Name: 凍結保存サンプルの回復のための日曜大工のデバイスが誤って低温貯蔵タンクに落とし (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学ぶ 液体窒素タンクからの凍結サンプル回収用の自作デバイス構築法。低温耐性装置により、クリオボックスやバイアルの安全かつ迅速な回収が可能となり、サンプル品質を保持しながら単独作業者で効率的に作業できます。

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DIY極検索装置は、プロジェクトがん研究プログラムは、科学のバージニア州アカデミーのメアリー·ルイーズ·アンドリュース·アワード主催の &quot;バイオインフォマティクスと分子のアプローチを用いて真核細胞のモデル化細菌タンパク質のプレニル化&quot;、 &quot;プラズマ中のRNA編集の生理的意義の過程でテストされていたトーマスF. JeffressとケイトミラーJeffressメモリアルトラストと国家契約16.740.11.0364（科学と教育省、ロシア）が主催する樹状細胞 &quot;。我々は、RNAの完全性実験の支援についてはベスオムに感謝します。

1。 Cryoboxesの検索のためのCryotolerantデバイスの組立<ol><li>ペンチを使用して、 図1Bに示すように、強力なネクタイLは形にする（ 図1A）3面の強いタイの一面をまっすぐ注：強力なネクタイの寸法は、デュワーの首の直径に応じて選択することができます。 </li><li> 図3（AB）に示すようにCryoscoop基盤を形成するために、クラウンのボルトナット、ワッシャーとネジを使用して強力なネクタイTストラップ（ 図2）このような2つの強い結びつきを確保する注：2つの強い絆の検索を可能にするために使用されている5½インチ×5½インチcryoboxes。 </li><li>溝付きプレート（ 図4）を使用して 、スロット板の一方の端のスロットに強力なネクタイTストラップのスロットを合わせ、ヒルマンナットとボルト（ 図5）の助けを借りて2つを確保する注：場合スロット板と強力な提携のは共存しません私は、事前にドリル穴を使用すれば、超硬ドリルビットを使用して、ドリル穴を持っている必要があります。 </li><li> 図6に示すように、ペンチの助けを借りて、スロット板のもう一方の端を曲げます。 （この手順は省略可能です）。 </li><li>液体窒素中で図6に示すように、ときに優れたデバイスを把握するために泡でハンドルをラップします。 （オプション） 注意：オートクレーブの前に泡を削除します。 </li></ol> 2。 Cryovialsの検索のためのCryotolerantデバイスの組立 Cryotolerant DIYの検索装置は、cryovialsの取得するために適合させることができます。これは液体窒素（ 図7）からバイアルをすくうための改変に示すようにステンレス製のストレーナーとフラットベースを置換が含まれます。 <ol><li>溝付きプレートに強力なネクタイTストラップを取り付けるネジを外し、クラウンナットとボルト。 </li><li>溝付きプレートにステンレス製のストレーナーを取り付ける前に、そっとの首を曲げる。鍋（ 図8）に似せて角度で向きをベースにペンチの助けを借りて、ストレーナー注：ストレーナーはリップが付属している場合は、唇を曲げてペンチを使用して、これは容易にデバイスで操縦しています。 </li><li>溝付きプレートの穴に沿ってストレーナーのハンドルの穴を合わせ、 図8に示すように、ヒルマンナットとボルトの助けを借りて、ストレーナを固定注：ストレーナーはプレドリル穴に付属していない場合は、次のものが必要となります超硬ドリルビットであけられた穴を持つように手配します。 </li></ol> 3。デュワーから取得CryoboxesとCryovials <ol><li>開始するには、極低温の手袋をつけて、操縦のスペースを確保するためにデュワーから1または2フリーザーラックを削除します。 </li><li>優しく強いネクタイTストラップ·ベース（ 図5）を装備直立Cryotolerant DIY取得デバイスとデュワーの底に沿ってこすり、ボックスfalleを収集するデュワータンクの底にn 注：液体窒素の沸騰は、すぐに暖かい物体と接触すると、窒素ガス（ライデンフロスト効果）を絶縁内のオブジェクトを包む。サンプルの取得する前にデバイスを冷却するために、ゆっくりとデュワーにデバイスを浸すと、液体窒素は、上記の手順に進む前に十分にデバイスを冷却することができます。 </li><li>タンクのうちフリーザーボックスをすくうためにデュワーの壁に沿って直立デバイスを引き出します。 </li><li>デュワーの底から取得したボックスをつかむ。 </li><li> cryovialsを取得するために、穏やかにストレーナー（ 図9）を装備しcryoscoopとデュワーの底をこすり。 </li><li> cryobox検索と同様に、直立デバイスを引き出し、ストレーナーで収集されたバイアルをつかむ。 </li></ol> 4。代表的な結果遺伝子発現研究における主要な課題は、RNAの品質は保管条件に依存していることです。両方の凍結組織サンプルのRNAと4を抽出した。 図10は、トータルRNAの完全性のサンプル処理の効果を示しています。同じ組織源（ヒト脂肪）からのトータルRNAは、異なるサンプル処理に供した。実験前に、無傷のトータルRNA preparateは約2倍の18S rRNAのバンド（ 図10、レーン1）のような激しいとして28S rRNAのバンドとの明確な28Sと18S rRNAのバンドを示しています。 18Sの強度比が2:1 5から出発する：この2:1の比率（28S：18S）は、部分的に分解したRNAは、塗抹標本、またはその28Sのように表示されますが、RNAは無傷であることを示しています。 