Name: イオンの分離及び核酸の精製のためのオンチップ等速電気泳動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶ等速電気泳動（ITP）によるイオンの分離と核酸精製法。マイクロ流体チップを用いた試料前濃縮、細菌細胞溶解液からのDNA・RNA選択的抽出、アミノ酸の精製と定量を含む3つの実験プロトコルを解説します。

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我々は感謝してDARPA主催のマイクロ/ナノ流体の基礎フォーカス（MF3）契約番号N66001-10-1-4003、下のセンターからDARPAの助成金N660001-09-C-2082からの資金調達を認める。

<ol><li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li>
<li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li>
<li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotachophoresis%3A+Theory%2C+instrumentation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science & Technology. , (1976).</li>
<li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconcentration%2C+separation%2C+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li>
<li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable%2C+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li>
<li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li>
<li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li>
<li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li>
<li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+extraction%2C+isolation%2C+preconcentration%2C+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li>
<li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li>
<li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li>
<li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li>
<li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I%3A+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li>
<li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+dispersion+in+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li>
<li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l%C3%96sungen+und+l%C3%96sungsgemischen%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Phys%22%5BJournal%5D)">Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li>
<li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li>
<li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li>
<li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

ITP法は、迅速に敏感な、堅牢な検出およびイオン分子の処理を有効にするここで提示した。 ITPを使用する際の主な課題は、LEおよびTEバッファの適切な選択です。それは非常に高い絶対的な移動度を持つ強さの酸であるため、非常に予測可能な性質を持っているのでアニオンITPで、我々は一般的に主要な陰イオンとして塩化物を選択します。従って、アニオン性ITPのバッファの選択は、通常、適切なTEと対を選択することに低減されます。選択的な焦点の実験では、TEの選択は、汚染イオンの排除に重要です。汚染物質が存在しないアプリケーションでは、低TE実効移動度は、焦点の速い速度につながります。 MES、MOPS、HEPES、トリシン：我々は相対的にアニオン性のTEイオンを行儀には、次の手順を使用することをお勧めします。対イオンの選択は、システムのpHとTE効果的なモビリティの両方に影響を与えます。一般的な対イオンは、トリス（pKaは8.1）、ビス - トリス（pKaは6.4）です。低い、または高いpHを必要とするアッセイのために、我々はピリジン（pKaは5.25）をお勧めしそれぞれエタノールアミン（pKaは9.5）。 表1と表2に、アニオン性およびカチオン性ITPに対して、それぞれ、我々はいくつかの有用な緩衝液の例をまとめたものです。我々は、カチオン性LEイオン等のアニオン性LEイオンとナトリウムと塩酸を取り、我々はLEバッファー100 mMのイオン強度を想定しています。 読者は、私たちのプロトコルのバッファイオン強度（および表1-2）は、常により大きいまたは10 mMに等しいであることに注意します。理論的にITPの物理学が10mMより低いイオン強度で適用されますが、1 mMのレベルに近い自然な汚染物質（水や大気中の二酸化炭素との反応から、例えばカルボン酸）は、しばしば低イオン強度バッファーの実際の使用を制限します。 我々はシグナル伝達機構は、このプロトコルで提示アッセイに限定されないことに注意してください。パート5で簡単に説明したように、高原モードで精製したゾーンは、ローカル伝導率の変化は、UV absorを介して検出することができます屈折のbance、温度、またはインデックスです。私たち自身のグループでは、我々は、未知の分析対象物質の高感度な検出と識別のための蛍光灯のキャリアアンフォライトを利用する方法を開発しました。ピークモードの実験では図5に示すように 、特定のプローブが焦点を当てた分析対象物にラベルを付けるために使用することができます。高い特異性で標的DNAまたはRNA分子を検出するために11,18を -彼らの標的配列にハイブリダイゼーションの際に蛍光オリゴヌクレオチドプローブ-一実施例では、我々は、分子ビーコンを使用しています。 ITPは、圧力駆動流とEOFによって引き起こされる分散に対して比較的ロバストである一方で、過度のEOFは、平均EOFの速度がITPの速度に等しくなるITPインタフェースの停滞につながる可能性があります。14このような強力なEOFは、特に高pHの条件で発生します。と低イオン強度。このような理由から、我々は、pH 8以下で、便利な場合100mMのオーダーのイオン強度を持つバッファを使用することをお勧めします。我々の経験では、PVPはホウケイ酸塩チップのEOFを抑制するための最も効果的なコーティング。しかし、そのふるいの特性から、PVPは、このようなゲノムDNAを中心としていくつかのアプリケーション用の適切でないかもしれません。実験では、PVPの添加が大幅に（それは集中していませんポイントに）ゲノムDNAの絶対モビリティを減らすことができます観察します。これらのケースでは、界面活性剤（例えば、トリトンX-100）と、組み合わせてSigmacoteとしてシラノールコーティングはまた、EOFを減らすのに有効であること10 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TEアニオン（pKaは-1） </td></tr><tr><td> バッファ対イオン（PKA +1） </td><td> MES（6.10） </td><td> MOPS（7.20） </td><td> HEPES（7.50） </td><td> トリシン（8.15） </td></tr><tr><td>エタノールアミン（9.50） </td><td> 21.41 </td><td> 20.40 </td><td> 17.38 </td><td> 22.85 </td></tr><tr><td>トリス（8.08） </td><td> 21.00 </td><td> 19.23 &lt;/ TD&gt; <td> 15.84 </td><td> 17.56 </td></tr><tr><td>ビス - トリス（6.40） </td><td> 18.22 </td><td> 10.41 </td><td> 7.30 </td><td> 5.23 </td></tr><tr><td>ピリジン（5.18） </td><td> 1.01 </td><td> 3.72 </td><td> 2.42 </td><td> 1.48 </td></tr></tbody></table> 表1。 LEが100 mM HCl及び200mMの緩衝対イオンで ​​あるアニオン性のITPで調整された純粋な検体ゾーンの実効移動度の大きさ（×10 -9 M 2 / V / s）である。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TEの陽イオン（PKA +1） </td></tr><tr><td> バッファ対イオン（PKA -1） </td><td> エタノールアミン（9.50） </td><td> トリス（8.08） </td><td> ビス-トリス（6.40） </td><td> ピリジン（5.18） </td></tr><tr><td> MES（6.10） </td><td> 35.57 </td><td> 21.96 </td><td> 16.39 </td><td> 10.45 </td></tr><tr><td> MOPS（7.20） </td><td> 35.47 </td><td> 20.92 </td><td> 9.76 </td><td> 3.93 </td></tr><tr><td> HEPES（7.50） </td><td> 35.35 </td><td> 19.97 </td><td> 7.77 </td><td> 2.88 </td></tr><tr><td>トリシン（8.15） </td><td> 34.77 </td><td> 16.72 </td><td> 4.50 </td><td> 1.44 </td></tr></tbody></table> 表2。カチオン性ITPで調整された純粋な検体ゾーンの実効移動度の大きさ（×10 -9 M 2 / V / s）のLEは、100mM塩化ナトリウム、200 mMのバッファリングの対イオンで ​​ある。

