、通常、単一細胞の分離の期間中に氷上で保存すべきである5回ごとにセルの後、再度溶解緩衝液中の単一細胞を含むcollection.Tubesの終わりに行われます。最適な結果を得るためには、単一の細胞は2時間のウィンドウをポスト解離内で収集されます。この時間が経過した後に追加の時間がobservされているので、それは逆転写のステップに進むために最適ですRNAの分解の可能性を高めるためにED。 </li></ol> 3。逆転写<ol><li>簡単にすべての単一の細胞は、細胞溶解緩衝液に浸漬されるようにベンチminicentrifugeでサンプルをスピン。細胞溶解を促進するために、90秒、70℃でサンプルをインキュベートする。サーモインチすぐに戻って氷の上にチューブを配置します。 </li><li> 2分間氷上でチューブを残します。すべての試薬の追加については、汚染を防止するフィルタチップピペットチップを使用しています。逆転写を行うために、0.33μlを上付き文字III（200 U /μl）を、0.05μlのRNaseインヒビター（40 U /μl）を0.07μlのT4遺伝子32タンパク質を追加します。 50℃50分℃でサーモに反応混合物をインキュベートします。氷上で15分、場所を70°C、酵素を不活性化する。 </li><li>無料のプライマーを除去するために、0.1μlのエキソヌクレアーゼバッファー（10X）、0.8μlののdH 2 0（分子生物学グレード）、0.1μlのエキソヌクレアーゼを追加するI（20 U /μl）を。で30分間37℃でインキュベートサーモ。 25分間80°Cで反応をインキュベートし、氷上でチューブを配置することによって酵素を不活性化する。 </li></ol> 4。テーリングとシングルセルPCR <ol><li>テーリング反応混合物の6μlを加え、10分間、20分間、70℃、37℃でサンプルをインキュベートするためにサーモを使用して、4℃で保持°C </li><li> PCR反応混合物につかれた試料の10μlを追加し、次の条件を使用して第二鎖の合成とPCR増幅を行います。 <ol><li> 2分間95°C </li><li> 5分間37°C </li><li> 16分72°C </li><li> 40秒で93°C </li><li> 1分間67°C </li><li>サイクルあたり6秒を追加し6分間72℃、 </li><li> 4 34回に進みます</li><li> 10分間72℃ </li><li> 4℃で保持°C </li></ol></li></ol> 5。アフィメトリクスチップのラベリング<ol><li> cDNAのラベル10から20μgの（増幅したcDNAの結果の濃度単一のセルからるは、通常、Affymetrix社のマイクロアレイ上で堅牢なハイブリダイゼーションを取得する）は1μg/μlを〜です。最初に、断片液80に8μlの1XワンPhor - すべてのバッファおよび希釈液1μl（1Xで1:10ワンPhor - すべてのバッファ）DNaseIにより、単一細胞cDNAの10から20μlを加えることによってcDNAを反応。 37℃で13分間サーマルサイクラーでインキュベート℃の100°Cと氷の上の場所で15分間のDNase Iを失活さ。 </li><li> 20μlの5倍のTDTのバッファー、2.5μlのビオチンN6-ddATP（エンツォバイオサイエンス）、1μLTdTとの（TDTバッファーで1:8に希釈）を追加します。 </li><li> 65℃、5分間℃、37℃で90分間インキュベート-20℃で保存またはアフィメトリクスマイクロアレイにすぐにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、標準Affymetrix社のプロトコルを使用して実行されます。 </li></ol> 6。代表的な結果評価するために、cDNAサンプルのcDNAを、10μlの品質は、1％アガロースゲル上にロードされています。 cDNAは、主にサイズの範囲（500から2000塩基対）によって判断されるcDNAのスメアのと強度（ 図1および図3a）。図1に示したゲルでは、他のすべてのレーンはE16.5を単離した網膜細胞からのcDNAスメアを示しています。の間のレーンは針に吸引し、PCRチューブに堆積され、メディアのみ生じるスミアが表示されます。これらのレーンは、かすかな汚れを完全に欠いていることは決してありませんが、遺伝子特異的PCRプライマーは、それらの遺伝子を増幅するために使用されている場合、彼らはすべての結果が表示されません。さらに、cDNAのスメアの強度は、（ 図1および図3aを比較）多少異なる場合があります。レーンA、B、C、D、Eはかなり少ない堅牢ている間、図3aのレーンでは、f、g、およびhは、堅牢なcDNAのスメアが含まれています。 遺伝子特異的PCRを用いて、単一細胞からのcDNAの質の二次スクリーニングとして使用されます。 図3のcDNAを蛍光網膜神経節細胞から単離し、それらはtesteあったdは、網膜神経節細胞マーカーBrn3bとPax6のためのPCRプライマーを使用します。このアッセイでは、cDNAを1μlのは30サイクルのPCRを行った。リアルタイム定量PCRアッセイが望ましいであろうが、それは法外に高価であると単にcDNAの品質を評価する必要はありませんができます。単一細胞の全8 Pax6の（ 図3b）のうち8 Brn3bと6の陽性反応を示した。 Brn3bとPax6のために以下の堅牢な生産バンドであったとしてもcDNAのスメア。