Name: 培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶマウス胚性線維芽細胞の調製法。ヒト胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞の培養に適したMEFを分離・培養する標準化されたプロトコルを解説します。

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Greber らに公開されているアクチビンELISAプロトコルを設定するための博士ボリスGreberに感謝します2007。我々は、グラフィカルな概要を準備するための夫人モニカShevackに特に感謝しています。私たちは、撮影前と中にすべてのヘルプと貴重な提案のために博士ハイコ·フックスに非常に感謝しています。我々は、MEFには、CMの安定供給を維持するために特にエリーザベトSocha、アジャイ室のすべてのメンバーに感謝したい。我々はまた、永続的なサポートのためのMPIMGの動物施設で私たちの同僚を認める。本研究の一部はマックス·プランク協会によって資金を供給された[BMBF、助成金番号0315717A] ERASysBioのパートナー+ EU FP7のERA-NET Plusのスキームの下でサポートイニシアチブ。

1。マウス胚線維芽細胞の単離細胞（MEF） 次の2つの手順は、非無菌条件下で行われます。 <ol><li>頸椎脱臼により13または14 DPC（日後の交尾）で妊娠したマウス（CF1、ハーラン、米国）を生け贄に捧げる。 </li><li>子宮角を解剖し、簡単にのCa 2 +はMg 2なしでPBSを含むファルコンチューブに70％（v / v）エタノールと場所にリンス+（ギブコ社、Invitrogen社製）。 </li></ol>次の手順は無菌条件下で組織培養フード内で実施され、滅菌器を使用しています。 <ol start="3"><li>ペトリ皿に子宮角に配置し、その胎盤や胚嚢から各胚を分離します。 </li><li>頭と赤い器官を解剖し、PBSで洗浄し、きれいなペトリ皿の中ですべての胚を配置します。それはピペッティングすることが可能になるまで細かく滅菌カミソリの刃を用いて組織をミンチ。 </li><li> 0.05％トリプシン/ EDTA（Gibco社、Invitrogen社製）、合わせたもの含めるの1ミリリットルを追加します。胚あたりのDNase I（USB）の鼎100クニッツ単位。 </li><li> 50mlファルコンチューブに組織を移し、37℃で15分間インキュベート℃、インキュベーションの各5分後、完全に上下にピペッティングにより細胞を解離する。 </li><li>新たに調製したMEF培地の約1ボリュームを追加することによって、トリプシンを不活性化する。 MEF培地（成分は、メディアの500ミリリットルを加え、すべてのコンポーネントを混在させると、フィルタするため）： DMEMの450ミリリットル、FBSを50ml（10％（V / V））、200 mM L-グルタミン（1/100（v / v））を5 mlのペニシリン - ストレプトマイシンの5ミリリットル（1/100（V / v））を。 </li><li> 5分、（300×g）で、低スピードで細胞を遠心分離し、慎重に暖かいMEF培地で上清と再懸濁し、細胞ペレットを削除します。 </li><li>プレート約2時間、0.2％ゼラチン（ウシ皮膚、タイプB、シグマからゼラチン）で被覆された各T150（TPP）フラスコで3-4胚と同等であるセルの数。線維芽細胞（P0、通路0）ゼラチンコートしたフラスコにアタッチする能力を持っている唯一の細胞である。 </lI&gt; <li>理想的には、細胞は24時間後に80から90パーセントコンフルエントであり、この段階ではP0の細胞の大部分は将来の使用のために凍結されています。 </li><li>フィーダは、ヒトES細胞をreplateするか、または条件培地（CM）を生成するようにP3またはP4までP0の細胞の残りのT150フラスコ（s）を展開し、不活化して使用します。 </li></ol> 2。不活化とめっきのMEF（フィーダー細胞の調製） すべての手順は無菌条件下で組織培養フード内で行われている。 <ol><li>少なくとも2時間、室温で0.2％のゼラチンとインキュベートしたコートT150フラスコ。 </li><li>マイトマイシン、PBS中のC（1 mg / ml）とフィルタを希釈する。 </li><li> MEFのから培地を吸引除去し、Ca 2 + Mg 2 +を含まないPBSで洗浄する。 </li><li> MEFのマイトマイシンCで10μg/ mlを含む培地の代わりに20ミリリットル。 </li><li> 37℃で2時間インキュベート培地を含むマイトマイシンCとCは、その後PBS、トリプシン処理、遠心（300 xgで5分間）と、暖かい培地に再懸濁し細胞で2回洗浄する。 </li><li>次の6日間のCM制作のためのT150フラスコ、使用中の56.000細胞/ cm 2の密度で細胞とプレートを数える。 </li></ol> 3。馴化培地（CM）の準備すべての手順は無菌条件下で組織培養フード内で行われている。 <ol><li> 56.000細胞/ cm 2の密度hESCの培地でMEF培地を交換する（UM、無条件培地）で不活化したMEFをめっき後の日（0.5ミリリットル/ cm 2）とFGF2の4 ng / mlのと新たに補った。 </li><li> 24時間インキュベーションした後、フィーダーフラスコからCMを収集し、フィーダにFGF2の4 ng / mLを含有する新鮮なhESCの培地を追加します。 </li><li>次の6日間に、この手順を繰り返します。毎日の-20℃でCMを集めた</li><li> 6日には、培地とフィルター（コーニング、0.22μmの、PAS）のすべてのアリコートをミックスした後。 -80℃で50ミリリットルのアリコートとストアを行い℃の</li><li>マトリゲル上に成長したヒトES細胞に添加する前にFGF2の追加の4 ng / mlとしたCMを補足するものです。&lt;/ LI&gt; </ol> 4。培地にアクチビンの測定（ELISA）15 <ol><li>すべてのサンプルと試薬を室温に戻します。 </li><li>マイクロプレートに追加し、1％BSAを含むPBSで（ヒューマン\ MOUSE \ラットアクチビンMAB、R＆D Systems）を捕捉抗体（100μl/ウェル）、室温で一晩インキュベート希釈します。 </li><li> 24時間は、RTで1時間ブロック（1％BSA / PBS、300 /ウェル）をPBST（0.05％Tween20を含むPBS）（300μl/ウェル）をウェルに3回洗浄した後。 </li><li>この時間内に7希釈液（30 ng / mlの未満の濃度）とブランク試料を含むアクチビン（R＆D Systems）を標準曲線を、準備します。アクチビンの線形動作範囲は0.25〜32 ng / mlである。 </li><li>ウェル（100μl/ウェル）に標準とサンプルの重複を追加し、室温で2時間インキュベートします。 </li><li>井戸三回（PBST 300μl）を洗浄します。 </li><li>セカンダリ（ビオチン標識）抗体（マウス/ラット/ヒトモノクローナル抗体アクチビン、R＆Dシステムズビオチン）（0を追加します。25μg/ mlの1％BSA / PBS）と室温で2時間インキュベートします。 </li><li>井戸三回（PBST 300μl）を洗浄し、ストレプトアビジン-H​​RP（1％BSA / PBS、R＆Dシステムズ社で希釈した）を追加し、室温で20分間インキュベートします。 </li><li>井戸三回（PBST 300μl）を洗浄し、基質溶液を100μl（Quantikine、R＆Dシステムズ）を追加し、暗所で室温で30分間インキュベートする。 </li><li>各ウェルに停止液を100μl（Quantikine、R＆Dシステムズ社）を加え、穏やかに混ぜる。 </li><li>各ウェルの光学密度を決定するために、540または570 nmの波長補正で、450 nmのマイクロプレートリーダー（Molecular Devicesスペクトラマックス250、グローバル医療機器株式会社、ミネソタ州）を設定します。 </li></ol> 5。代表的な結果分離手順の全体的なスキームを図1に示されています。ヒトES細胞と異なる条件下で培養hiPSCsの典型的な形態は、 図2に示されています。の形態<html> MEFのとCMを準備するために使用不活化フィーダー細胞は、 図3に示されています。一般的に、細胞は24時間後に分離コンフルエントとフリーズしたり、展開する準備ができているはずです。しかし、時にはそれがコンフルエントに培養を取得する前に2-3日かかる場合があります。 CMが通路4としない後に細胞から調製されるべきである。初代培養細胞にのみ老化の発症前に4から5までの通路のために拡張することができますので、これは非常に重要です。 サイトカイン、アクチビンAは、多能性細胞14の未分化な成長をサポートするためにフィーダー細胞から分泌される最も重要な要因と見なされます。 CMでアクチビンのレベルの測定は、（ 図4）MEFの品質を監視するために非常に便利な定量的なアッセイである。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> 図1 MEFの分離手順の概略図。 ontent &quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> 図2（A）フィーダー細胞、（B）条件培地および（C）定義されている培地の存在下で培養した未分化ヒトES細胞の典型的な形態。 （D、E）フィーダー細胞の存在下で培養hiPSCsの典型的な形態。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> 56.000細胞/ cmの密度で3マウス胚繊維芽細胞（MEF）の典型的な形態は。二日間メッキ/分離後の（）航路0（P0）、（B）不活化フィーダー層図 2。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> 図4酵素免疫測定法（ELISA）ベースの馴化培地（CM）PRにアクチビンの濃度の測定CF1マウス系統から派生したマウス胚線維芽細胞でepared。 CMは6日のために収集し、プールした。 CM &quot;1&quot;、CM &quot;2&quot;は、メディアと無条件メディアへのUMの異なるバッチを参照してください。空調プロセスの関数としてUMでほぼ検出不可能であるアクチビン、MEFにして培地中に分泌アクチビンされています。

