Name: ポリビニルアルコールスポンジモデル注入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学ぶポリビニルアルコールスポンジを用いたマウス創傷治癒モデルの構築法。無菌操作によるスポンジの水和・滅菌、腹部皮下への移植、治療薬の局所投与、組織学的・定量的解析までの一連の手順を解説します。

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PPYへの退役軍人優秀賞、国立衛生研究所（NIH）助成金R01-HL088424によって提供された資金。

1。スポンジの準備<ol><li> 0.9％（w / v）の塩化ナトリウム水溶液中で一晩撹拌することによって水和物スポンジ。 </li><li>それらをオートクレーブ水和スポンジを殺菌。 75mLの、121℃25分間オートクレーブ℃で</li></ol>注：後述するように治療を読み込んでいますスポンジはオプションです。 <ol start="3"><li>滅菌器と滅菌フードでは、ピンセットを用いた溶液から一スポンジを拾う。ピンセットでスポンジを絞るとスポンジからできるだけ多くのソリューションを削除するには、真空チップを使用しています。スポンジの間にスペースを残すように注意して、組織培養皿の中でスポンジ絞っ配置します。複数のウェルプレートは、さまざまな治療法を区切るために使用することができます。 </li><li>直接スポンジの中央に処理液をピペットで。溶液がスポンジ上に配置された後、ピペットチップでスポンジを軽く押し、これはスポンジが溶液を吸収するのに役立ちます。注：6ミリメートル我々が採用している2.75ミリメートルの厚さのスポンジで直径は25μLの最大値を保持することができます。 </li><li>すべてのスポンジがロードされたら彼らはマウスに移植されるまで、彼らがしているプレートを氷上に保存することができます。 </li></ol> 2。外科的処置<ol><li>適切に動物を麻酔し、先制鎮痛薬を管理します。全体の手順では、動物ごとに約20分続く。 30グラムのマウスにイソフルラン1.5％の酸素毎分1.5リットルは、麻酔を誘導し、維持するために使用されます。動物は、もはやピンチ反射テスト、仰臥位でのノーズコーン内の場所に応答しないとき。胸郭の下下腹側領域に1インチで1インチ剃る、電気シェーバーを使用しています。カット髪の汚れを拭きとってください。 </li><li> 70％のアルコールが続いbetadine洗浄によって剃らエリアを殺菌。このbetadineアルコール洗浄を3回繰り返します。 </li><li>教えて肌を保持しながら、1.5〜2倍径の垂直切開を作るためにメスを使用しスポンジのメーターは体腔を切断しないように慎重にされて、挿入される。 </li><li>皮の端を保持するためにピンセットを使ってゆっくりとMetzembaumはさみを使用して切開の両側にある筋肉から皮膚を分離し始める。ポケットは、マウスの幅を横切って移動して、胸郭から後ろ足にする必要があります。 </li><li>両側からつまんで動物に置かれる最初のスポンジをピックアップしてピンセットを使用しています。それは上部と下部から開催されるように、ストレートピンセットにスポンジを転送します。 </li><li>皮の端を保持し、スポンジを挿入することができますので、それを持ち上げるためにピンセットを使用しています。ゆっくりとスポンジは、それが組織に触れた後に移動することは困難であるように下に皮膚や筋肉に触れないようにしようとしているスポンジを挿入します。すべてのスポンジに対して、この手順を繰り返します。 </li><li>すべてのスポンジが挿入された後、切開を閉じて二、三の縫合糸を配置します。一緒に切開の両側を保持し、スツに糸をピンセットのペアを使用する皮膚の両方の層を介して再び。だけで十分な皮膚の端を閉じるには、スローを最初に締めます。他の方向から複数の投、タイトな結び目を引っ張ってこの時間を持つ方形結び目を終了します。その後、縫合します（ 図2）を終了する2つの正方形の結び目を結ぶ。全体の切開を閉じるには、追加の縫合糸を配置します。他の傷ボンディング方法は、そのようなdermabond、創傷クリップやホッチキスの針として使用することができます。 </li><li>麻酔システムから動物を除去し、意識が再開されている間監視します。動物はすぐにambulating開始し、手術前のモビリティに戻す必要があります。彼らは十分に食物と水に到達することができていることを保証します。いくつかの湿らせた食品は、回復を支援するために、ケージの底に置かれるかもしれません。苦痛や不快感の徴候のために毎日動物を監視し続け、感染症、炎症、裂開のために切開部位を確認してください。回復への合併症が見つかった場合は適切な処置を行ってください。 </li></ol> 3。任意のインジェクション<ol><li>望ましい解決策でスポンジを注入するには、まずマウスに投与する物質の量を決定します。物質は、注入量は半分以下の総量スポンジが保持できるとなるように濃縮する必要があります。 </li><li> （マウスのために我々は28 G針を使用）注射用シリンジを準備します。 </li><li>麻酔下で注射を受けるために動物を配置します。 </li><li>動物はもはやピンチテストに応答しないときに注射を与えることができます。 </li><li>注射をするには、スポンジの中心に45°の角度徹底した皮膚に針を押してください。その後、半分だけの道を進んでスポンジに針を押すその厚さを通して。目標は、スポンジの正確な中心部に注入することです。 </li><li>針がスポンジであることを確認する確認するには、ゆっくりと垂直に針を持ち上げます。針がスポンジになっている場合は、スポンジには針で上に移動する必要があります。 </li><li>ゆっくりとスポンジに注入し、針を削除します。注射を必要とする複数のスポンジがある場合はそれが注入された流体の一部は、注射の前のサイトから押し出さされる可能性があります。 </li></ol> 4。スポンジの取り外し注意：スポンジの削除中に、余分な注意してスポンジを処理します。手術器具とスポンジを貫通して回避し、周囲の組織の主要な動脈を避けることによって、スポンジに過度の出血を防ぐことができます。 <ol><li>動物は安楽死された後、ピンセットを使って肌を保持していると切開はスポンジを閉じることにより、スポンジを削除します。 </li><li>周囲のカプセルからスポンジを慎重に分離<html> ndはスポンジを囲む余分な組織を採取することは避けてください。そのような薬物送達または形態計測などのアッセイについては、以下の精度は切除が必要となります。 </li></ol> 5。代表的な結果削除スポンジが実行されます分析の種類に応じて、異なる条件の下で保存することができます。切片については、取得したスポンジは、そのような最適な切削温度（OCT）の化合物として凍結用培地に埋め込 ​​むことができますまたはパラフィンブロック（ 図3AおよびB）に埋め込 ​​むとセクショニングの10％ホルマリンに配置されます。スポンジ直径に対して半分にカットします（ 図4AおよびB）切断面を下に埋め込 ​​まれている場合セクショニングの最良の結果が得られます。スポンジのその全体の幅が存在しているので、スポンジのセクションを払う必要があります。 図3Aは、2つのスポンジを示し、左側のスポンジは、埋め込 ​​まれた/切片間違って、右側のスポンジが正しく処理されました。 ENT &quot;&gt;分析では、スポンジをエッペンドルフチュー​​ブに配置することができ、処理の準備が整うまで-20℃で保存したRNAおよび定量的リアルタイムPCR解析のスポンジは、エッペンドルフチュー​​ブ、フラッシュ凍結に置かれ、で保存してください。 - さらに、80℃は、このようなQIAGENからRNAlater中のようなRNA防腐剤は、高い温度で安全に保管するためのRNAを安定化させるために使用することができます。創傷流体はチューブ上のスポンジを絞ることによって収集し、から流体をまとめてプールすることができます代表的なサンプルを得るために複数のスポンジなど線維芽細胞、マクロファージ、リンパ球などの生細胞もまた、スポンジから抽出することができます。動物から除去した後、スポンジは、細胞の所望のタイプのために適切なメディアで行われることができます。スポンジができる物理（ミンチIE）または酵素（すなわち、コラゲナーゼ）メソッドによってセルを解放するために処理されます。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3885/3885fig1.jpg" /> 図1脱水3つの異なるサイズのテッドPVAスポンジディスク。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3885/3885fig2.jpg" /> 図2：横傷や4 PVAスポンジの位置を示すマウス創傷治癒モデルのイメージ。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3885/3885fig3.jpg" /> 図3。 4倍速での（A）H＆E染色切片パラフィン埋め込 ​​まれたスポンジの10倍に（B）トリクローム染色。 <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3885/3885fig4.jpg" /> 図4を参照。 （A）の直径に沿って半分にスポンジのカットのイメージ。（B）PVAスポンジの半分、10月にサイドを切り倒し埋め込 ​​まれた。