これらのPCRの結果にもかかわらず、そのようなレーンA、B、C、D、およびEにあるようなcDNAのスメアは、Affymetrix社のアレイ上で堅牢なハイブリダイゼーションを生むとは限らないと一般的に回避されるという我々の経験である。光受容体マーカーCRXのための遺伝子特異的PCRは、単一細胞cDNAを（ 図3b）の汚染レベルを決定するために使用されていました。これらの細胞は網膜の大半（約70％）を構成し、したがって、発生した細胞溶解が最も可能性の高いロッドフォトレジストを含んでしまうため、感光体マーカーが選ばれましたceptors。 CRX存在のかすかな量があっても、PCRの30サイクル後、これらのcDNAの調製のみであった。最後に、このPCRベースの画面がcDNAは完全なマイクロアレイプロファイリングにそれらを施す前から派生した特定の細胞型のどのサブセットを決定するために開始するために使用することができます。これは、このプロセスの中で最も高価なステップであるように、プロファイルされたセルの優先順位付けに役立てることができます。たとえば、我々は遺伝子Tachykinin1（ 図3b）の存在のためにそれらをスクリーニングすることによって、網膜神経節細胞のサブセットを同定した。 小型のPCRベースの画面から、特定の単一のセルが選択され、そのcDNAは、Affymetrix社のマイクロアレイにハイブリダイズした。マイクロアレイデータが比較され、パターンは、標準的なクラスタリングアルゴリズムを使用して発見することができます。このような図4のようにヒートマップは、データをグラフィカルに表現するために生成されます。 図中の単一細胞のプロファイリングデータに関する2つの主要な結論があります4。単一細胞のプロトコルが実行された後、最初に特定の細胞型で発現される遺伝子は、これらの細胞型でほとんど独占的に発見された。 1つの細胞型のマーカー遺伝子は双極細胞は第二の細胞型で、この式は容易にその場でいずれかの方法で確認され、低いレベルでいくつかの&quot;ロッド&quot;の遺伝子を発現するような観察 ​​第二の細胞型でも発見されたほとんどのインスタンスでハイブリダイゼーションまたは抗体染色。第二に、より多様なアマクリンおよび神経節細胞プロファイル内で、遺伝子発現の不均一性は直ちに明らかである。 Nr4a2とScube2が異なるアマクリン細胞で均一に発現される遺伝子の2つの例である一方Pou4f1にのみ、開発神経節細胞の約1/4で表されます。数百の遺伝子が開発神経節細胞のマーカーとして、あるいは2,4 -アマクリン細胞の異なる集団のマーカーとして同定され、確認されているとして、実際には、ヒートマップに示される遺伝子は、小さなサンプルです。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> 図1。単一細胞のプロファイリング方法のフローチャート。まず網膜を単離し、パパインを使用して、個々の細胞に解離する。第二に、単一の細胞が引っ張らガラス針で採取し、PCRチューブに堆積される。細胞を溶解し、cDNAをPCRに続いて逆転写を用いて増幅されています。得られたcDNAの品質は、当該示すようなアガロースゲル上で評価される。最初のレーンでDNAラダーの後、レーンには、メディアコントロールからの増幅産物と交互に（赤い括弧で示される）単一細胞からcDNAスメアを示しています。この品質の塗抹標本（赤括弧）はAffymetrix社のマイクロアレイにハイブリダイズされています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> 図2。針や吸引チューブアセンブリの写真。単一細胞の毛細管現象を用いて分離されているガラスマイクロピペットを（内径0.5ミリメートル、外径1.04ミリメートル）引っ張られ、アスピレーターに吹くの圧力によって転送されます。それは吸引チューブが簡単に操作することは十分に長いと確実に個々のセルを放電するのに十分短いの両方であることが重要である。針に引き込ま毛細管のクローズアップビューがBに示されている<img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> 図3。単一細胞cDNAスメアと遺伝子特異的PCRの代表的な例を示します。増幅後のcDNAを単セルの品質を決定するためには、各単セルのサンプル10μlのネガティブコントロール（）と一緒に1％アガロースゲル上で実行されました。塗抹標本では、500から2000塩基対の間に表示されます。特定の遺伝子の追加のPCRベースのスクリーニングは、単離された細胞の種類とサンプル（B）に存在する汚染の量を識別する/確認することができます。網膜神経節細胞に特異的なプライマーは、Brn3bマーカーとPax6のは、これらの細胞（行1および2）の身元を確認するためにテストされました。準備中、感光体汚染の量を評価するために、感光体マーカーCRXに特異的なプライマーは、（行3）を使用した。神経節細胞のサブセットはまた、Tachykinin1（行4）などのマーカーのスクリーニングによって同定することができる。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> 図4。マーカー遺伝子の単セルの式22の異なる単一細胞で発現し、選択した遺伝子のマイクロアレイ結果をヒートマップ形式で表示されます。マイクロアレイ信号から強度が赤色の強度に対応するようにスケーリングされています。黒は、マイクロアレイ上の信号の有無を示しています。他の細胞は成人の網膜から単離した間に示すように網膜神経節細胞（RGC）の前駆体は、胚の時点から単離した。