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 試薬 </td></tr><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>蒸留水</td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td>アーゼ/ DNaseフリー</td></tr><tr><td>クロロックス超</td><td>クロロックス</td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム（NaOH） </td><td>マリンクロット</td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸（HCl） </td><td> EMDケミカルズ</td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma塩基（トリス） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン（PVP） </td><td>ポリサイエン株式会社</td><td> 06067 </td><td> MW100万</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 488カルボン酸</td><td>インビトロジェン</td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td>トリシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td>ビス - トリス</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBRグリーンII </td><td>インビトロジェン</td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td>ローダミン6G </td><td>アクロスオーガニック（ヘール、ベルギー） </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-アミノ酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> 電源のSYBR Green RNA-に-C T 1ステップキット </td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;TD&gt; PCRプライマー</td><td>統合されたDNAの技術</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 装置 </td></tr><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ホウケイ酸塩マイクロ流体チップ</td><td>キャリパーライフサイエンス社</td><td> NS12A </td><td>プラスチックキャディーの有無にかかわらず未</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ガスト</td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td>ソースメータ</td><td>ケースレー</td><td> 2410 </td><td>定電流および定電圧動作モード</td></tr><tr><td>倒立落射蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX70 </td><td>照明用水銀ランプ（オリンパス）やLED（Thorlabs）を使用して、 </td></tr><tr><td>フィルターキューブ</td><td>オメガ</td><td> XF115-2 </td><td>励起/発光：ブルー/グリーン</td></tr><tr><td>安全なロックマイクロ遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td> 022363204 </td><td> 1.5 mLの容量</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。特異的試薬および装置。

