Name: マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶマウス脳内幹細胞移植のマルチモーダルイメージング法。生体発光イメージングと磁気共鳴イメージングを組み合わせ、移植細胞の生存と局在を非侵襲的に追跡し、組織学的検証で結果を裏付ける。この手法は神経変性疾患モデルでの応用が期待される。

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<p class="jove_content"&gt;著者の仕事は研究助成金G.0136.11とG.0130.11（AVDL、ZBとPPOに付与されている）と1.5.021.09で、アントワープ大学の研究助成ID-BOF 2006（PPOとAVDLに付与されている）によってサポートされていました。 SBO研究助成金IWT-60838によって科学研究フランドル基金のN.00（PPOに付与されている）（FWO-ブラーンデレン、ベルギー）：科学と技術のためのフランドル研究所BRAINSTIM（ZBとAVDLに付与） EC-FP6-NOE DiMI（LSHB-CT-2005から512146）、EC-FP6-NOE EMIL（LSHC-CT-2004から503569）によって部分的にフランダース政府からMethusalem研究助成金（ZB​​に付与されている）によって部分的、 、およびInter大学の観光地ポーランドでIUAP-NIMI-P6/38（AVDLに付与されている）。ナタリー·デ·VochtはFWO-ブラーンデレンから博士 - 学生の身分を保持しています。ピーターPonsaertsはFWO-ブラーンデレンのポストドクトラルフェローです。</p

1。細胞調製<ol><li>実験は、遺伝的にルシフェラーゼ及びEGFPレポータータンパク質を発現するように設計ex vivoで培養された幹細胞集団を使用して開始する必要があります。ここでは、前述のBergwerf ら 2、図5によって説明/ルシフェラーゼのeGFPを発現するマウス骨髄由来ストローマ細胞（BMSC-Luc/eGFP）を使用します。 </li><li> 1μg/ mlのPuromycineを添加した15ミリリットルの完全増殖培地（CEM）のT75培養フラスコごとに8×10 5細胞の密度で細胞標識、プレートBMSC-Luc/eGFP細胞の二日前。 </li><li>細胞は℃、5％CO 2で37 48時間成長することができます。 </li><li>成長細胞培養（：T75培養フラスコに15 mlの培養液あたり75×10 6粒子の合計）に5×10 6氷河ブルーミクロンサイズの酸化鉄粒子（GB MPIO）ml当たり培地を追加します。 </li><li>エンドサイトーシスを介した粒子の取り込みを可能にするために16時間インキュベートします。 </li><li>残りの粒子を洗い流すそして細胞はギガバイトMPIOの細胞コンフルエントと均一な分布を得るためにさらに24時間のために成長することができます。 </li><li>のeGFP +細胞の総量のeGFP +およびGB MPIO +細胞の割合をカウントすることにより、蛍光顕微鏡を用いて視覚的に粒子の取り込みを検証します。 </li><li>トリプシン-EDTA処理（5分間T75培養フラスコあたり5 ml）の後10 mlのPBSと収穫細胞を二回ギガバイトMPIO標識BMSC-Luc/eGFP細胞を洗浄します。 </li><li>採取した細胞を洗浄し、PBSで133×10 6細胞/ mlの最終濃度で再懸濁します。 </li><li>移植まで氷上で細胞を維持する。 </li></ol> 2。マウスの中枢神経系における細胞移植<ol><li>ケタミンの腹腔内注射（80 mg / kg体重）+キシラジン（16 mg / kg）を混合することによってマウスをAnaesthetize。 </li><li>マウスは眠りに落ちるようにする5分間待ちます。 </li><li>無菌操作を可能にするために、マウスの頭を剃る。 </li><li>定位フレームにマウスを置きます。 </li><li> Desinfect皮膚や脱水を防ぐためにマウスの眼を濡らす。 </li><li>頭蓋骨を露出させる正中頭皮の切開を行い、与えられた座標に歯科用ドリルバリを使って頭蓋骨に穴ドリル：後部2ミリメートルとブレグマに横方向の2ミリメートルです。 </li><li>簡単に渦細胞懸濁液を、シリンジで細胞懸濁液を吸引除去する。 </li><li>硬膜の下に2.5mmの深さに注射針を置き、1分間の圧力平衡を可能にします。 </li><li>自動マイクロインジェクションポンプを用いて、硬膜下2mmの深さで、0.70μL/ minの速度で3μlの細胞懸濁液（4×10 5細胞）を注入します。 </li><li>注入された細胞懸濁液の逆流を防ぐために、さらに5分間待ちます。 </li><li>徐々に針を撤回し、皮膚を縫合する前に、皮膚の境界線を消毒する。 </li><li>脱水を防ぐために、皮下に300μlの0.9％NaCl溶液を注入し、麻酔から回復するための加熱ランプの下にマウスを置きます。 pを管理OST-手術機関の規格に準拠した鎮痛剤。 </li></ol> （3）in vivoでの生物発光で <ol><li>イソフルランと酸素の3％の混合物でマウスをAnaesthetize。 </li><li>フォトンイメージャーでマウスを配置し、イソフルランと酸素1.5％に麻酔レベルを減らすことができます。 </li><li>静脈内に体重kg当たり150 mgのD-ルシフェリンを注入します。 </li><li>写真Visionソフトウェアを使用して、5分間の画像を取得します。 </li><li> M3visionソフトウェアを使用して画像処理を実行します。興味の固定領域を使用して観測信号を定量化する。 </li></ol> （4） 生体磁気共鳴イメージング <ol><li> N 2 O（3:7）：O 2の混合物中のイソフルラン3％のマウスをAnaesthetize。 </li><li>水平方向の9.4T MRシステムの制止にマウスを置き、O 2の混合物中のイソフルラン1％に麻酔レベルを低減：N 2 O（3:7）。 </li><li>脱水を防ぐためにマウスの眼を濡らするには、マウスの腹の下にセンサーを配置することによって、体温をモニターし、呼吸数を監視するために直腸プローブを接続します。 </li><li> 110±1分あたり10回の呼吸で呼吸を維持し、±0.5 37℃の狭い範囲内で体温を一定に保つ</li><li>マウスヘッドとの位置磁石の中央にマウスの上に表面RFコイルを配置します。 </li><li> 70μmの2の面内分解能を持つ幹細胞の移行を検討するために、特定の解剖学的情報を得るための10の冠状T2強調スピンエコー（SE）のイメージのセットを取得し、T2 *強調グラディエントエコー（GE）の画像。次のように配列パラメータを設定します。繰り返し時間（TR）：500ミリ秒、エコー時間（TE）：8ミリ（GE系列）と繰り返し時間（TR）：4200ミリ秒、エコー時間（TE）：12.16ミリ秒（SEシーケンス）。視野（FOV）：18×18 mm 2で 、マトリクス：256×256、1ミリメートルのスライス厚1 mmのスライス分離（Paravision 5.1ソフトウェア）。 </li><li>データ処理を実行します。アミラ4.0ソフトウェアを使用します。 </li></ol> 5。死後組織学<ol><li>イソフルラン（4％）、酸素（0.5 L / min）と窒素（1 L / min）で2分間混合物の吸入により、非常に深くマウスをAnaesthetize。頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。 </li><li>頭蓋骨から、マウスの脳を取り出して、2時間PBS中4％パラホルムアルデヒド中で脳組織を固定。 </li><li>スクロースの異なる勾配で続いて脳を配置することによって、脳組織を脱水：PBS中20％スクロース中で一晩、PBS中の10％ショ糖でPBS、2時間で5％スクロース、2時間。 </li><li>液体窒素を用いて脳組織を凍結し、切片まで-80℃で組織を格納します。 </li><li>クライオスタットを用いて厚さ10μmのセクションのセクション脳組織。 </li><li>画面はGB MPIO粒子と蛍光顕微鏡を用いたeGFPを発現する細胞からの緑色蛍光から青色蛍光のために凍結切片を無染色。 </li><li>画面には、のために凍結切片を無染色炎症性細胞からの赤/緑バックグラウンドの蛍光。 </li><li>携帯移植と相互作用する内因性の細胞集団（例えば、ミクログリア、アストロサイト、T細胞、...）を識別するために、さらに免疫組織化学的および免疫蛍光染色を行います。 </li></ol> 6。代表的な結果ここでは視覚的にマウスの中枢神経系におけるルシフェラーゼ/ EGFPを発現する（幹）細胞集団の成功したマルチモーダルイメージングのためのイベントの最適な順序を提示した。最初に、簡単に検証することができますBMSC-Luc/eGFP細胞の非常に効率のよいラベリングに記載さギガバイトMPIOラベリング手順の結果は、蛍光顕微鏡（ 図2A）を使用します 。マウスの中枢神経系にBMSC-Luc/eGFPのラベルが付いた次の、GB MPIOの移植時に、細胞の移植片の生存率はルシフェラーゼ活性（ 図2B）に基づいて生体内 BLI で監視することができます。さらに、移植細胞の正確な局在は、 生体内で監視することができます</em&gt;のMRIは、GB MPIO（ 図2C）の鉄含有量に基づいています。最後に、組織学的分析は、BLIとMRIにより得られた結果の検証を可能にします。安定した生存率は時間内に安定したEGFP発現（ 図2D）により確認された。