<ol><li>Tietjen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+analysis+of+neuronal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors.</a> Neuron. 38, 161-175 (2003).</li>
<li>Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+heterogeneity+of+developing+retinal+ganglion+and+amacrine+cells+revealed+through+single+cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li>
<li>Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+preferentially+in+the+developing+peripheral+margin+of+the+optic+cup%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup.</a> Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).</li>
<li>Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+diversification+of+retinal+amacrine+interneurons+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).</li>
<li>Roesch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+of+retinal+Muller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The transcriptome of retinal Muller glial cells.</a> J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).</li>
<li>Ramos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+diversity+in+transcriptional+profiles+of+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells.</a> PLoS Genet. 2, e159(2006).</li>
<li>Chiang, M. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcript+analysis+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcript analysis of pancreas development.</a> Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).</li>
<li>Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+retinal+progenitor+cells+display+extensive+heterogeneity+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e1588(2008).</li>
<li>Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+problem+of+neuronal+cell+types%3A+a+physiological+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach.</a> Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).</li>
<li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity%3A+too+many+cell+types+for+comfort%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity: too many cell types for comfort.</a> Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).</li>
<li>Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+determination+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell fate determination in the vertebrate retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).</li>
<li>Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+molecular+markers+of+bipolar+cells+in+the+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina.</a> J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).</li>
<li>Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+noise+controls+lineage+choice+in+mammalian+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells.</a> Nature. 453, 544-547 (2008).</li>
<li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+the+myth+of+the+average+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression and the myth of the average cell.</a> Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).</li>
<li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+neural+cell-fate+determination%3A+lessons+from+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).</li>
<li>Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confronting+complexity%3A+strategies+for+understanding+the+microcircuitry+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).</li>
<li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+mouse+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of mouse retinal development.</a> PLoS Biol. 2, e247(2004).</li>
<li>Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+gene+expression+program+of+mammalian+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).</li>
<li>Chowers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+preferentially+expressed+in+the+retina+using+a+custom+human+retina+cDNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).</li>
<li>Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-hit+model+of+cell+death+in+inherited+neuronal+degenerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations.</a> Nature. 406, 195-199 (2000).</li>
<li>McEvoy, J. F. -O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+normally+incompatible+developmental+pathways+in+retinoblastoma+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis.</a> Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).</li>
<li>Gelder, R. N. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+analysis+within+the+human+hippocampus%3A+comparison+of+CA1+and+CA3+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons.</a> J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).</li>
<li>Iscove, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+is+faithfully+preserved+in+global+cDNA+amplified+exponentially+from+sub-picogram+quantities+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA.</a> Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).</li>
<li>Subkhankulova, T., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+linear+and+exponential+amplification+techniques+for+expression+profiling+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level.</a> Genome Biol. 7, R18(2006).</li>
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利害の衝突が宣言されません。

