GIRKチャネルのモジュレーターを同定するための蛍光スクリーニングアッセイ
2012年4月24日
Gタンパク質依存性内向き整流Kと相互作用する薬剤を同定するためのリアルタイムスクリーニングの手順 +（GIRK）チャンネルが記載されています。アッセイは、GIRKチャネル活性を測定する膜電位感受性蛍光色素を利用しています。この手法は、セルの行数での使用に適応可能である。
この手順の全体的な目標は、grkチャネルを調節する新薬を特定することです。これは、最初にA TT 20セルを96ウェルプレートにめっきすることによって達成されます。2番目のステップは、Verset液体プレートハンドリングシステムを使用して試験化合物を希釈することです。
次に、希釈した試験化合物をバーセットを使用して細胞に塗布します。最後のステップは、96ウェルプレートをSynergy 2蛍光プレートリーダーに挿入し、コントロール溶液とソマトスタチン溶液をウェルに注入することです。最終的に、蛍光プレートリーダーは、ソマトスタチン誘導蛍光シグナルを変化させ、したがってGrkチャネルを調節する化合物を示すために使用されます。
パッチクランプ記録などの既存の方法に対するこの手順の利点は、多数の化合物を迅速にスクリーニングして、それらがゲルクチャネルを変調するかどうかを判断できることです。この技術の意味するところは、FI侵害受容性伝達の阻害につながるゲルクチャネルを活性化する化合物を特定することができるため、疼痛の治療にまで及ぶコーティングの手順を実証する。96ウェルプレートと細胞のメッキはMaribel Vasquezです。
私の研究室の学生 この手順は、5%CO2の加湿雰囲気で摂氏37度で10%ウマ血清を添加したDMEMで下垂体A TT 20細胞を増殖させることから始めます。標準的な化手順を使用して、5〜7日ごとに細胞をサブカルチャーすることにより、培養を維持します。次に、ブラッククリアーのウェルをコーティングします。
ボトム96ウェルプレートに50マイクロリットルのポリLリジンを充填。ウェルをインキュベーターで30分間乾燥させます。次に、ウェルあたり30, 000細胞の密度で200マイクロリットルの培地を含む96ウェルプレートの細胞を余分なポリLリジンプレートで除去します。
その後、細胞をインキュベーターに3〜4日間保存します。吸引セットアップを使用して、細胞単層から培地をゆっくりと吸引し、細胞を200マイクロリットルの正常緩衝液で洗浄します。続いて、膜電位感受性色素を含む200マイクロリットルの緩衝液をそれぞれに加えます。
細胞を摂氏37度で40分間よくインキュベートします。40分後、A TT 20細胞をインキュベーターから取り出し、室温に戻して、古いバッファーを吸引します。次に、MPDを含む新しい緩衝液を細胞に塗布します。
次に、リキッドハンドリングシステムを使用して、さまざまな濃度の試験化合物と制御溶液を細胞に適用します。96ウェルプレートで、試験化合物を使用して細胞を5分間インキュベートし、蛍光測定を行います。この手順では、96ウェルプレートをBiotech Synergy 2蛍光プレートリーダーに挿入します。
滲出波長520ナノメートル、ミッション波長560ナノメートルの蛍光バックグラウンドシグナルを取得します。その後、G PCR Rリガンドまたはコントロール溶液をウェルに適用し、Synergy 2インジェクターシステムを使用してGIRチャネルを活性化します。次に、302 番目のサンプリング期間にわたって 10 秒間隔でデータ ポイントを収集します。
励起波長と発光波長で。アッセイの信頼性を判断するために、Z係数を計算します。Z.Factorsが0.5から1.0の範囲にあることは、アッセイの品質が優れていることを示しています。
Z係数が0.5未満のプレートは除外されます。分析から、蛍光シグナルを調節する化合物は、2ミリモルの塩化バリウムまたは500ナノモルテラピンQの存在下で再試験され、ここに示されている内部整流器カリウムチャネル特異性を確認するために、ソマトスタチンまたはコントロール溶液を添加してA TT 20細胞で経時的に測定された代表的なHLB 0 2 1 1 15 2蛍光シグナルである。Y軸の蛍光強度の比は、ソマトスタチンまたは対照溶液の存在下でのシグナルを、ソマトスタチンまたは対照溶液の添加前に測定したベースラインシグナルで割ることによって計算した。
ここに示されているのは、500ナノモルを持つA TT 20細胞の処理です。テラピンQは、2つのチャネルを結合してGチャネルをブロックすることにより、ソマトスタチンを介した蛍光シグナルの減少を阻害します。.そして、ここに示されているのは、20マイクロモルのプロパフェノンによるA TT 20細胞の治療であり、これもまた、蛍光シグナルのソマトスタチン媒介性減少を阻害します。
このビデオを見れば、蛍光プレートリーダーを使用してgrkチャネルを調節する薬物を同定する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
本記事では、Gタンパク質共役型内向き整流カリウム（GIRK）チャネルと相互作用する薬剤を同定するためのリアルタイムスクリーニング手順について解説します。このアッセイでは、膜電位感受性蛍光色素を用いてGIRKチャネル活性を測定するため、さまざまな細胞株に適応させることが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 薬理学
- 神経科学
- 電気生理学
背景
- GIRKチャネルは神経細胞のシグナリングにおいて重要な役割を果たします。
- GIRKチャネルのモジュレーターを特定することで、新たな治療戦略につながる可能性があります。
- リアルタイムアッセイは、薬剤スクリーニングの効率を向上させます。
- 蛍光染料により、チャネル活性を感度よく測定することが可能です。
研究目的
- GIRKチャネルを調節する薬剤のスクリーニング手順を開発すること。
- ハイスループット形式を利用して、複数の化合物を試験すること。
