培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

この手順の全体的な目的は、ヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養に適したマウス胚性線維芽細胞を調製することです。まず、各胚を分離し、頭部と赤色臓器を除去します。次に、組織を細切し、消化させることでこれを達成します。

その後、1つのフラスコにつき3〜4個の胚を播種し、細胞を拡大培養します。最終的に、不活性化したmythsを用いてコンディショニング培地を調製します。最終的に、e LSAを用いて、多能性幹細胞の未分化状態での増殖を維持するために、コンディショニング培地内で活性成分が至適濃度であることを示します。

一般的に、この手法に不慣れな方は、高品質なマウス胚線維芽細胞を作製するために手順を標準化させる必要があるため、苦労することがあります。この高品質な細胞を用いることで、ヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の両方を未分化状態で増殖させることが可能になります。マウス胚の取り扱いには特定の手技が必要であり、胚の分離および解剖のステップを習得することは困難であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが不可欠です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のポストドクターであるJustina Suk博士と、大学院生のCaterina Dresが行います。

交配後13日または14日の妊娠マウスを犠牲にして子宮角を摘出した後、70% ethanolで軽くすすぎ、組織培養フード内で無菌状態でPBSを含むFalconチューブに入れます。子宮角をペトリ皿に移し、各胚を胎盤および胚膜から分離します。頭部と赤い臓器を除去し、残りの胚の断片をPBSで洗浄し、滅菌カッターを用いて清潔なペトリ皿に移します。

最後に、ピペットで吸引できるようになるまで組織を細かく刻みます。次に、0.05% trypsin-EDTA 1 mLおよび胚1個あたり100 K unitsのDNase Iを加えます。その後、組織を50 mL Falconチューブに移し、37 °Cで15分間インキュベートします。

5分間のインキュベーションごとに、ピペッティングを十分に行い、細胞を解離させます。 freshly prepared meth.Mediumを約1容量分加えて、トリプシンを不活化します。低速で5分間、細胞を遠心分離します。

上清を慎重に取り除き、ペレットを温めたmeth培地で再懸濁します。0.2%ゼラチンコートしたフラスコを用意し、少なくとも2時間インキュベートします。室温で、約3〜4個の胚から得られた細胞を、それぞれの0.2%ゼラチンコートフラスコに播種します。線維芽細胞のみが、ゼラチンコートフラスコに接着する能力を持っています。

約24時間後、細胞が80〜90%のコンフルエンスに達したら、一部の細胞を-80 °Cで凍結します。今後の使用に備え、残りの細胞をP3またはP4まで継代して拡大します。P3またはP4の細胞を用いてフィーダー細胞を調製するには、まずT150フラスコを0.2%ゼラチンでコーティングし、室温で少なくとも2時間インキュベートします。

mitomycin CをPBSで希釈し、シリンジフィルターでろ過します。mediumを吸引して除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで洗浄します。10 µg/mLのmitomycin Cを含むmedium 20 mLを加え、37 °Cで2時間インキュベートします。

次に、細胞をPBSで2回洗浄し、トリプシン処理します。インキュベーション後、細胞をmeth培地で再懸濁し、遠心分離して集細胞させた後、温めたmeth培地で再度懸濁します。T150フラスコに1cm²あたり56,000個の密度で細胞を播種し、meth細胞の播種翌日に一晩インキュベートします。

培養液を、新鮮な 4 ng/mL の FGF2 を添加した HESC 非条件化培地（unconditioned medium）に交換し、37 °C のインキュベーターで培養します。24 時間後、フラスコから条件化培地を回収し、新鮮な HESC 培地に交換します。回収した培地は -20 °C で保存します。

6回目の回収後、合計6日間この回収を繰り返します。すべての培地を合わせてろ過します。その後、50 mLずつ分注し、-80 °Cで保存します。

コンディショニング培地中のactive in aを測定するために、すべてのサンプルと試薬を室温に戻します。1% BSA含有PBSでactive in a抗体を希釈し、マイクロプレートのウェルに100 µLずつ分注します。室温で一晩（24時間）インキュベートします。

ウェルをPBSTで3回洗浄します。その後、室温で1時間、ウェルをブロッキングします。その間に、0.25から32 nanograms per milliliterの作動範囲を用いて、7段階の希釈系列とブランクサンプルを含む標準曲線を作成します。

標準物質とサンプルの重複分をウェルに添加し、室温で2時間インキュベートします。PBSTでウェルを3回洗浄します。次に、ビオチン化二次抗体を添加し、室温で2時間インキュベートします。

その後、ウェルをPBSTで3回洗浄し、ストレプトアビジンHRPを添加します。混合して基質を添加した後、遮光のため壁面を覆い、室温で20分間インキュベートします。各ウェルに100 µLの停止液を添加し、静かに混合します。

最後に、マイクロプレートリーダーを波長50 nmに設定し、540 nmまたは570 nmで波長補正を行い、示された各ウェルの吸光度を測定します。ここでは、フィーダー細胞を含む培地、条件付け培地、および限定培地で培養した未分化hESCの典型的な形態を示します。これらの例では、HI PSCをフィーダー細胞の存在下で培養しています。

これらの画像は、調製培地の作成に使用されるmythsおよび不活化フィーダー細胞の形態を示しています。一般的に、細胞は分離から24時間後にコンフルエントになり、凍結または拡大培養が可能な状態になります。ただし、コンフルエントな培養状態を得るまでに2〜3日かかる場合があります。

条件培地は、継代4代までの細胞から調製してください。初代細胞は、老化が始まるまで4〜5代までしか継代できないため、これは非常に重要です。aに活性が含まれるサイトカインは、多能性細胞の未分化状態での増殖を維持するために、フィーダー細胞から分泌される最も重要な因子の1つと考えられています。

ここで示すように、調整培地中の活性レベルを測定することは、metsの品質をモニターするための便利な定量的アッセイです。適切に実施すれば、マウス胚性線維芽細胞の単離は、習得後1〜2時間で行うことができます。この手順を試みる際は、あらかじめ動物を繁殖させ、すべての器具を準備してオートクレーブ sterilization しておくことが重要です。