<ol><li>Efron, D. T., Barbul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+sponge+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous sponge models.</a> Methods Mol. Med. 78, 83-93 (2003).</li>
<li>Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+use+in+wound+healing+research%3A+a+survey+focusing+on+in+vitro+and+in+vivo+adult+soft+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue.</a> Wound Repair. 8, 83-96 (2000).</li>
<li>Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+growth+factors+in+vivo.+I.+Cell+ingrowth+into+porous+subcutaneous+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers.</a> Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).</li>
<li>Alaish, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+polyvinyl+alcohol+sponge+and+expanded+polytetrafluoroethylene+subcutaneous+implants+as+models+to+evaluate+wound+healing+potential+in+human+beings%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair%22%5BJournal%5D)">Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings.</a> Wound Repair. 3, 292-298 (1995).</li>
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<li>Alfaro, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sFRP2+suppression+of+bone+morphogenic+protein+%28BMP%29+and+Wnt+signaling+mediates+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+self-renewal+promoting+engraftment+and+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair.</a> J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).</li>
<li>Andrade, S. P., Ferreira, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sponge+implant+model+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The sponge implant model of angiogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).</li>
<li>Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subcutaneous+implant+for+wound+healing+studies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">A subcutaneous implant for wound healing studies in humans.</a> J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).</li>
<li>Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+studying+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">A novel method of studying wound healing.</a> J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).</li>
<li>Lindblad, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+selecting+the+correct+animal+model+for+dermal+wound-healing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

<p class="jove_content"&gt;創傷治癒のスポンジモデルは複数のバリエーションを持っています。それは、ヒトやスポンジなど、多くの異なる種で行うことができることも背に移植することができます<sup&gt; 1,2,8</sup&gt;。人間と他のいくつかの種の研究では、スポンジはカプセル化されてからスポンジを防止し、除去の容易さを許可するために多孔質シリコンチューブ内に配置する必要があるかもしれません<sup&gt; 4,8</sup&gt;。スポンジ注入の位置は、所望の結果、技術者のスキルに基づいて変更することができます。背注入は腹インプラントは腹腔まで切断の可能性に起因するより困難である一方スポンジは、皮膚の下に移動させることができます。薬物送達は、複数の注射の必要性を排除し、定数、制御されるようにスポンジは、カテーテルを使用して設定することができます<sup&gt; 9</sup&gt;。小さく、筒状のスポンジにも針を通して注入することができます<sup&gt; 8</sup&gt;。スポンジ &#39;の組成は、ポリビニルアルコールに限定されません。彼らは排他的に多くの材料から、または組み合わせて調製することができる<sup&gt; 7</sup&gt;。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;これは、スポンジの調製と一貫して正しく理解されるように動物の配置のために重要である。スポンジがシートからカットされている場合、それらは比較のために同様の重量でなければなりません。スポンジは、細胞や治療をロードする場合は、それぞれのスポンジに置か量が正確でなければなりません。治癒過程は、ヘッドからの距離が増加すると減少し、動物と癒しのスポンジの配置位置に基づいて異なる場合があります<sup&gt; 1,10</sup&gt;。</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> のコメント </td></tr><tr><td> PVAスポンジ</td><td>メドトロニック</td><td> CF120 </td><td>スポンジの大きさと気孔率は、実験に依存して</td></tr><tr><td>手術用メスの刃のサイズ15 </td><td>内側BD </td><td> 371115 </td><td></td></tr><tr><td> Metzembaumはさみ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 79から211 </td><td></td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 13004から14 </td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 12004から16 </td><td></td></tr><tr><td> 5から0ナイロン縫合糸</td><td> Ethilon </td><td> 698 </td><td></td></tr><tr><td> 10月compouND </td><td>組織 - Tek社</td><td> 4583 </td><td></td></tr></tbody></table>

