Name: の性的開発と子嚢胞子放電フザリウムgraminearum種 /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学ぶFusarium graminearumの有性生殖と子嚢胞子放電の誘導法。ニンジン寒天培地を用いた培養操作と顕微鏡観察により、遺伝子組み換え後代の表現型評価と突然変異体スクリーニングを行う技術を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この作品は、国立科学財団（FTへのMCB-0923794）からの助成金によってサポートされていました。

1。子のう殻を作り出す<ol><li> Fの肥沃なひずみで6.0 cmの直径のペトリ皿の中心接種ニンジン寒天10 graminearum種 （PH-1を推奨）。 </li><li>場所は、室温（18-24℃）で明るい蛍光灯の下で料理を接種し、菌糸体は、ペトリ皿（3-5日）の外側の端に達するまで成長することができます。市販の家庭用蛍光灯では、子実体の形成と放出を刺激するために正常に動作します。 </li><li>穏やかに滅菌爪楊枝で菌糸を削除します。 </li><li>滅菌ガラス又は滅菌hockeystickガラスロッドの丸みを帯びた端と表面に1.0ミリリットル2.5パーセントのTween 60水溶液を配布しています。 </li><li>光板を返します。プレートにパラフィルムを追加しないでください。 </li><li> 24時間後、プレートの表面は光沢のある外観を持つ必要があります。もし菌糸が再び表示され、スクレープ表面および再適用のTween-60ソリューションを提供します。 </li><li>来週上の子の​​う殻の発達を観察します。の中間段階被子器の開発が静かにRNA抽出（ 図1）凍結寒天とフラッシュの表面をこすることによって収穫することができます。 </li><li>成熟した胞子は7日からプレートの蓋に蓄積されます。当初はこれらの唯一の実体顕微鏡の下に表示されますが、9日目で、彼らは肉眼で見えるとなるように十分な密度に蓄積されているでしょう。 </li></ol> 2。子嚢胞子の放出アッセイ<ol><li>ツイーン溶液の塗布後6日目に、木のボーラーで寒天の1 cmの直径の円を切り取る。また、メスは、同様のサイズのセグメントを削除するために使用することができます。円を半分にスライスして各半分はガラス顕微鏡スライド上に配置することができます。 </li><li>オリエントは断片ので、子実体を含んでいる面がスライドの表面に垂直であり、胞子は、スライドの長さをダウンして起動されます。 </li><li>照明の下で一晩湿度チャンバ内でスライドを配置します。胞子に蓄積されスライドと肉眼で見えるように翌朝（ 図2）。 </li><li>必要に応じて蓄積された胞子は水でスライドをオフに洗浄し、定量化することができる。 </li><li>潜在的な子嚢胞子の放電阻害剤は、アッセイの組み立て時の寒天ブロックの背面側にそれらを追加することによって測定することができる。排出を削減するいくつかのイオンチャネル阻害剤は、以前にこのテクニックを15に検定されています。 </li></ol> 3。組換え子孫の世代<ol><li> F.の2系統とニンジン寒天培地を接種することによりクロスを開始graminearum種 （1寄生虫の卵+一NIT-）、ペトリ皿の両側に接種ポイントを配置する。 </li><li>一度菌糸が空中部分をこすり、表面を充填し、上記のようにトゥイーン-60ソリューションを適用しています。菌糸が満たすペトリ皿の側面に注意することはマーカーを使用しています。 </li><li>光に文化を返し、子のう殻が開発されるまでインキュベートし、cirrhiがありました二つの文化の交点に沿って子のう殻から形成する銃。 </li><li>解剖顕微鏡下では、ビューに二つの文化の交差点に沿って子のう殻をもたらす。虫ピンを使用して、滅菌し、滅菌水に浸し、ピンの先端で軽くこの縁に沿って子嚢胞子塊をタッチします。ピンの水分子嚢胞子塊がピンに固執することができるはずです。 </li><li>胞子を洗い流すためのエッペンドルフチュー​​ブに200μlの滅菌水でその上に子嚢胞子塊のピンの先端をすすぎます。 </li><li>炎ピンは、再びそれを湿らせて、別の子嚢胞子塊を選択します。 10から15 cirrhiを選んで、水の別のチューブにそれぞれを配置します。 </li><li>サスペンドcirrhiを含む簡単にボルテックスチューブ。 </li><li> 9センチメートルペトリ皿の中MMTS媒体1上にピペットと場所で胞子懸濁液の60μlを削除します。滅菌したホッケーのスティックと広がった。残りの胞子懸濁液は最大1週間までは4℃で保存し、必要に応じてプレーティングすることができます。 </li><li>インキュベーション3〜5日間室温でTE（光は必要ありません）非常に小さなコロニーが（ 図3）が表示されるまで。コロニー間の表現型の二種類が存在します。 NIT-コロニーは、NIT +のコロニーよりスパースな菌糸を持ちます。組換え子のう殻からCirrhiはほぼ等しい割合でコロニー表現型の両方が表示されます。その上、単一の表現型のコロニーでプレートを破棄します。時にはつ以上の表現型が他の要因の分離のために生じることに注意してください。 </li><li> V8またはストレージ用のニンジン寒天培地にコロニーを移動します。正しい表現型を確認するために、ドックスのドックス寒天培地（NIT-株はツァペックのドックスに成長しません）上および塩素（NIT +株は塩素とPDAになることはありません0.5 M塩素酸カリウム）とPDA上のテストコロニー。希望する品質のためにこれらのコロニーを調べます。 </li></ol> 4。代表的な結果子のう殻を作り出す目標は、芝生を持つことであるすべての菌糸または胞子明らかせずに子のう殻。文化の表面は黒いベルベット（ 図1）に似て表示されます。 Tweenの塗布後24時間で寒天の表面には若干の光沢を持つ必要があります。菌糸再度表示されている場合、プレートは被子器の開発を誘導するために十分なスクレイプされていない可能性があります。 子嚢胞子の放電常にあなたのアッセイで、野生型株から寒天のいくつかのブロックを提供します。それらが起動しない場合は、どちらかあなたの子のう殻は若すぎるか古すぎる。彼らは古すぎる場合には、多数の菌糸はそれを白っぽい色合いを与える文化の表面上に表示されます。これはそうでない場合、彼らは若すぎるかもしれませんし、このアッセイは、24時間で再び試行すべきである。時折、文化も放電しないし、実験が繰り返されなければなりません。あなたは適切な光条件下でアッセイを行うことを確認してください。 組換え後代<p class="jove_content"&gt;組換え子のう殻は、2つの系統間の交差点に沿って子のう殻の大部分を確認する必要があります。我々は通常のクロスから10 cirrhiを処理し、それらの少なくとも4-6組換えなければなりません。ごくまれに、突然変異が交配から歪みを防ぐことができます。両親のいずれかが異常増殖表現型を持つ場合、2つ以上の表現型はMMTS上のコロニーの間で存在する可能性があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" /> 図1ニンジン寒天培地上に被子器開発の段階。トゥイーンを適用した後、左、72時間。赤色顔料、表面に黒い粒のように見える非常に若い子のう殻に注意してください。右、144時間後、成熟した子のう殻で形成されています。両方の文化では表面的な菌糸体のほぼ完全な欠如に注意してください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" /> 図2放電アッセイ。オレンジ色のニンジン寒天プラグイン指向のようにthaのです​​。強制的にその表面に成熟した子のう殻から排出されるトン胞子はスライドグラスの表面に蓄積することができます。 15時間の累積時間。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" /> 図3選択MMTS媒体上に寄生虫の卵+およびNIT-コロニーの間に成長の違い。 NIT-コロニーは（矢頭）小さくなります。寄生虫の卵+コロニー（矢印）が力強い成長を示しています。写真は7日後に撮影。