イオンの分離及び核酸の精製のためのオンチップ等速電気泳動

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

電技術があるため可動部分のない、シンプルでコンパクトなシステムでは、流体および電気泳動プロセスのさまざまな操作を実行する独自の能力のマイクロアプリケーションの主食です。等速電気泳動（ITP）は、イオン移動度に基づいて百万倍濃縮1,2、および効率的な分離と抽出を実現することができ、シンプルで非常に堅牢な電テクニックです。たとえば、我々は分離と非標識の高感度検出にITPのアプリケーションを実証した3ほとんど、またはまったくサンプルの準備4月8日とし、細胞培養、尿、血液などの複雑なマトリックスからの核酸の抽出と精製にイオン分子（例えば、毒素、DNA、リボソームRNA、miRNAを）。9月12日 ITPは、焦点と流体チャネル·システム内に印加される電界と2つのバッファを用いて分離を実現しています。アニオン性の検体については、主要な電解質（LE）バッファが選ばれているその陰イオンとしてPersat らによって詳細に説明し、後続の電解質（TE）バッファー（実効移動度はイオンの観測ドリフト速度を説明し、アカウントへのイオンの電離状態をとり、の陰イオンよりも高い効果的な電気泳動移動度を持っているUCH 13）。 TEとLE間のインタフェースを確立した後、電界は、LEイオンはTEイオンが占有する領域から離れて移動するように適用されます。先にTEイオンの中間の効果的なモビリティのレースのサンプルイオンがLEイオンを追い越すので、それらはLE-TEインタフェース（以下、 &quot;ITPインターフェース&quot;と呼ばれる）でピント合わせはできません。さらに、TEとLEは、ITPのインタフェースで急な電場勾配を確立し、それぞれ低域と高導電性の領域を形成します。彼らは焦点としてこのフィールドの勾配は、サンプル種をpreconcentrates。適切な他の非焦点を当てた種から焦点を当て、対象種の精製におけるTEとLEの結果の選択と、最終的には、分離サンプル種のd分離。 ここではITPの基礎となる物理的な原則を確認し、2つの動作標準モードについて説明します。 &quot;ピーク&quot;と &quot;高原&quot;モード。ピークモードでは、比較的サンプルイオンがITPインターフェイスで狭いピークが重なっ内で一緒に焦点希釈します。高原モードでは、より豊富なサンプルイオンが定常状態の濃度に達するとその実効移動度順に並べられ、隣接する台地のようなゾーンに分離する。ピークと高原モードでは、同じ基礎となる物理学の外に発生するが、最初の分析対象成分の濃度および/またはサンプルの蓄積のために割り当てられた時間の量によって区別異なる制度を表しています。 我々は、最初に詳細にモデルのピークモードの実験を記述し、E.からの核酸の抽出のためのピークモードアッセイを実証する大腸菌の細胞培養。我々は分離を可視化するために、非焦点トレーサー（NFT）種を使用する場所、高原モードアッセイを提示することによって、単位および結論アミノ酸の定量を形成しています。

等速電気泳動（ITP）は、毒素の検出からサンプル調製に至るまでのアプリケーションで堅牢な電分離と濃縮技術です。小分子および細胞培養溶解液からの核酸の精製の分離と検出：我々はITPと2具体例のアプリケーションにこのテクニックを適用する方法論の物理的原理を確認します。

電気動力学的手法は、多様な流体制御および電気泳動操作を可能にする独自の能力を備えているため、マイクロスケールのアプリケーションにおいて不可欠な技術となっています。