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<li>Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2FNodal+and+FGF+pathways+cooperate+to+maintain+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここで紹介するMEFの分離手順は、ヒトES細胞とhiPSCsための標準化された培養条件の確立を可能にします。また、フィーダー細胞によるサイトカイン産生を評価するために使用されるELISAベースのシステムは、MEF由来の馴化培地の質の有用な指標である。サポートしている線維芽細胞を提供するマウス系統（CF1）の定期的なメンテナンスは、培地のバッチ間の変動を回避するために必要です。また、細胞の一貫した品質を得るために同時に複数のマウスから胚を分離することをお勧めします。確かに新たに単離したMEFは、P0とP1で凍結保存することができます。また、不活化のMEFは、細胞培養のための要件に応じて適切な量のアリコートで凍結保存することができます。通常約250.000細胞を培養ヒトES細胞やiPS細胞への6ウェルプレートの単一ウェルに播種する必要があります。確立され、最適化されたメソッドは、定期的にdiffeの間でのばらつきを最小限に抑えることができます。実験を借りる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM（高グルコース） </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>真空フィルターシステム</td><td>コー​​ニング</td><td> 431097 </td><td> 500ミリリットル、0.22μmの、PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマ</td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウトのSerUM交換</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>シグマ</td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td>マイトマイシンC </td><td>ロシュ社</td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子</td><td>ぺプロ</td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化Anti-human/mouse/ratアクチビン抗体</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト/マウス/ラットアクチビンのMAb </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05％トリプシン-EDTA </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td>余分な薄型アイリスはさみ</td><td> FST </td><td> 14088から10 </td><td></td></tr><tr><td>エクストラファイングレーフェ鉗子</td><td> FST </td><td> 11150から10 </td><td></td></tr><tr><td> Pierse固定鉗子</td><td> FST </td><td> 18155から13 </td><td></td></tr></tbody></table>