ポリビニルアルコールスポンジモデル注入

The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

創傷治癒は、多くの種類の細胞、成長因子と1-3化合物を含む複雑な、多段階のプロセスです。生体内で行われたときにこの複雑さのために、創傷治癒の研究では、最も包括的である。 in vivoで切開、切除、デッドスペースを含む急性創傷治癒を研究に利用できるモデル、および火傷の多くがあります。デッドスペースモデルは、組織形成や創傷上の物質の影響を研究するために使用される人工の多孔質インプラントである。一般的に使用されるデッドスペースモデルのいくつかは、ポリビニルアルコール（PVA）スポンジ、スチールワイヤーメッシュシリンダー、拡大ポリテトラフルオロエチレン（ePTFEの）材料、およびCellstick 1,2が含まれています 。 各デッドスペースモデルでは、その材料の組成や注入方法に基づいて独自の制限があります。スチールワイヤーメッシュシリンダーモデルは移植後浸潤の誘導期があり、肉芽組織形成begiまでの時間の長い時間を必要とするNS 1。創傷治癒の後の段階では最高のePTFEモデル1,4を用いて分析されています。 Cellstickは、通常、人間の手術の傷を調べるために使用され、流体2を巻かれているシリコンチューブモデル内のセルローススポンジです。時間の経過とともにそれは動物の5の巨細胞反応を引き起こす異物反応を引き起こすために開始されますので、PVAスポンジは、急性試験に限定されています。他の材料とは異なり、PVAスポンジを挿入、削除、不活性、非生分解性材料で作られており、まだ組織学的分析2,5のために切片であることが十分に柔らかくするのは簡単です。 傷口にPVAスポンジを癒すと、肉芽組織の形成を分析するために非常に有用である、コラーゲン沈着、創傷流体組成、癒しのプロセス1,2,5上の物質の影響。創傷治癒の属性の広い配列を研究する上での使用に加えて、PVAスポンジは、研究の多くは他のタイプで使用されています。それはHとして腫瘍血管新生、薬物送達や幹細胞の生存および生着1,2,6,7を調査するために利用されて。その偉大な可変性、事前の広範な使用、および再現性のある結果では、PVAスポンジは、多くの研究1,2の理想的なモデルです。 ここでは、準備、注入および創傷治癒のマウスモデルにおけるPVAスポンジディスク（ 図1）の検索について説明します。

薬、成長因子、および/または創傷治癒の動物モデルで操作された細胞の効果を分析する上で有用なツールが記載されています。この手法は、提供し、含まれている所望の処置をも切除し、分析するためのプラットフォームを提供するために、ポリビニルアルコール（PVA）スポンジの特性を利用しています。

創傷治癒は、多くの細胞型、成長因子、および化合物が関与する、複雑な多段階のプロセスである1-3。この複雑さゆえに、創傷治癒は...