このビデオの全体的な目的は、アイソタコフォレシス（略称 ITP）と呼ばれる電気動力学的手法と、イオンの高感度な検出および分離に向けたそのマイクロ流体への応用を紹介することです。まず、ITPの基礎となる物理的原理に加え、ピークモードとプラトーモードという2つの標準的な動作モードについて説明します。次に、チップ上でのITPを3つの実験で実演します。まず、サンプルの濃縮に関する簡便なプロトコルから始まり、フルオロフォアを鋭いピークに集束させることで検出します。続いて、チップ上のサンプル調製に用いられるITPアッセイを示し、細菌細胞溶解物からDNAおよびRNAを選択的に抽出します。最後に、プラトーモードITPを用いたアミノ酸の精製および定量を行うため、ラベルフリー検出アッセイを使用します。最終的に、ITPを通じてアミノ酸の精製、分析物の濃縮、および核酸の選択的抽出が可能になります。本日は、アイソタフォレーシス（IsotApheresis）と呼ばれる汎用性の高い電気泳動技術の基礎となる物理学と手法についてご紹介します。当研究グループは、ラベルフリー検出、試料調製、および迅速ハイブリダイゼーションアッセイのためのITP法を切り拓いてきました。ここでは、分析物の事前濃縮、核酸の抽出、ならびにアミノ酸の精製と検出を可能にするITPの能力を示す3つの代表的なアッセイを紹介します。これらのアッセイはITPの汎用性を強調するものであり、再現性のある実験を確実に行うために必要な簡便な手順を示しています。ラボにおいて。ITPでは、サンプルイオンが先行電解質（LE）と後続電解質（TE）の界面に選択的に濃縮されます。サンプルイオンは、先行イオンの速度によって決定される一定の速度でマイクロチャネル内を移動します。サンプルイオンの有効電気泳動移動度が、LEイオンとTEイオンの移動度の範囲内にある場合、サンプルイオンは集束します。ここで、移動度とはイオンのドリフト速度と局所電場の比として定義されます。TE中に混合されたサンプルイオンは、周囲のTEイオンよりも速く移動するため、LEとTEの界面に蓄積します。さらに、ITP界面は自己鋭利化（self-sharpening）します。TEゾーンに拡散したLEイオンは、強い復元フラックスを受けてリーディングゾーンに戻ります。LEゾーンにあるTEイオンについても同様です。I two Pの自己研磨およびフォーカシング特性により、本手法の堅牢性が向上し、圧力駆動流などの界面における攪乱の影響を受けにくくなっています。ピークモードでは、試料イオン濃度はLEおよびTEイオンの濃度よりも大幅に低くなります。したがって、これらの条件下において、試料イオンが局所導電率に及ぼす影響は無視できます。ITPインターフェース領域内に複数の分析物が集積すると、ほとんどの場合、ピークが重なり合います。最終的に、試料イオンが十分に高い濃度に達すると、プラトーモードで分離および集積されるようになります。プラトーモードでは、試料イオンは電気泳動移動度によって決定される順序で、局所的に均一かつ一定の濃度を持つゾーンへと分離・精製されます。プラトーモードにおけるイオンが局所的な導電率を決定します。非常に希薄なイオンであっても、プラトー領域間のピークモードで集束することがあります。本プロトコルで提示するアッセイでは、クロスチャネル設計の等方性ウェットエッチングガラスマイクロ流体チップを使用します。しかしながら、ITPは交差や接合部のない単純な直線チャネルやキャピラリーでも実施可能です。ランごとの再現性を確保し、電気浸透流を抑制するために使用するダイナミックコーティングを適切に適用させるため、実験前に以下の洗浄手順を行う必要があります。チャネルを汚染除去するには、北、東、南の各リザーバーに10%漂白剤溶液を10～20 µL充填します。標準的なキャリパーチップキャディを使用する場合は、200 µL ピペットチップの広い端をチップの西側リザーバーに取り付け、真空ラインを内径 2 mm のチューブに接続します。2分間真空を印加した後、リザーバーに脱イオン水を満たして真空ラインで排出することを繰り返し、リザーバー内を完全に洗浄します。この脱イオン水による洗浄を数回行います。この工程を1 M 水酸化ナトリウムで繰り返します。チャネル表面が緩やかにエッチングされ、クリーンなホウケイ酸ガラス表面が得られるため、均一な表面特性の確立に寄与します。リザーバーをDI水で洗浄し、その後チャネルを流水で洗浄します。この期間中に、チャネル内の表面特性と動的コーティングが平衡状態に達します。実験を開始するために、先行電解質 1 mL と後続電解質 1 mL を調製します。次に、10 µL の 1 µM 溶液を 90 µL の TE と混合します。Alexa Fluor 488。LEで洗浄した後、ウェストリザーバーを空にし、リザーバーをdi waterで数回洗浄して、リザーバー内に残っているLEを十分に希釈します。最後に、このリザーバーに色素を含むTE 20 µLを満たします。