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

一般に、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）とヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）1は、可変条件下で培養することができます。しかし、これらの細胞を培養するための効果的なシステムを確立することは容易ではありません。培養条件は、ヒトES細胞とhiPSCsの多能性付与遺伝子発現に影響を​​与えることができるので、最適化および培養方法の標準化が重要である。 hESCの樹立は、最初のフィーダー細胞とウシ胎児血清（FBS）含有培地2としてのMEFを使用して記述されていた。次に、FBSはノックアウト血清代替物（KSR）、およびヒトES 3の増殖を促進するFGF2、置き換えられました。最後に、フィーダーフリーの培養システムは、KSR含有馴化培地を細胞（MEFによって条件付け培地4）にマトリゲルをコートしたプレート上で細胞培養を可能にします。その後、ヒトES細胞の培養条件は、化学的にdefinでフィーダーフリーの培養に向かって移動したEDの条件は5-7。また、異種フリーコンポーネントを使用して、病原体と動物性タンパク質の培養法による潜在的な汚染を避けるために、8を確立されている。 改良された条件を取得するには、マウスフィーダー細胞は、ヒト細胞株（例えば、胎児の筋肉や皮膚細胞9、大人の皮膚細胞10、包皮線維芽細胞11-12、羊膜間葉系細胞13）に置き換えられています。しかし、ヒト包皮線維芽細胞由来のフィーダーレイヤーを使用して未分化ヒトES細胞を維持するための効率は14アクチビンの分泌の低いレベルのために、マウスフィーダー細胞からのそれと同じくらい高くはありません。明らかに、マウスとヒトのフィーダー細胞による成長因子の産生で明らかに違いがあります。 マウスとヒトのフィーダー細胞のトランスクリプトームの解析は支持と非支持細胞の間に有意差を明らかにした。外因性のFGF2はmaintaiために重要ですヒトES細胞とhiPSCsの自己再生寧と、フィーダー細胞のTGFβ1、アクチビンAとグレムリン（BMP拮抗薬）の発現を調節する重要な因子として同定されている。アクチビンAは、ヒトES細胞15から16にOCT4、SOX2、NANOGとの発現を誘導することが示されている。 長期培養では、ヒトES細胞とhiPSCsは、その未分化状態を維持するために、有糸分裂不活性化されたMEFまた​​はマトリゲルをコートしたプレート上でMEF-CM（MEF-馴化培地）でフィーダーフリーの条件下で成長させることができる。彼らは直接ヒトES細胞の成長に影響を与えるので、両方の培養条件の成功は、完全に、フィーダー細胞の品質に依存します。 ここでは、メディア内のアクチビンのレベルを評価するために、マウス胚性線維芽細胞（MEF）の単離および培養のために最適化された方法、条件培地（CM）と酵素免疫測定法（ELISA）の調製を示す。

マウス胚性線維芽細胞（MEF）の品質は、例えば、CF-1のようなマウスの右歪みによって決定されます。これらから得られた多能性·支持のMEFと馴化培地（CM）が共同で動作可能な自己再生および多能性を維持するために、アクチビン/ノードおよびFGF経路に必要なアクチビンA、グレムリンとTGFβ1の最適な濃度を含める必要があります。

一般的に、ヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）は、さまざまな条件下で培養することが可能です。しかしながら、それは…

