ポリビニルアルコールスポンジモデル注入

本手順の目的は、ポリビニルアルコールスポンジを用いてマウスの創傷治癒モデルを作製することです。まず、スポンジを水和させ、移植用に薬剤などを担持させます。次に、マウスの腹筋と皮膚の間のポケットにスポンジを挿入します。

移植後、各スポンジに治療薬を注入できます。最終ステップは、マウスからスポンジを取り出すことです。最終的に、切片作成、染色、および定量分析を行うことで、創傷治癒過程における変化や変動を観察することが可能です。

この手法は創傷治癒に関する知見を得るだけでなく、腫瘍血管新生、ドラッグデリバリー、移植細胞の生存および生着といった他の研究分野にも応用可能です。まず、0.9%塩化ナトリウム水溶液中で一晩撹拌し、スポンジを水和させます。次に、水和させたスポンジ懸濁液75 millilitersを、121 degrees Celsiusで25分間オートクレーブで滅菌します。

スポンジを滅菌するには、オートクレーブ滅菌済みのスポンジ溶液を滅菌フード内に置き、滅菌ピンセットでスポンジを1つ取り出します。ピンセットでスポンジを絞り、バキュームチップを用いてスポンジから可能な限り溶液を除去します。次に、絞ったスポンジを組織培養プレートに配置します。この際、スポンジ同士の間に間隔を空けるように注意し、処理溶液をスポンジの中央に直接ピペットで滴下します。その後、ピペットチップでスポンジを軽く押し、スポンジに溶液を吸収させます。

すべてのスポンジをロードしたら、マウスに移植するまでプレートを氷上に保存します。ピンチリフレックス試験で鎮静を確認した後、マウスを仰向けにしてノーズコーンに固定します。次に、電気シェーバーを用いて、マウスの肋骨より下の腹側下部の1インチ×1インチの範囲の被毛を除去します。

その後、切った毛を拭き取って清潔にします。剃毛部位をベタジンで滅菌し、続いて70%alcoholで消毒します。次に、皮膚をピンと張った状態で保持します。

メスを使用して、挿入するスポンジの直径の1.5倍から2倍の長さの垂直切開を行います。この際、体腔まで切断しないように注意してください。ピンセットを使用して皮膚の端を把持します。

次に、メッツェンバウム剪刀を用いて、切開線の両側で皮膚を筋肉からゆっくりと剥離させます。ポケットをマウスの幅全体に広げ、肋骨から後肢まで拡張します。ここで、ピンセットで最初に動物内に留置するスポンジを側面から挟んで持ち上げます。

次に、スポンジをストレートピンセットで上下から挟むようにして保持します。続いて、別のピンセットで皮膚の端を掴んで持ち上げ、皮膚やその下の筋肉に触れないように注意しながら、ゆっくりとスポンジを挿入します。すべてのスポンジを挿入したら、ピンセットで切開部の両端を寄せ、皮膚の2層を貫通するように縫合糸を通します。

皮膚の縁が閉じる程度に最初の投げ結びを締め、反対方向にもう一度投げ結びを行い、スクエアノットを完成させます。このとき、結び目をしっかりと締め付けます。その後、さらに2つのスクエアノットを結んで縫合を完了します。

切開部全体を閉じるために、さらに縫合を行います。最後に、動物を麻酔システムから外し、意識が回復するまで観察します。マウスは速やかに歩行を開始し、術前の可動性に戻るはずです。

まず、シリンジに目的の溶液を満たし、28ゲージの針を装着します。次に、足指のピンチテストで鎮静を確認した後、スポンジの中央の皮膚から45度の角度で針を刺入し、針が確実にスポンジ内にあるようにします。その後、ゆっくりと垂直に針を引き上げます。

針がスポンジに入っている場合、スポンジは針と一緒に上昇します。次に、物質をゆっくりとスポンジに注入し、針を抜きます。動物を安楽死させた後、ピンセットで皮膚を固定し、目的のスポンジの近くを切開します。

最後に、採取したスポンジの周囲に余分な組織を含めないよう注意しながら、周囲のカプセルから慎重に分離します。スポンジは、実施する解析の種類に応じて異なる条件下で保存できます。切片作成の場合、回収したスポンジをOCTコンパウンドなどの凍結包埋剤で包埋するか、あるいは本実験のH&E染色スポンジで行ったように、10% formalinに浸漬してパラフィンブロックに包埋し切片を作成します。

三輻海綿の染色済み標本において、最適な切片を作成するには、ここに示すように海綿を直径に沿って半分に切り、切り出した面を下にして包埋します。ここで実演している通り、この図のように海綿の全幅が含まれるように切片を作成してください。左側の海綿は、切片の右端に沿って組織の境界が乱れていることからわかるように、包埋または切断が不適切に行われています。一方、右側の無傷の海綿は正しく処理されています。

このビデオを視聴することで、マウスにおける創傷治癒を研究するためのポリビニルアルコールスポンジの調製、植込、注入、および除去の方法について十分に理解することができます。