研究の拡大を続ける数は、その遺伝子発現6,8に関してより均一であると考えられていた集団での強固な細胞間の変動を明らかにしています。少なくとも一つのインスタンスで、この遺伝子発現の&quot;ノイズ&quot;が重要な生物学的機能13を果たすことが示されている。個々の細胞間の遺伝子発現の違いは、伝統的な全体の組織の方法を使用して隠されている。これらの実験は、代表的な14ないかもしれない&quot;平均的な&quot;細胞の発現プロファイルを生成します。ここでは、単一網膜細胞からの遺伝子発現パターンの単離および同定するための手法を提案する。個々の細胞の研究は、研究者が種々の細胞型の特徴的な遺伝子発現パターンを決定するために重要である複雑な組織の根底にある細胞の不均質性を調べることができます。さらに、シングルセル分離は、枚ずつの活動を駆動する遺伝子プログラムの洞察を提供することができます開発全体の時点でidual細胞。複雑な細胞ネットワークの機能は珍しい種類の細胞のユニークな遺伝子発現に依存することができる神経系を研究する上で特に有用ですが、このプロトコルは、様々な組織から個々...

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

細胞の高度に専門化が、非常に小さな集団が多くの組織で重要な役割を果たしている。非常にまれな細胞サブセットの細胞型特異的マーカーと遺伝子発現プログラムの識別は、標準的な全体の組織のアプローチを使用して挑戦されています。個々の細胞の遺伝子発現プロファイリングは、全組織1-7のわずかな割合を構成する細胞の種類に前例のないアクセスを可能にします。さらに、この手法は、一時的に8の動的発達遷移中に細胞の小さな数字で表現される遺伝子発現のプログラムを調べるために使用することができます。 携帯電話の多様性のこの問題は、ニューロンの接続が非常に多様な細胞が9との間に発生する可能性があり、中枢神経系（CNS）で繰り返し発生します。異なる種類の細胞の正確な数は正確に知られていないですが、それは皮質私のように多くの1000などの異なるタイプが存在する可能性があることと推定されているtself 10。複雑な神経回路の機能（s）はまれな神経細胞の種類とそれらが発現する遺伝子の一部に依存する場合があります。新しいマーカーを同定し、分子の異なるニューロンを分類するために助けることによって、単一セルのアプローチは、神経系の細胞型の解析に特に有用である。それはまた、神経前駆開発の初期段階で示差的に発現する遺伝子や遺伝子経路を識別することによって、神経発生のメカニズムを解明するのに役立つ可能性があります。 かなりの神経細胞の多様性を持つ単純な、簡単にアクセス組織として、脊椎動物の網膜は、細胞の開発、神経分化と神経多様化のプロセスを研究するための優れたモデルシステムです。しかし、中枢神経系の他の部分のように、この細胞の多様性は、特に桿体は、MAを作ることを考えると、特定の細胞の運命を採用する網膜前駆細胞を駆動する遺伝的経路を決定するための問題を提示することができ合計網膜細胞集団11のjority。ここでは、単一網膜細胞（ 図1）で表される転写産物を同定するための方法を報告します。単一細胞のプロファイリング技術は、網膜2,4,5,12の異なる細胞集団内の異質性の存在量の評価が可能になります。さらに、このメソッドは、細胞の運命は、網膜前駆細胞のサブセット8で発生するプロセスを意思決定の役割（複数可）を果たす可能性がある新たな候補遺伝子の宿主を明らかにした。プロトコルにはいくつかの簡単な調整で、このテクニックは、多くの異なる組織および細胞型に利用することができる。