この手順の全体的な目的は、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養に適したマウス胚性線維芽細胞を調製することです。まず、各胚を分離し、頭部と赤色臓器を除去します。次に、組織を細切し、消化させることでこれを達成します。その後、1つのフラスコにつき3〜4個の胚を播種し、細胞を拡大培養します。最終的に、不活性化したmythsを用いてコンディショニング培地を調製します。最終的に、e LSAを用いて、多能性幹細胞の未分化状態での増殖を維持するために、コンディショニング培地内で活性成分が至適濃度であることを示します。一般的に、この手法に不慣れな方は、高品質なマウス胚線維芽細胞を作製するために手順を標準化させる必要があるため、苦労することがあります。この高品質な細胞を用いることで、ヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の両方を未分化状態で増殖させることが可能になります。マウス胚の取り扱いには特定の手技が必要であり、胚の分離および解剖のステップを習得することは困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるJustina Suk博士と、大学院生のCaterina Dresが行います。交配後13日または14日の妊娠マウスを犠牲にして子宮角を摘出した後、70% ethanolで軽くすすぎ、組織培養フード内で無菌状態でPBSを含むFalconチューブに入れます。子宮角をペトリ皿に移し、各胚を胎盤および胚膜から分離します。頭部と赤い臓器を除去し、残りの胚の断片をPBSで洗浄し、滅菌カッターを用いて清潔なペトリ皿に移します。最後に、ピペットで吸引できるようになるまで組織を細かく刻みます。次に、0.05% trypsin-EDTA 1 mLおよび胚1個あたり100 K unitsのDNase Iを加えます。その後、組織を50 mL Falconチューブに移し、37 °Cで15分間インキュベートします。5分間のインキュベーションごとに、ピペッティングを十分に行い、細胞を解離させます。 freshly prepared meth.Mediumを約1容量分加えて、トリプシンを不活化します。低速で5分間、細胞を遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを温めたmeth培地で再懸濁します。0.2%ゼラチンコートしたフラスコを用意し、少なくとも2時間インキュベートします。室温で、約3〜4個の胚から得られた細胞を、それぞれの0.2%ゼラチンコートフラスコに播種します。線維芽細胞のみが、ゼラチンコートフラスコに接着する能力を持っています。約24時間後、細胞が80〜90%のコンフルエンスに達したら、一部の細胞を-80 °Cで凍結します。今後の使用に備え、残りの細胞をP3またはP4まで継代して拡大します。P3またはP4の細胞を用いてフィーダー細胞を調製するには、まずT150フラスコを0.2%ゼラチンでコーティングし、室温で少なくとも2時間インキュベートします。mitomycin CをPBSで希釈し、シリンジフィルターでろ過します。mediumを吸引して除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで洗浄します。10 µg/mLのmitomycin Cを含むmedium 20 mLを加え、37 °Cで2時間インキュベートします。次に、細胞をPBSで2回洗浄し、トリプシン処理します。インキュベーション後、細胞をmeth培地で再懸濁し、遠心分離して集細胞させた後、温めたmeth培地で再度懸濁します。T150フラスコに1cm²あたり56,000個の密度で細胞を播種し、meth細胞の播種翌日に一晩インキュベートします。培養液を、新鮮な 4 ng/mL の FGF2 を添加した HESC 非条件化培地（unconditioned medium）に交換し、37 °C のインキュベーターで培養します。24 時間後、フラスコから条件化培地を回収し、新鮮な HESC 培地に交換します。回収した培地は -20 °C で保存します。6回目の回収後、合計6日間この回収を繰り返します。すべての培地を合わせてろ過します。その後、50 mLずつ分注し、-80 °Cで保存します。コンディショニング培地中のactive in aを測定するために、すべてのサンプルと試薬を室温に戻します。1% BSA含有PBSでactive in a抗体を希釈し、マイクロプレートのウェルに100 µLずつ分注します。室温で一晩（24時間）インキュベートします。ウェルをPBSTで3回洗浄します。その後、室温で1時間、ウェルをブロッキングします。その間に、0.25から32 nanograms per milliliterの作動範囲を用いて、7段階の希釈系列とブランクサンプルを含む標準曲線を作成します。標準物質とサンプルの重複分をウェルに添加し、室温で2時間インキュベートします。PBSTでウェルを3回洗浄します。次に、ビオチン化二次抗体を添加し、室温で2時間インキュベートします。その後、ウェルをPBSTで3回洗浄し、ストレプトアビジンHRPを添加します。混合して基質を添加した後、遮光のため壁面を覆い、室温で20分間インキュベートします。各ウェルに100 µLの停止液を添加し、静かに混合します。最後に、マイクロプレートリーダーを波長50 nmに設定し、540 nmまたは570 nmで波長補正を行い、示された各ウェルの吸光度を測定します。ここでは、フィーダー細胞を含む培地、条件付け培地、および限定培地で培養した未分化hESCの典型的な形態を示します。これらの例では、HI PSCをフィーダー細胞の存在下で培養しています。これらの画像は、調製培地の作成に使用されるmythsおよび不活化フィーダー細胞の形態を示しています。一般的に、細胞は分離から24時間後にコンフルエントになり、凍結または拡大培養が可能な状態になります。ただし、コンフルエントな培養状態を得るまでに2〜3日かかる場合があります。条件培地は、継代4代までの細胞から調製してください。初代細胞は、老化が始まるまで4〜5代までしか継代できないため、これは非常に重要です。aに活性が含まれるサイトカインは、多能性細胞の未分化状態での増殖を維持するために、フィーダー細胞から分泌される最も重要な因子の1つと考えられています。ここで示すように、調整培地中の活性レベルを測定することは、metsの品質をモニターするための便利な定量的アッセイです。適切に実施すれば、マウス胚性線維芽細胞の単離は、習得後1〜2時間で行うことができます。この手順を試みる際は、あらかじめ動物を繁殖させ、すべての器具を準備してオートクレーブ sterilization しておくことが重要です。

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