3から4レーンは大幅に低下してRNAサンプルを示しています。これらのRNAサンプルは、このように定期的に堕落したバイアルの取得の必要性のためにデカントし、ボックス（ 図10、3-4レーンと長期的なストレージをモデル化し、デュワー（方法）から、短期取得の繰り返される部分defreezingに供した。）しかし、サンプルはデュワーサービスに格納されているDIYのデバイス（方法B）と、このように、部分的なdefreezingを使用して、インタクトなRNA（ 図10、レーン2）を含んでいます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> 図1。 A）基地は、2つの3面の強力なネクタイに示した寸法で構成されています。それぞれ強力なネクタイは、一つの大きなプレドリル穴（実線の矢印）と、各面に複数の小さな穴（小さい矢印）が含まれています。これは、ナットとボルトで固定できるようにするオプションを提供しています。また、小さな穴は、サンプル取得時に液体窒素の迅速な排水を可能にします。B）の強いタイのそれぞれの片側がL字型の強力なネクタイにするペンチの助けを借りてまっすぐにされています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> 図2：厳密なネクタイTストラップが一緒の強い結びつきを確保するために使用されます。強力なネクタイ、T-ストラップのように一つの大きなプレドリル穴（実線の矢印）と二つの小さな穴（Smalのを持っている各コーナーにL矢印）。ナットとボルトを使用して、ペニスバンド - これは、Tの長さに沿っての強い結びつきを確保することができます。また、溝板にT-ストラップを固定することができます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> 図3。 a）各強いネクタイ）は、B。冠ボルト、ナット、ボルト、ワッシャを使用して、その長さに沿って、T-ストラップの一方の隅に固定されている二つの強い絆は、5½インチ×5½を取得するために、お互いに隣接して固定されているcryoboxesインチ。このようなインチX 2インチ2のような小さいcryoboxesは、単一の強力なネクタイは、T-ストラップなしでスロット板に直接固定することができます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> 図4は、平板は、ハンドルとして使用されているスロット。溝付きプレートの長さはデュワーの深さに依存します。このケースでは、スロット板の4フィートが使用されています。スロット板の厚さが重要なのです。デュワーを満たした液体窒素からサンプルを取得中に細い溝プレート（&lt;14ゲージ）は、デバイスが薄っぺらするインス。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> 図5。の強い絆とTストラップで構成されるフラットベースは、その後スロット板の一端に固定されています。 Tストラップの残りの角に大きな穴が平板上のスロットに合わせ、六角ボルトとナットを使用して固定されている。このデバイスは、現在デュワーからcryoboxesを取得するために使用することができます。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> 図6。スロット平板の一端は、ペンチを使って曲げて、この場合に示すように、特に深いデュアーのためのより良いグリップを提供するために泡で覆われています。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> 図7：ワイヤーメッシュ、ステンレス鋼製ハンドル付きストレーナーデュワーからcryovialsを取得するために使用されています。ハンドルはスロットで提供されていない場合、超硬ビットドリルは穴をあけるため必要となります。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> 図8。cryovialsの検索を容易にするためには、ストレーナーは、鍋の形ストレーナを得るためにペンチを使用して、首に沿って折り曲げられている。ストレーナーは、この場合のようにリップが付属している場合は、ペンチは、それを曲げるために使用できます。これは、ストレーナはデュワー内に巻き込まれないことが保証されます。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> 図9。ストレーナーは、六角ナットとボルトを使用して1つの端に溝付き平板に固定されている。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> 図10。のトータルRNAサンプルの完全性は、異なるサンプル処理条件に供した。RNAの品質はcを処理するサンプルでどのように影響されるか調べるためにonditionsは、同じソースからのRNAサンプルのセットは、ハンドリングの2つの方法に供した。メソッドのため、DIYのデバイスを使用して、サンプル取得時にかけデュワー、部分的なdefreezingでRNAのストレージで構成されていた。方法Bは、このように、定期的に落ちたサンプルを取得するためにデカントで長期保管をモデリングし、デュワーからの短期取得の繰り返される部分defreezingにさらさデュワー中のRNAのストレージで構成されていた。トータルRNAの整合性は、その後、ゲル電気泳動によって分析した。 Lane1：デュワー内の記憶の前にサンプル、レーン2：デュワーからのサンプルは、メソッドによって取得を受け、レーン3、4：方法Bによって検索の対象とデュワーからのサンプル、M：100 bpのラダー。