単一網膜細胞およびそれらのcDNAのその後の増幅を単離するための方法が説明されています。単一細胞トランスクリプトーム組織内に存在する細胞の不均質性の程度を明らかにし、まれな細胞集団の新たなマーカー遺伝子を発見します。付随するプロトコルは、多くの異なる種類の細胞に合わせて調整することができます。

高度に分化しつつも極めて少数の細胞集団が、多くの組織において重要な役割を担っています。細胞型特異的なマーカーの同定および...

この手順の全体的な目的は、マイクロアレイベースのトランスクリプトーム解析のために単一細胞を分離することです。これは、まず周囲の組織から網膜を摘出し、次にそれを単一細胞に解離させることで達成されます。第2のステップでは、単一細胞を回収し、溶解バッファーを含むPCRチューブに分注します。次に細胞を溶解し、逆転写およびそれに続くポリメラーゼ連鎖反応を用いてcDNAを増幅します。最終的に、AiMatrixマイクロアレイ上で単一細胞のcDNAをハイブリダイゼーションさせ、単一細胞で発現しているmRNAを明らかにします。組織全体を用いた手法ではなく、単一細胞で遺伝子発現をプロファイリングする主な利点は、単一細胞の単離によって、組織全体を構成する非常に少数の細胞集団にアクセスできることです。これらの細胞は、さまざまな種類のニューロンから、ごく少数の幹細胞集団まで多岐にわたります。シングルセル技術を用いることで、これらの細胞の細胞型や、少数の細胞集団に特有のマーカーを特定できるほか、極めて稀な細胞サブセットで発現している遺伝子ネットワークを特定することが可能になります。さらに、シングルセルプロファイリング技術によって、非常に小さな細胞サブセットにおけるダイナミックな発生移行期に一過性に発現する遺伝子ネットワークを特定することもできます。この手法は、前駆細胞が分化に関連する遺伝子ネットワークの発現をいつ開始するのか、またそれらの前駆細胞が互いにどのように異なるのかといった、発生遺伝学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この技術の意義は、緑内障などの神経変性疾患に対する細胞療法にまで及びます。なぜなら、個々の細胞の発達における重要なネットワークを解明することで、細胞置換療法に使用するための細胞を生成することに一歩近づくからです。まず、マウスの網膜をPBSを満たしたディッシュに入れて、この手順を開始します。次に、硝子体と水晶体を除去します。その後、網膜色素上皮をすべて除去してください。網膜を1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、37 °Cで10分間インキュベートします。その後、チューブを軽く叩いて沈殿した細胞を分散させます。次に、P 1000 ピペッターを用いて10〜20回、穏やかにトリチュレーション（ピペッティング）を行います。組織の大きな塊が残っている場合は、37 °Cでさらに10分間インキュベートし、再度10〜20回ピペッティングしてください。次に、10 units/µLのDNA 5 µLをレチナに添加し、室温で5分間インキュベートします。その後、P1000ピペッターを用いて、さらに10〜20回静かにピペッティングします。3000 RPMで3分間遠心分離します。次に、上清を除去し、チューブの底に100から200 µLの液体を残します。チューブを軽く叩いてペレットを剥離させます。続いて、1 mLのHBSSを加え、穏やかに回転させてペレットを再懸濁します。3000 RPMで3分間遠心分離します。終了後、上清を注意深く取り除きます。その後、0.1%BSAを含む450 µLのPBSで再懸濁します。次のステップに向けて、0.1%BSAを添加した5 mLのPBSを入れた6 cmディッシュを2枚準備します。次に、分散させた細胞を1枚のディッシュに播種します。細胞が沈降するまで少なくとも5分間静置してください。その後、分散細胞の入ったディッシュを倒立顕微鏡下に設置します。アスピレーターチューブを備えた細いチップのピペットを使用して、単一細胞を回収します。次に、マイクロピペットを細胞に近づけると、毛細管現象によって細胞が容易にマイクロピペット内に入ります。その後、細胞を2枚目のディッシュに排出してください。遺伝子発現プロファイリングのために、回収された細胞が1個のみであることを確認してください。これは、不要な細胞を取り除くか、あるいは新しいマイクロピペットを用いて目的の細胞を別の場所へ移動させることで行います。個々の細胞が周囲の細胞から完全に分離されたら、新しいマイクロピペットを使用して目的の細胞を吸引します。