このためには、青色蛍光MPIOとのeGFP発現細胞の局在は、ローカリゼーションと移植した細胞の生存率の正確な測定が可能になります。さらに、幹細胞のこの二重蛍光標識は、5炎症性細胞によって作成されたバックグラウンドの蛍光に基づいて、偽陽性の結果を観察する可能性を減らすことができます。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" /> 図1処理シーケンスの概要<ol class="lroman"><li>細胞標識：BMSC-Luc/eGFPはmlの培養液あたり5×10 6ギガバイトMPIO粒子で標識されています。インキュベーション、24時間以下の残りの期間の16時間後、細胞をのために収穫される脳内注入。 </li><li>細胞移植：ブレグマ-2 mmで硬膜下の正中線と2 mmから2 mmの右：GB MPIOはBMSC-Luc/eGFPは、次の座標にマウスの脳に移植されているラベル。 </li><li> 生体 BLI の場合 ：150 mgのD-luciferin/kg体重以下の静脈内投与は、生成された光は、フォトンイメージャを使用して5分の間に買収されました。 </li><li> 生体内 MRI で 70μmの2の面内分解能10コロナのT2強調スピンエコー（SE）の画像とT2 *強調グラディエントエコー（GE）の画像のセットが取得された。シーケンスパラメータは以下の通りであった繰り返し時間（TR）：500ミリ秒、エコー時間（TE）：8ミリ（GE系列）と繰り返し時間（TR）：4200ミリ秒、エコー時間（TE）：12.16ミリ秒（SEシーケンス）。視野（FOV）：18×18 mm 2で 、マトリクス：256×256、1ミリメートルのスライス厚1 mmのスライス分離。 </li><li>事後組織：10μmの厚さの凍結切片を発現しているEGFPおよび青色蛍光標識されたBMSC uのためのスクリーニングを行った蛍光顕微鏡を歌う。 </li></ol><img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" /> 図2幹細胞移植のマルチモーダルイメージング<ol class="ualpha"><li>氷青（GB）MPIOラベルBMSC-Luc/eGFPの直接免疫蛍光顕微鏡検査法。 </li><li> 4×10 5ギガバイトMPIOを注射したマウスの in vivo BLI で移植後1週と2週目BMSC-Luc/eGFP細胞を標識した。第1週と2週後の移植で検出されたBLI信号の統計的分析。データは5分の期間から平方センチメートル当たりステラジアンあたりの毎秒の光子数の平均値（PH / S / SR / cm 2）のように表される+ / -クリアBLI信号を示すマウスに関心の固定領域から計算された標準誤差注射部位。 </li><li>コロナの二次元ギガバイトMPIOのMRIラベルBMSC-Luc/eGFP（左のパネルは、（i）T2強調スピンエコー画像と、（ii）T2 *強調グラディエントエコー画像）とBMSC-Lラベルが付いていないUC / EGFP（右パネル：（III）T2強調スピンエコー画像、および（vi）T2 *強調グラディエントエコー画像）をマウス脳に移植。 </li><li>ギガバイトMPIOの組織学的解析では、2週後の移植でBMSC-Luc/eGFPインプラントを標識した。 eGFPを発現し、GB MPIOラベルBMSC-Luc/eGFP移植のローカライズは、（i）直接免疫蛍光分析。 （ii）の高倍率の詳細（I）。 （ⅲ）GFAP抗原に対する免疫蛍光染色、GB MPIOラベルBMSC-Luc/eGFPの周囲のアストロサイトの瘢痕組織の発展を示す。ギガバイトMPIOのIBA-1抗原、侵略を示すと周囲のために（VI）の免疫蛍光染色は、ミクログリアによってBMSC-Luc/eGFPのラベルが付いた。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、利害の衝突を宣言しません。

本稿では、免疫有能なマウスの中枢神経系の細胞のインプラントの詳細な特性のための3つの相補的なイメージングモダリティの組み合わせ（BLI、MRIおよび組織）のために最適化されたプロトコルを記述します。レポーター遺伝子ルシフェラーゼ及びEGFP、およびGB MPIOとの直接的な細胞標識と遺伝的改変に基づく細胞のレポーター遺伝子標識の組み合わせは、in vivoで幹細胞移植の正確な評価につながります。 アニオン性表面（カルボキシル代替）との組み合わせでBMSCの粒子ラベリング、GB MPIO粒径（1.63μm）のために16から18の非貪食細胞によるこれらの粒子のエンドサイトーシスの取り込みを容易にするために提案されている。しかし、それは高い標識効率を得るためのインキュベーション時間は細胞の種類に依存することに言及する必要があります。