<ol><li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKittel%2C+P+%22Advances+in+Cryogenic+Engineering%22">Advances in Cryogenic Engineering</a>. , Springer. 41(1996).</li>
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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

デュワータンクの底からcryoboxesとcryovialsを取得する最も一般的な方法の1つは、予備容器に液体窒素をデカントし、デカントし、液体窒素中でフラスコまたはフローティングに残っているサンプルを引き出すことです。しかし、これは、液体窒素蒸気に長時間さらされる2による低温火傷や窒息を引き起こす可能性があり危険な習慣です。落ちcryovialsの取得他の一般的な方法は、クライオバイアルトング3の使用を含む。しかし、液体窒素で満たされたタンクの暗い空間内の限られた可視性は、その機動性を制限します。 上記のCryotolerant DIYの検索装置は、限られた可視性との深いフラスコの底から落ちcryoboxesとcryovialsを取得するための安価で、安全で簡単な代替手段を提供します。 DIYの検索装置の処理のしやすさ、検索の前にフラスコを空にする必要性を回避します。また、RETの助けを借りて、クライオバイアルのrievalは、デバイスが単一の個人によって行われることができると言いました。さらに、DIYの検索装置の使用は実質的に同じユニ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ヒルマン·グループメッキスロットフラット1-3/8 X 4フィート、14ゲージ</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td> N / A </td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>クラウンボルトステンレス＃6 - オーバルヘッドフィリップスドライブの機械ネジ32インチ×3/8 </td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル＃42281 </td><td>必要な4単位</td></tr><tr><td>クラウンボルト亜鉛メッキスチールフェンダーワッシャーインチ×1-1/2インチ3月8日</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル＃20122 </td><td>必要な4単位</td></tr><tr><td>クラウンボルト亜鉛めっき＃8-32ネジのナット</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル＃18512 </td><td>必要な4単位</td></tr><tr><td>シンプソンストロング - タイBC40Zハーフベース4インチIn.x4 </td><td>ローカルハードウェアショップ</td><td>モデル＃BC40Z </td><td>必要な2台</td></tr><tr><td> Tストラップインチ×6インチシンプソンストロング - タイ6 </td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル＃66T </td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>オナイダ6 &quot;メッシュストレーナー</td><td>地元の食料品店</td><td>モデル＃7859W </td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>ヒルマン·グループでは、六角ナット3/8-16の亜鉛メッキ</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td>モデル番号：810509 </td><td>必要な6単位</td></tr><tr><td>ヒルマン·グループでは、六角ボルト3/8- 16亜鉛メッキ</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td></td><td>必要な4単位</td></tr><tr><td>絶縁用泡</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td></td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>ねじ回し</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td></td><td> 1ユニットが必要</td></tr><tr><td>ペンチ</td><td>ローカルハードウェアのショップ</td><td></td><td> 1ユニットが必要</td></tr></tbody></table>