次に、4.5 µLの細胞溶解バッファーが入った0.2 mL PCRチューブに直接排出します。マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間遠心し、細胞を溶解バッファーに浸します。この遠心操作を5細胞ごとに行い、回収の最後にも再度実施してください。単一細胞の単離中はチューブを氷上に保持し、本手順で最適な結果を得るためには、解離後2時間以内に単一細胞を回収してください。最後に、マイクロ遠心分離機でサンプルを短時間遠心し、単一細胞が細胞溶解バッファーに確実に浸っていることを確認します。細胞溶解を促進するため、サーモサイクラーを用いてサンプルを 70 °C で 90 秒間インキュベートします。その後、すぐにチューブを氷上に置き、2 分間静置します。逆転写を行うために、0.33 µL を添加します。200 units/µLのSuperscript threeを0.05 µL、40 units/µLのインヒビターを0.07 µL、およびT four gene 32 proteinをチューブに加えます。反応混合物をサーモサイクラーを用いて50 °Cで50分間インキュベートし、その後、70 °Cでさらに15分間加熱して酵素を失活させます。完了後、チューブを氷上に置きます。未反応のプライマーを除去するため、10x exonuclease buffer 0.1 µL、D H2O 0.8 µL、および exonuclease I（20 units/µL）0.1 µLをチューブに加え、サーモサイクラーを用いて37 °Cで30分間インキュベートします。30分後、反応混合物を80 °Cで25分間インキュベートし、酵素を不活化させます。終了後、チューブを再び氷上に置きます。次に、テイルイング反応混合物を6 µL、サンプルに加えます。サーモサイクラーを用いて、37°Cで20分間、次いで70°Cで10分間インキュベートし、その後4°Cで保存します。続いて、テイル処理したサンプル10 µLをPCR反応液に加えます。第二鎖合成およびPCR増幅を行い、cDNAを標識します。iMatrixマイクロアレイで堅牢なハイブリダイゼーションを得るために、まず、1x T4 all buffer 8 µLにシングルセルcDNA 10～20 µLを加えてcDNAを断片化します。次に、この希釈したDNA 1 µLを、80 µLの反応溶液に加えます。続いて、5x TdTバッファー 20 µL、ビオチン化dUTP 2.5 µL、および希釈TdT 1 µLをそこに加えます。次に、20 µLの5×TDTバッファー、2.5 µLのビオチン標識ddATP、および1 µLのTDTを添加します。混合物を37 °Cで90分間インキュベートした後、65 °Cで5分間インキュベートします。その後、-20 °Cで保存するか、直ちにa iMatrixマイクロアレイでハイブリダイズさせます。ここでは、単一細胞cDNAスミアおよび遺伝子特異的PCRの代表例を示します。レーンA、F、G、N、Hには強固なcDNAスミアが見られますが、レーンB、C、D、Eはかなり弱くなっています。cDNAは蛍光網膜神経節細胞から単離され、その後、網膜神経節細胞マーカーであるBRN3BおよびPAX6に特異的なPCRプライマー、および視細胞マーカーの遺伝子特異的PCRを用いて試験されました。単一細胞における汚染レベルを決定するために、CRXが使用されました。tachy kinin one遺伝子の存在をスクリーニングすることにより、CDNAおよび網膜神経節細胞のサブセットを特定しました。22個の異なる単一細胞で発現した選択遺伝子のマイクロアレイ結果を、ヒートマップ形式で示しています。マイクロアレイ信号の強度は赤色の強度に対応するようにスケーリングされており、黒色はマイクロアレイ上の信号の欠如を示しています。この手順に続いて、QPCRなどの追加の手法を用いて、マイクロアレイで観察された遺伝子発現パターンを確認することができます。また、Cハイブリダイゼーションの結果を用いて、特定の遺伝子を発現している細胞の位置に関するさらなる疑問を解決することも可能です。このビデオを視聴することで、網膜を解離させ、単一細胞を単離し、それらの単一細胞からマイクロアレイでのハイブリダイゼーションに使用するためのcDNAを調製する方法について、十分な理解を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Gómez-Villafuertes, R., et.., ライブイメージングとそれに続くシングルセルトラッキングにより、細胞生物学と複数の神経集団の系統進行をモニタリングします。J. Vis. Exp. (2017)...