本手順の目的は、ポリビニルアルコールスポンジを用いてマウスの創傷治癒モデルを作製することです。まず、スポンジを水和させ、移植用に薬剤などを担持させます。次に、マウスの腹筋と皮膚の間のポケットにスポンジを挿入します。移植後、各スポンジに治療薬を注入できます。最終ステップは、マウスからスポンジを取り出すことです。最終的に、切片作成、染色、および定量分析を行うことで、創傷治癒過程における変化や変動を観察することが可能です。この手法は創傷治癒に関する知見を得るだけでなく、腫瘍血管新生、ドラッグデリバリー、移植細胞の生存および生着といった他の研究分野にも応用可能です。まず、0.9%塩化ナトリウム水溶液中で一晩撹拌し、スポンジを水和させます。次に、水和させたスポンジ懸濁液75 millilitersを、121 degrees Celsiusで25分間オートクレーブで滅菌します。スポンジを滅菌するには、オートクレーブ滅菌済みのスポンジ溶液を滅菌フード内に置き、滅菌ピンセットでスポンジを1つ取り出します。ピンセットでスポンジを絞り、バキュームチップを用いてスポンジから可能な限り溶液を除去します。次に、絞ったスポンジを組織培養プレートに配置します。この際、スポンジ同士の間に間隔を空けるように注意し、処理溶液をスポンジの中央に直接ピペットで滴下します。その後、ピペットチップでスポンジを軽く押し、スポンジに溶液を吸収させます。すべてのスポンジをロードしたら、マウスに移植するまでプレートを氷上に保存します。ピンチリフレックス試験で鎮静を確認した後、マウスを仰向けにしてノーズコーンに固定します。次に、電気シェーバーを用いて、マウスの肋骨より下の腹側下部の1インチ×1インチの範囲の被毛を除去します。その後、切った毛を拭き取って清潔にします。剃毛部位をベタジンで滅菌し、続いて70%alcoholで消毒します。次に、皮膚をピンと張った状態で保持します。メスを使用して、挿入するスポンジの直径の1.5倍から2倍の長さの垂直切開を行います。この際、体腔まで切断しないように注意してください。ピンセットを使用して皮膚の端を把持します。次に、メッツェンバウム剪刀を用いて、切開線の両側で皮膚を筋肉からゆっくりと剥離させます。ポケットをマウスの幅全体に広げ、肋骨から後肢まで拡張します。ここで、ピンセットで最初に動物内に留置するスポンジを側面から挟んで持ち上げます。次に、スポンジをストレートピンセットで上下から挟むようにして保持します。続いて、別のピンセットで皮膚の端を掴んで持ち上げ、皮膚やその下の筋肉に触れないように注意しながら、ゆっくりとスポンジを挿入します。すべてのスポンジを挿入したら、ピンセットで切開部の両端を寄せ、皮膚の2層を貫通するように縫合糸を通します。皮膚の縁が閉じる程度に最初の投げ結びを締め、反対方向にもう一度投げ結びを行い、スクエアノットを完成させます。このとき、結び目をしっかりと締め付けます。その後、さらに2つのスクエアノットを結んで縫合を完了します。切開部全体を閉じるために、さらに縫合を行います。最後に、動物を麻酔システムから外し、意識が回復するまで観察します。マウスは速やかに歩行を開始し、術前の可動性に戻るはずです。まず、シリンジに目的の溶液を満たし、28ゲージの針を装着します。次に、足指のピンチテストで鎮静を確認した後、スポンジの中央の皮膚から45度の角度で針を刺入し、針が確実にスポンジ内にあるようにします。その後、ゆっくりと垂直に針を引き上げます。針がスポンジに入っている場合、スポンジは針と一緒に上昇します。次に、物質をゆっくりとスポンジに注入し、針を抜きます。動物を安楽死させた後、ピンセットで皮膚を固定し、目的のスポンジの近くを切開します。最後に、採取したスポンジの周囲に余分な組織を含めないよう注意しながら、周囲のカプセルから慎重に分離します。スポンジは、実施する解析の種類に応じて異なる条件下で保存できます。切片作成の場合、回収したスポンジをOCTコンパウンドなどの凍結包埋剤で包埋するか、あるいは本実験のH&E染色スポンジで行ったように、10% formalinに浸漬してパラフィンブロックに包埋し切片を作成します。三輻海綿の染色済み標本において、最適な切片を作成するには、ここに示すように海綿を直径に沿って半分に切り、切り出した面を下にして包埋します。ここで実演している通り、この図のように海綿の全幅が含まれるように切片を作成してください。左側の海綿は、切片の右端に沿って組織の境界が乱れていることからわかるように、包埋または切断が不適切に行われています。一方、右側の無傷の海綿は正しく処理されています。このビデオを視聴することで、マウスにおける創傷治癒を研究するためのポリビニルアルコールスポンジの調製、植込、注入、および除去の方法について十分に理解することができます。

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