凍結保存サンプルの回復のための日曜大工のデバイスが誤って低温貯蔵タンクに落とし

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks 

液体窒素の圧力下に置かれ、無色、無臭、非常に冷たい（-196℃）で液体である。それは一般的に、血液、細胞や組織の1,2のような生物学的物質の長期保存のための極低温流体として使用されます。液体窒素の低温の性質は、サンプルの保存のための理想的な一方、接触のライブの組織の急速凍結を引き起こす可能性があります- &#39;凍傷&#39; 2として知られている、密接にストレージ、デュアーからのサンプルの取得に関係者に重度の凍傷につながる可能性があります。さらに、液体窒素が蒸発としては、特に限られたスペース2に、空気中の酸素濃度を低減し、窒息を引き起こす可能性があります。 研究室で、生物学的サンプルは、多くの場合、デュワータンク1内のステンレス製ラックに積み重ねcryovialsまたはcryoboxesに格納されています。これらのストレージラックは、ラックからも抜けボックスを防止するために、長いシャフトととの底面に用意されていますルーチン処理時のデュアー。すべて余りに頻繁に、しかし、貴重なサンプルのボックスまたはバイアルに抜け出し、液体窒素を充填タンクの底に沈む。そのような場合には、サンプルがうんざりするほどのスペア容器または廃棄するに液体窒素を転送した後に取得することができます。箱やバイアルは、比較的安全に空にデュワーから回収することができる。しかし、液体窒素とその膨張率の低温性質が沈没したサンプルの取得危険になります。それは一般的にサンプルの検索が一人で行っ決してすることが安全局によって推奨されています。別の方法としては、バイアル3を取り出して、市販のクールグラバーやトングを使用することです。しかし、暗い液体充填デュアー内の限られた可視性は、それらの使用に大きな制限が課される。 本稿では、安全な両方の極低温流体を含むデュワーからのサンプルの取得を行うCryotolerant DIYの取得、デバイスの構造を記述する簡単に購入する。

ここでは、液体窒素を充填したデュワータンクからサンプル取得のための低コスト、耐久性のあるcryotolerantデバイスを提示します。装置の構成とモジュール設計のしやすさ、安全かつ容易に極低温タンクからのサンプル取得のプロセスになります。