成体神経幹細胞の神経系統をモニタリングするためのライブイメージングとシングルセルトラッキング

Source：&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere,  et. al.網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).

蛍光トレーシングによるマウス網膜神経節細胞サブタイプの同定

私たちは、成体マウスの脳の脳室下ゾーン(SVZ)から神経幹細胞(NSC)とその子孫を単離するための蛍光活性化細胞選別(FACS)ベースの方法を報告します。蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)トランスジェニックマウスに適用することで、ライブイメージングによる細胞周期の進行を研究することができます。...

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

ここでは、単離の前、およびその後の単一細胞転写物の特徴付けのために、ニューロン細胞タイプを分類するためのコンビナトリアルアプローチを提示する。このプロトコルは、RNAシーケンシング（RNA-Seq）のためのサンプルの調製を最適化し、細胞多様性の強化された理解のために特別に設計された方法論を記載する。...

網膜神経節細胞の定義されたサブセットの単一細胞RNA-Seq

ソフトウェア ベースの後処理に続いてタイムラプス ビデオ顕微鏡による神経の人口を監視するための堅牢なプロトコルを説明します。このメソッドは、ライブ...

ライブ イメージング モニター細胞生物学および複数の神経集団の血統で、進行を追跡 1 つのセルに続いて

このプロトコルは、神経系の発達中にH2O2の生理的シグナル伝達役割を評価するための培養ゼブラフィッシュニューロンおよび幼虫における遺伝的にコードされた過酸化水素(H2O2)バイオセンサーの使用を記述する。それは、異なる細胞タイプに適用し、一般的な開発で活性酸素種(ROS)を研究するために実験的な治療で変更することができます。...

ニューロン開発中のROSライブ細胞イメージング

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。...

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

このプロトコルは、接着培養システムと浮遊培養システムの両方を含む簡略化された培養条件を使用して、hiPS細胞を眼野クラスターに分化させ、神経網膜オルガノイドを生成する効率的な方法について説明しています。RPEや角膜上皮などの他の眼細胞タイプも、網膜培養の成熟眼野から単離することができます。...

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

このプロトコールは、透過型電子顕微鏡用のレチナールオルガノイドサンプルの最適化された精巧な調製手順を提供します。成熟した網膜オルガノイドのシナプス分析を含むアプリケーションに適しています。...

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

網膜は、その層状構造全体で複雑な空間構成を示します。最新の空間トランスクリプトミクスおよびシーケンシング技術では、厚さ20μm&lt;組織切片が必要であり、網膜研究の適用性は限られています。この新鮮凍結凍結切片法は、平面的な空間的関係を維持しながら、マウス網膜の薄い 顔...

顔面 高次元空間分子解析のためのマウス網膜の凍結切片

このプロトコールは、光学的透明化と免疫標識を組み合わせて、ホールマウント網膜オルガノイドの全容積共焦点イメージングを実現します。3D構造を保持し、主要なニューロン経路の詳細な視覚化を可能にし、網膜の成熟、空間構成、および疾患モデリングや個別化医療への応用の可能性の研究を改善します。...

細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

学ぶ単一細胞のトランスクリプトーム解析法。網膜細胞を単離しcDNA増幅とマイクロアレイ解析で発現プロファイリングを行い、希少細胞集団のマーカー遺伝子と分化過程の遺伝子ネットワークを同定する技術です。

単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

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