- GIRKチャネルの薬理学的な理解を深めること。
使用した手法
- 96ウェルプレートへのTT 20細胞の播種。
- Verset液体ハンドリングシステムを用いた被験化合物の希釈。
- Versetを用いた希釈化合物の細胞への添加。
- Synergy 2蛍光プレートリーダーを用いた応答の測定。
主な結果
- ソマトスタチン誘発シグナルを変化させる化合物の同定。
- さまざまな細胞株に対する本アッセイの適応性の実証。
- テストした化合物によるGIRKチャネル活性の制御の成功。
- スクリーニングにおける蛍光プレートリーダーの有効性の検証。
結論
- 開発されたこのアッセイは、GIRKチャネルを標的とした創薬にとって有用なツールとなります。
- リアルタイムスクリーニングにより、潜在的な治療薬の同定を加速させることができます。
- 同定された化合物の臨床的意義を検討するためには、さらなる研究が必要です。
よくある質問
業界における重要性
本アッセイはGIRKチャネルモジュレーターの高スループットな同定を可能にし、神経科学および心血管系創薬におけるターゲットバリデーションを支援します。リアルタイムで定量的な蛍光リードアウトを提供することで、スループットの低い電気生理学的手法への依存を減らし、ヒット化合物からリード化合物の最適化への進行を加速させます。本手法は、生理学的に適切な細胞コンテキストにおいて化合物の効果をチャネルの機能的活性に関連付けることで、初期探索における予測信頼性を向上させます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：GPCRリガンドに応答した機能的なGIRKチャネルの変調を測定することで、治療仮説を検証できる。
- 運用の価値：化合物ライブラリーの迅速なスクリーニングを可能にし、メカニズム的な特異性を持つ活性化剤または阻害剤を同定できる。
- 予測的価値：K+流出と相関する蛍光信号の変化を通じてオンターゲット活性を確認することで、ターゲットのデリスキングをサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：膜電位感受性色素（DiBAC4(3)またはHLB 021-152）を用いて、GIRK活性化時に定量可能なリアルタイム信号を生成します。
- 再現性：Z-factorの算出（優れた範囲：0.5～1.0）により、ヒット化合物の選定およびキャンペーンの再現性に対するアッセイの堅牢性を確保します。
- スケールアップ：96ウェルフォーマットおよび液体操作システム（例：Verset）に対応しており、化合物の自動分注およびスクリーニングが可能です。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性：同定されたモジュレーターは、GIRK介在性のニューロン抑制を介して、神経障害性疼痛、依存症、および心不整脈の治療戦略に寄与する可能性があります。
- トランスレーショナルな連続性：蛍光読み取りにより、ターゲットへの結合から機能的出力までの橋渡しが可能となり、前臨床段階でのフェノタイプ確定をサポートします。
- メカニズムによるリスク低減：塩化バリウムやTerapin Qなどの阻害剤を用いて特異性を確認することで、GIRK介在性効果とオフターゲット活性を区別します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、ターゲットバリデーションからリード化合物特定に至る創薬のコンティニュアムに適合しており、後続の最適化の前段階としてGIRKモジュレーターの機能的スクリーニングを可能にします。
- 探索生物学：GPCRの活性化をGIRK依存的な蛍光変化に結びつけることで仮説検証をサポートし、経路の変調を明らかにします。
- スクリーニング：標準化された色素のローディング、化合物の添加、および300秒間にわたるキネティック蛍光測定により、アッセイの即時利用性を実現します。
- 分析：定量的な従属変数（蛍光強度比）の測定値を生成し、化合物の効力および有効性の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：GIRKを介して神経興奮性を変化させる化合物を同定することで、疼痛や依存症モデルに関連する前臨床研究へとつなげます。
- エンタープライズ再利用：細胞株やGPCRリガンドを横断してプラットフォームに適応可能であり、複数のターゲットバリデーションキャンペーンにおける再利用を促進します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：イオンチャネルの薬剤スクリーニングにおけるメカニズムの曖昧さを排除することで、ターゲット変調に対する予測の信頼性を提供します。
- 運用上の価値：エンドポイントアッセイでは得られない標準化、再現性、およびリアルタイムのキネティクスデータを提供します。
- 戦略的価値：早期の機能的検証を可能にすることで、ターゲットへの結合不足による後期段階での失敗リスクを低減し、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：GIRK活性が確認された化合物の、リード最適化に向けたリスク調整後の優先順位付けを容易にします。
実施上の考慮事項
- 細胞培養（AT T20細胞）、蛍光色素の取り扱い、およびキネティックプレートリーダーの操作に関する専門知識が必要です。
- 注入機能を備えた蛍光プレートリーダー（例：Synergy 2）および互換性のある励起/蛍光波長設定（520 nm/560 nm）に依存します。
- ウェル間およびプレート間での色素のローディング、インキュベーション時間、および緩衝液条件の標準化が必要です。
- 他の細胞株に適応させるには、GIRKの発現および色素ローディング効率の検証が必要です。
- 実用的制限：GIRKを介さない蛍光変化を排除するため、直交的な阻害剤（例：Ba2+、Terapin Q）を用いてアッセイの特異性を確認する必要があります。