<ol><li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li>
<li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuller%2C+AHR+%22Researches+on+Fungi%22">Researches on Fungi</a>. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).</li>
<li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid1%2C+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel%2C+affects+growth%2C+development%2C+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li>
<li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li>
<li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+%28MAT%29+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li>
<li>Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li>
<li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li>
<li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%2C+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li>
<li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes%3A+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li>
<li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+%28Gibberella+fujikuoi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li>
<li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene%2C+ROA%2C+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li>
<li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li>
<li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+cannons%3A+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li>
<li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perithecial+development+by+Gibberella+zeae%3A+a+light+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li>
<li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologica%22%5BJournal%5D)">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

F. graminearum種は、特によく注釈付きゲノム（の在庫状況により子実体の開発研究に適応している<a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB /</a> 4）、および可用性アフィメトリクス·マイクロアレイ6に基づいて。これは、子嚢胞子の放電7,11,3のために重要な遺伝子を識別する能力を促進しています。ここで紹介する方法は、研究者は、Fの子実体の遺伝的解析のための発達段階と関数の離散集合に集中することができます。 graminearum種 。方法はまた、文化のフルーツに誘導することができ、他の真菌子実体の種類の様々な開発のための標準として使用することができますに関連する菌類に容易に適応可能である。 胞子焼成表現型を評価する能力は、胞子が見て小さいと困難な種などで微妙なことができます<eM&gt; F. graminearum種。洗浄したスライド上に胞子のコレクションは、胞子がスライドをオフに洗浄し、定量することがありますので、視覚的評価、定量評価の両方を容易にします。いくつかの菌種は、その胞子を取り囲み、胞子は洗い流すことはできませんが、彼らはスライド上に残って顕微鏡でカウントする必要があり粘液を生成します。我々は、 菌核sclerotiorumの真であることを発見した。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>フザリウムgraminearum種株PH-1 </td><td>真菌の遺伝ストックセンター、カンザス州</td><td> FGSC 9075 </td></tr><tr><td>ツイーン60 </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P1629 </td></tr><tr><td>ドックスのドックス寒天培地</td><td> Difco社、ベクトン·ディッキンソン</td><td> 233810 </td></tr><tr><td>塩素酸カリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 255572 </td></tr></tbody></table>

の性的開発と子嚢胞子放電フザリウムgraminearum種</em

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

フザリウムgraminearum種は糸状菌の開発と病原性の研究のためのモデル系となっています。F. graminearum種が最も簡単にんじん寒天培地上で、子のう殻と呼ばれる子実体を生成します。子のう殻は、被子器開発の特定の段階で生産、多数の組織型が含まれています。これらは、（外観の注文における）被子器のイニシャル（ascogenous菌糸を生じさせている）、外壁、副生体（ASCIを開発するまで、被子器の中心を占める滅菌菌糸体）、ASCI、及び子のう胞子の形成を含む子嚢14内。これらの組織のそれぞれの開発は約24時間で区切られ、性的発達12,8の間にトランスクリプトーム研究の基盤となっています。各ステージの写真を含む開発のより詳細な説明については、ハレンら （2007）を参照してください。ここでは、同期の生成と収穫のための方法を提示LYは、遺伝子調節、開発、および生理的過程の時間的な研究のために子のう殻の芝生を開発しています。これらの方法は、Fで使用されるように具体的に書かれていますが、 graminearum種は 、技術が他の真菌のさまざまな目的で使用することができ、結実が培養で誘導することができます提供し、開発にはいくつかの同期があります。我々は最近、Fの性的発達を研究するために、このプロトコルを適応しているverticillioides。子のう殻を開発するの芝生が誘導されなかったため、個々の子のう殻は、この種に手を選ばれる必要がありますが、プロセスが開発（Sikhakolliとトレイル、未発表）を研究するためによく働いた。 菌類の子実体の中で最も重要な機能は、胞子の飛散です。子嚢菌（子嚢は菌類を生成する）の種の多くでは、胞子を介して（とepiplasmic流体）の胞子の放出を駆動し、子嚢内の膨圧の発生により、子嚢から撮影されてい子嚢の先端2,7の細孔。強制子嚢胞子放電の我々の研究は、我々がプロセス内での変異をスクリーニングするために使用する &quot;胞子放出アッセイ&quot;の開発につながった。ここでは、このアッセイの詳細を提示します。 F. graminearum種はホモタリックであり、従って、互換性のあるパートナーの存在下で子実体を形成することができる。 homothallismの利点は、交差点では、この種の14.7の性的発達の研究を促進してきた面の特定の形質の子孫のホモ接合体を生成する必要がないことです。しかし、異体性の株が5,9を越えるために使用することができる生成されています。それは1つの菌株1のいくつかの遺伝子の変異体を取得するにはホモタリック株を横断することも可能です。これは2株で1シャーレcoinoculatingによって行われます。ミーティング·ポイントに沿って、子のう殻の大部分は、（親系統のいずれかに変異を提供阻害しない組換えになります交配）。子のう殻の年齢として、彼らは強制的にそれらを排出するのではなく、子のう胞子大挙をしみ出させる。結果胞子滲出液は、（子嚢胞子塊と呼ばれる）被子器の先端に位置し、容易に個々の胞子の回復のために削除することができます。ここでは、組換え子のう殻および組換え子孫の回復の識別を容易にするためのプロトコルを提示します。

性的な交配と組換え後代の単離は、糸状菌のための重要な研究ツールです。<em&gt;フザリウムgraminearum種</em&gt;これらのプロセスを正常に行うに必要な技術が提示されています。

Fusarium graminearumは、糸状菌の発達および病原性の研究におけるモデルシステムとなっている。F. graminearumは、極めて容易に...を産生する。