例えば、貪食細胞（マクロファージや樹状細胞など）をより迅速に、これらの粒子を内部化することができます（0.5のインキュベーション時間 - 1時間）効率のよいラベリングには最低限16時間のインキュベーション時間を必要とす...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> IMDM </td><td>ロンザ</td><td> BE12-722F </td><td>細胞増殖培地、CEMのコンポーネント</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>ギブコ</td><td> 10270-106 </td><td>細胞増殖培地、CEMのコンポーネント</td></tr><tr><td>ウマ血清</td><td>ギブコ</td><td> 1605-122 </td><td>細胞増殖培地、CEMのコンポーネント</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15140 </td><td>細胞増殖培地、CEMのコンポーネント</td></tr><tr><td>ファンギゾン</td><td>ギブコ</td><td> 15290-018 </td><td>細胞増殖培地、CEMのコンポーネント</td></tr><tr><td> PBS </td><td>ギブコ</td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Invivogen </td><td> ANT-PR-1 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</tD&gt; <td>ギブコ</td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td>ギガバイトMPIO </td><td>前髪研究所</td><td> ME04F/7833 </td><td></td></tr><tr><td> D-ルシフェリン</td><td>プロメガ</td><td> E1601 </td><td></td></tr><tr><td>ケタミン（ケタラール） </td><td>ファイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラジン（Rompun） </td><td>バイエルヘルスケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルレン</td><td> Isoflo </td><td> 05260から05 </td><td></td></tr><tr><td> 0.9％NaCl溶液</td><td>バクスター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>メルク</td><td> 1.04005.1000 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td> Applichem </td><td> A1125 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションポンプ</td><td> KD科学的</td><td> KDS100 </td><td></td></tr><tr><td>フォトンイメージャ</td><td> Biospaceラボ</td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> 9.4T MRスキャナ</td><td>ブルカーバイオスピン</td><td> Biospec 20分の94 USR </td><td></td></tr><tr><td> BX51顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BX51 </td><td></td></tr><tr><td> Mycrom HMクライオスタット</td><td> Prosan </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>ハミルトン</td><td> 7635から01 </td><td></td></tr><tr><td> 30ゲージの針</td><td>ハミルトン</td><td> 7762から03 </td><td></td></tr><tr><td>フォトビジョンソフトウェア</td><td> Biospaceラボ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> M3visionソフトウェア</td><td> Biospaceラボ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paravision 5.1ソフトウェア</td><td>ブルカーバイオスピン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アミラ4.0ソフトウェア</td><td>顔イメージング</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