陽極を東側のリザーバーに、接地電極または陰極を西側のリザーバーに配置し、2 µAの定電流を印加します。サンプルピークは一定の速度で移動し、導電率の低いTE緩衝液で満たされるにつれて、リザーバー間の電圧が上昇します。標的核酸よりも電気泳動移動度の絶対値が小さく、かつイオン性PCR阻害剤よりも大きい陰イオンを追従イオンとして選択することで、ITPを用いて未処理の細胞溶解物から核酸を精製することが可能です。ゲノムPCR阻害剤は逆方向に移動するため、同様に後方に残ります。まず、10⁸ CFUを含む大腸菌細胞ペレットを80 µLのRNaseフリー水で再懸濁し、10 µLの溶解剤を加えて穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、1 M 水酸化ナトリウムを10 µL添加し、溶解物のpHを約12.5まで上げます。溶液が透明になるまでピペットで穏やかに吸い上げと吐き出しを繰り返します。透明になった時点で溶解は完了です。次に、10 µLのライセートを、50 mM Racineおよび100 mM bis trissの90 µLに加えます。この溶液をTEとして使用できます。また、記載の手順に従ってSYBR Green染料を含む1 mLのLEを調製し、前述の方法でマイクロ流体チップにLEを満たします。洗浄後、東側リザーバーの内容物をPCR互換のものに交換してください。西側リザーバーをDI水で洗浄し、20 microlitersのteを満たします。東側と西側のリザーバー間に1000 voltsを印加して実験を開始します。これらのリザーバー間の電流は、実験の終了時に減少します。サンプルはこの溶液とともにLAリザーバーへと溶出します。システムの電流対時間は通常、プラトー値に達します。ピペットを数回上下に動かし、リザーバーの内容物を静かに混合してください。次に、定量的な分析のために5 µLの量を抽出します。R-T-P-C-R-I-T-Pは、小さなイオンを分離し、TEとLEの間の隣接する検出可能なプラトーに集中させるためにも使用でき、これにより実証された物理化学的特性に基づいた検出が可能になります。以下は、蛍光イオン種をLEに添加した非集中的トレーサーアッセイです。蛍光種は集束しませんが、その濃度が局所的な電場に適応するため、精製されたプラトーゾーンの可視化が可能になります。まず、陽イオン性Fluor four rod Domine six Gを含む先行電解質1 mLと、後続電解質1 mLを調製します。次に、TE 90 µLに50 mMアルギニン10 µLと50 mMリシン10 µLを混合し、有限注入用のサンプルをロードします。西側および北側のリザーバーにEllieを20 µL分注し、東側のリザーバーにアミノ酸サンプルを分注します。次に、南側のリザーバーに1分間真空を印加します。東側のリザーバーをDI水で洗浄した後、内容物をteに交換します。最終ステップとして、蛍光レポーターにAlexa Fluor 4 88を用いたピークモード実験では、東側と西側のリザーバー間に500 voltsを印加します。全体の蛍光強度を積分し、検量線と比較することで定量的な濃度を得ることができます。ここに示されている情報は、さまざまな印加電流範囲での実験により、サンプルを明らかにしたものです。ピーク幅は電流に反比例します。これは、ピークモードITPを用いた全細胞溶解物からの核酸抽出の例です。全核酸のITPピークは、しばしば非理想的な形状になります。核酸抽出実験において、サンプルをLEリザーバーに溶出させ、ピペットで抽出して、定量逆転写PCR（quantitative R-T-P-C-R）による定量分析に供しました。PCRにより、細菌培養液からの16 s ribosomal RNAおよび16 s ribosomal DNAの精製が成功したことが確認されました。期待通り、16 s ribosomal RNAおよび16 s ribosomal DNAのネガティブコントロールの閾値サイクル（threshold cycles）は、それぞれ30サイクルを超えていました。また、RUMINE six Gを蛍光トレーサーとして用いたNFTアッセイにより、2つのアミノ酸であるアルギニンとリシンについて、プラトーモードITPを実施しました。ここでは、LEまたはTEゾーンの強度に対する相対的な蛍光強度がゾーンの特定に利用でき、ゾーン幅によって定量が可能になります。このビデオを視聴することで、ITPの物理的な仕組みと、3つの異なるITPベースのアッセイの背後にある手法について十分に理解できるはずです。具体的には、アミノ酸の精製、分析物の事前濃縮、および核酸の選択的抽出にITPをどのように活用するかを示しました。高電圧を取り扱うことは非常に危険であることに注意してください。電流制限機能付きの装置を使用し、電極から十分な距離を保つなど、常に予防策を講じる必要があります。

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