本手順の全体的な目的は、培養下でパラテシア（parathesia）の発達を誘導・操作する方法、およびAPO放出を確認する方法を習得することです。まず、培養物を誘導して活発に成長させ、有性生殖の発達を開始させます。次に、活性胞子の放出をアッセイし、その後、組換えパラテシアを作出します。最終ステップは、組換えが起こったかどうかを示す表現型について後代を評価することです。最終的に、この結果は有性生殖の発達における変異体のスクリーニングや、単一の系統内に複数の変異を導入するために利用できます。この手法は、手順を言葉で説明するのが難しく、また単純ではあるものの、最適な胞子放出と一貫したパラテシア形成を得るためには正確に行う必要があるため、視覚的なデモンストレーションが極めて重要です。まず、6 cmのペトリ皿の中央に人参のオーガを接種し、f gramineの稔性株を接種します。接種した皿を、室温で標準的な市販の明るい蛍光灯下でインキュベートしてください。菌糸がシャーレの外縁に達するまで、3〜5日間、真菌を培養します。クリーンベンチ内にて、滅菌済みのつまようじで培養表面をそっと擦り、気生菌糸を除去します。次に、1 mLの界面活性剤をオーガに適用し、滅菌済みのガラス棒の曲がった端または球状の端を用いて表面に擦り込みます。 perfilを適用せずに、プレートを再びライトの下に戻します。24時間後、プレートの表面に光沢が現れます。菌糸が再び現れた場合は、表面を掻き出し、Tween 60溶液を再塗布し、さらに24時間光を照射してください。その後、1週間にわたってパラテシアの発達を観察します。若年期のパラテシアは、オーガ表面に黒い粒子として観察されます。成熟したパラテシアと比較して、表面菌糸はほとんど認められないはずです。7日目までに成熟した胞子がプレートの蓋に蓄積し、9日目までには胞子が非常に高密度になり、拡大鏡なしでも視認できるようになります。中間段階を回収するには、メスでパラテシアの表面を優しく掻き取り、パラテシアをクライオチューブに移します。その後、界面活性剤を塗布してから6日後に、RNA抽出のためにチューブを急冷します。木材用ドリル、ボーラー、またはメスを用いて、オーガーから直径1 cmの円を切り出します。その円を半分に切り、ガラス製顕微鏡スライドに固定します。この際、子実体を含む面がスライドの表面に対して垂直になり、胞子がスライドの長手方向に沿って放出されるように配置してください。この段階で、アクロスポア抑制剤が必要な場合は、オーガーブロックの背面に適用します。この手法は、放出抑制剤となる化学物質のスクリーニングや、胞子放出能を喪失した遺伝子変異体のスクリーニングに利用でき、我々はその両方を成功させています。次に、スライドを室温で加湿した単純な照明付きチャンバー内で一晩インキュベートします。子実体が噴出するにつれて胞子がスライド上に蓄積し、翌朝に確認することができます。蓄積した胞子をスライドから洗浄し、清潔なディッシュに回収して定量します。まず、キャロットオーガー（carrot auger）ペトリ皿の両側に2つのf gramine arum株を接種し、遺伝的交雑を開始させます。既述の通り、菌糸が表面を覆い尽くすまで真菌を培養します。気中菌糸を掻き取り、T between 60溶液を塗布します。この際、菌糸が接するプレート上の位置に印を付けます。培養物を光条件下に戻し、約7日間インキュベートして、パラテシアが発達し、培養物間の接点に沿ってパラテシアからSiriが形成され始めるまで待ちます。この手法を用いることで、複数の変異を単一の株に集約させることができます。また、knit plusとknit minusの両方が選択可能であるため、非常に有用な選択マーカーとなる点に注目してください。実体顕微鏡下で、2つの培養物の接点にあるパラテシアを視野に入れてください。次に、sear eye（サーチアイ）を探します。滅菌済みの昆虫ピンを滅菌水に浸し、培養物の境界に形成されたserous（漿液）にピンを触れさせます。これにより、SRIがピンの水分に付着します。次に、1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れた200 µLの滅菌水でピンの先端をすすぎます。ピンを火炎滅菌し、再び湿らせてから、別のsruをピックアップします。3〜5個のSiriをピックアップし、すべて専用のチューブに移します。軽くボルテックスします。懸濁したSiriを含む各チューブについて、60 µLの胞子懸濁液を9 mmのペトリ皿に塗布します。MMTS培地を用い、明室または暗室の室温でプレートを培養し、残りの胞子懸濁液は4°Cで最大1週間保存します。3〜5日後、プレート上に非常に小さなコロニーが出現します。顕微鏡下で1つの表現型を判定できます。Knit陰性コロニーは、Knit陽性コロニーよりも菌糸が疎になります。どちらか一方の表現型のみを持つプレートは廃棄してください。組換えparathesia由来のSiriでは、両方のコロニー表現型がおよそ等しい割合で現れます。これらのプレートを保持しておきます。保存目的で、ニット陽性とニット陰性の中間的なコロニーなど、他の因子の分離により別の表現型が生じることがあります。他の表現型を検討して研究を継続するため、組換えプレートからV8プレートまたはニンジンアガープレートにコロニーを継代します。コロニーをChap X dockのアガーおよびクロレート含有PDAプレートに塗布してください。Parathesiaは、菌糸や胞子を伴わない黒いベルベット状の菌叢として生育しました。Tweenを塗布して24時間後、オーガーの表面にわずかな光沢が現れました。もし菌糸が再出現していた場合、パラテシアの発達を促すために十分な掻き出しが行われていなかった可能性があります。野生型株の子実体を持つ複数のオーガーブロックを準備し、ガラススライド上に胞子を放出させて観察しました。適切な照明を準備した。若すぎた、あるいは成熟しすぎたParathesiaは、多くの場合発火しなかった。成熟しすぎている場合は、培養表面に多数の菌糸が現れ、白色を呈していた。子実体が未熟で発芽しなかった場合は、実験を繰り返しました。24時間後、交配から10個のSiriを回収したところ、knit陰性とknit陽性の表現型の混合によって判定した結果、少なくとも6個が典型的には組換え体でした。極稀に、変異によって菌株の交配が妨げられることがありました。親のいずれかに明らかな増殖表現型が見られた場合、MMTS上のコロニーにおいて3種類以上の表現型が認められました。本手順を実施する際は、長期間にわたって継代を繰り返したものではなく、適切に維持管理された培養物から開始することが重要です。常に、安定したフリーザーストックから育成した培養物を使用してください。