液体窒素は、加圧状態で保持される、無色・無臭で極低温（-196 °C）の液体です。これは一般的に、長期的な保存のための極低温流体として使用されます。

この手順の目的は、簡便に作製可能なデバイスを使用して、液体窒素を満たしたデュオタンクからクライオボックスおよびクライオバイアルに入ったサンプルを容易に取り出すことです。まず、操作スペースを確保するためにデュオタンクから1〜2段のフリーザーラックを取り除き、デバイスをタンク内に垂直に挿入します。次に、デバイスを用いてタンクの底に沿って静かにかき出します。次に、デバイスを容器の壁に沿って垂直に引き上げます。フリーザーボックスをタンクから取り出すための最終ステップは、容器の底から回収したボックスを掴み、取り出したフリーザーラックを元に戻すことです。デカンターや液体窒素充填バーなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、簡単かつ安全で迅速な代替手段であり、サンプルの完全性を維持できること、および一人のオペレーターで実施可能であることです。耐低温デバイスの組み立てを開始するには、プライヤーを使用して3辺強結紮材の一辺をまっすぐに伸ばし、L字型強結紮材を作成します。ここで示されているように、ストロングタイの寸法は、ドイヤーのネック径に応じて選択できます。5.5×5.5インチのクライオボックスを回収できるように、このようなストロングタイを2本作成してください。これらをクラウンボルト、ナットワッシャー、およびネジを用いてストロングタイTSTストラップで固定し、クライオスクープのベースを形成します。デバイスがこの図のように配置されます。次に、スロット付きプレートを使用し、strong tie tee strapのスロットをスロット付きプレートの一端にあるスロットに合わせます。その後、Hillman社製のナットとボルトで2つの部品を固定します。スロット付きプレートと強力タイにあらかじめ穴が開いていない場合は、固定用の穴を開けます。必要に応じて、スロット付きプレートのもう一方の端を曲げ、フォームで包むことでハンドルを作成できます。デバイスをより確実に把握するため、水洗いを行う前に必ずフォームを取り除いてください。この耐凍結DIY回収デバイスは、クライオバイアルの回収にも適応させることができます。これには、平らな底面を、液体からバイアルをすくい上げるために改造したステンレス製ストレーナーに交換することが含まれます。組み立てを開始するには、まず 크라운ナットとボルトを外し、スロット付きプレートに強力なタイヤティーストラップを取り付けます。次に、ステンレス製ストレーナーをスロットプレートに取り付ける前に、プライヤーを用いてストレーナーのネック部分をゆっくりと曲げ、底部がお玉のような角度になるように調整します。使用するストレーナーにリム（縁）がついている場合は、プライヤーでリムを下に曲げます。これにより、デバイスの操作が容易になります。ストレーナーのハンドルの穴をスロット付きプレートの穴に合わせて配置し、ヒルマンナットとボルトでストレーナーを固定します。ストレーナーに穴があいていない場合は、ドリルで穴を開けてください。ドーナーからクライオボックスの取り出しを開始する前に、必ず低温用手袋を着用してください。次に、デバイスを操作するスペースを確保するため、ドゥーアー（doer）からフリーザーラックを1〜2段取り出します。続いて、ストロングタイ（strong tie）ttraベースを装着した垂直型の耐凍結DIY回収デバイスを使用し、ドゥーアーの底に沿って緩やかにかき出し、ドゥーアータンクの底に落ちたボックスを回収します。最後に、デバイスを壁面に沿って垂直に引き上げ、フリーザーボックスをタンクからすくい上げます。デバイスを垂直に保持し、そのまま真っ直ぐ上に引き上げることで、ボックスがドゥアの中に滑り戻るのを防ぐようにしてください。クライオバイアルを回収する場合は、ストレーナーを装着したクライオスクープを使用し、クライオボックスの回収と同様にドゥアの底を軽くかき出してください。その後、デバイスを垂直に引き上げ、ストレーナーに集まったバイアルを取り出します。遺伝子発現研究における大きな課題は、凍結組織試料と抽出済みRNAの両方において、RNAの品質が保存条件に依存することです。この図は、サンプル処理が全RNAの完全性に及ぼす影響を示しています。同一組織源から得られた全RNAに対し、実験前に異なるサンプル処理を施しました。完全な全RNA調製物は、明瞭な28 sおよび18 sリボソームRNAバンドを示し、28 sリボソームRNAバンドの強度は18 sリボソームRNAバンドの約2倍となっています。これは、RNAが分解されずに保持されていることを示す指標です。レーン3および4は、フリーザーからの短期間の取り出しによる繰り返しの部分的な解凍によって著しく分解したサンプルを示しており、これはボックス内のチューブを取り出す必要性から定期的に分注を行う長期保存の状態を模したものです。しかしながら、DIYデバイスを用いてドゥーアーサービス（doer service）で保存し、部分的な解凍を行わなかったサンプルは、レーン2において無傷のRNAを含んでいます。このビデオを視聴することで、液体窒素を満たしたドゥアー（dvar）から、デカンテーション（移し替え）を行うことなくサンプルを回収する方法を十分に理解できるはずです。

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