sexual-development-and-ascospore-discharge-in-fusarium-graminearum

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ジベレラzeaeの子のう胞子の発達過程を調べるために、無菌条件下でのコレクションのための手順は、プロトコル記述のための情報の最高レベルを生成するために撮影されている。これは、実験、完全なゲノム発現プロファイルのテストが実装されている重要な側面の再現性を促進すべきである。...

マイクロアレイ実験のためのジベレラzeae子嚢胞子の生産とコレクション。

種子感染菌による穀物の荒廃は、より良い植物 -...

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

私たちは、分裂酵母の性的なライフサイクルの長期顕微鏡検査のための再現可能な基本的な方法を提供します。説明されているわずかな調整で、提示されたプロトコルは、生殖プロセスのさまざまなステップに研究の焦点を当てることができます。...

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

&gt;jove_content&lt;走査型電子顕微鏡観察のための生物学的サンプルの処理における問題には、細胞の崩壊、湿った微小環境からのサンプルの処理、および細胞破壊が含まれます。ここでは、花分裂組織、卵分裂組織、真菌(Agaricales)などの困難なサンプルの調製に適した低コストで比較的迅速なプロトコルをまとめ、詳細に説明しています。...

問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン

ここでは、土壌サンプルから病原性真菌(EPF)を単離・選択するために用いたミミズ(テネブリオモリター)-ベイトシステムに基づくプロトコルを提示する。有効なコニディア数(ECN)式は、現場での害虫微生物制御のための生理学的特性に基づいて高い耐ストレスEPFを選択するために使用される。...

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

このプロトコルは、わずか7日間で大量の土壌サンプルから酵母とカビ アスペルギルス フミガーツス を培養する効果的で迅速な方法です。この方法は、実験に必要なさまざまなインキュベーション培地と温度に対応するように簡単に変更できます。...

土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査

この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。...

真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

粘液菌類Phycomyces blakesleeanusとの性交配

ルシフェラーゼを発現する乳腺腫瘍細胞をマウスに皮下移植し、縦断的研究で、非侵襲的に腫瘍の成長と発展を監視する光イメージングを用いて可視化されています。...

IVISスペクトラムを用いた乳腺腫瘍の in vivo生物発光イメージングに

幼虫および成体での心臓の鼓動を可視化するために必要なテクニック...

の心臓の鼓動の可視化ショウジョウバエ</em

学ぶFusarium graminearumの有性生殖と子嚢胞子放電の誘導法。ニンジン寒天培地を用いた培養操作と顕微鏡観察により、遺伝子組み換え後代の表現型評価と突然変異体スクリーニングを行う技術を習得できます。

の性的開発と子嚢胞子放電フザリウムgraminearum種

さらに動画を探す