過去10年間の間に、幹細胞移植は、病気、前臨床および臨床試験の両方の様々なプライマリまたはセカンダリの治療法として注目を集めています。しかし、機能的転帰、および/または組織再生、次の幹細胞移植に関する結果を最新の状態には非常に多様である。一般的に、臨床的利益は、基礎となるメカニズム（S 1）の深遠な理解せずに観察される。したがって、複数の努力が正確に移植した幹細胞及び/又はそれらの微小環境の生存、運命学と生理学を評価するための究極の目的とした移植幹細胞を監視する別の分子イメージングモダリティの発展につながっている。分子イメージングによって決定される1または複数のパラメータで観察された変化は観察され、臨床効果に関係している可能性があります。この文脈において、我々の研究は、生物発光イメージングの併用（BLI）、磁気共鳴イメージング（MRI）や組織学的analysiに焦点を当てる移植幹細胞を評価するための。 BLIは、一般的に（ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する細胞は、その基板の光は、次の相互作用を放出することができる生化学的反応に基づいて、非侵襲的に細胞の追跡を行い、移植2月7日以下の時間での細胞生存率を監視するために使用されます例えば、D-は、ルシフェリン）8、9。一方、MRIは10、臨床的に適用される非侵襲的手法であり、その感度は非常にMRI造影剤による細胞標識後に生成されたコントラストに依存しますが、正確には非常に高い分解能11月15日で細胞の移植を見つけるために使用することができます。最後に、事後組織学的分析は、最高の解像度と感度で非侵襲的手法で得られた研究成果を検証するための最適な方法です。また、エンドポイント組織学的分析は、Ba、私たちは移植した細胞および/または周囲の組織の詳細な表現型の解析を実行することができます蛍光レポータータンパク質および/または特異的抗体との直接的な細胞標識の使用上のSED。 要約すると、我々はここで視覚的に別の幹細胞および/または環境関連マウスの中枢神経系に移植幹細胞を次のような特徴を解明するためにBLI、MRIおよび組織の補完性を示しています。青色蛍光ミクロンサイズの酸化鉄粒子（MPIOs）は、グラフトされたされると遺伝的に強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）とホタルルシフェラーゼ（fLuc）を発現するように設計、および標識された例として、骨髄由来のストローマ細胞、免疫有能なマウスと結果のCNS ​​は、BLI、MRIと組織像（ 図1）によって監視されます。

死後組織学的分析をin vivoで生物発光および磁気共鳴イメージング（I）、及び（ii）この記事では、使用して、齧歯類の脳における細胞移植のマルチモーダルイメージングのためのイベントの最適なシーケンスを説明しています。単一の動物でこれらの画像診断法を組み合わせることで高分解能、感度と特異性を有する細胞の移植を評価することができます。

過去10年間にわたり、幹細胞移植はさまざまな疾患に対する一次的または二次的な治療法として関心が高まっており、...

この手順の全体的な目的は、マウス脳に移植された幹細胞のin vivoにおける挙動について、標準化された追跡調査を行うことです。これはまず、EGFPとルシフェラーゼを共発現させた骨髄由来間質細胞を、蛍光標識されたマイクロサイズ酸化鉄粒子で標識することによって達成されます。次のステップでは、MPIOで標識したBMCをマウスの脳組織に適切に注入します。次に、バイオリミネッセンスイメージングおよび磁気共鳴イメージングを用いて、細胞移植片の生存と局在を非侵襲的に追跡します。最終ステップは、死後の組織学的解析を用いてin vivoイメージングの結果を検証することです。これらの手法は、マウス脳への移植後における幹細胞の挙動に関する知見を提供しますが、モデル生物や疾患研究などの他の系にも適用可能です。静脈内および脳内注射は手技が難しく、動物の生存に影響を及ぼすリスクがあるため、動物のハンドリング手順を習得することが困難です。したがって、本手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。この手順を開始するには、sub confluentな増殖中の細胞培養液に 75 × 10⁶ 個の glacial blue マイクロンサイズ酸化鉄粒子を添加します。エンドサイトーシスによる粒子の取り込みを促すため、さらに 16 時間インキュベートし、その後、残りの粒子を洗浄して取り除きます。細胞のコンフルエンスを得て、G-B-M-P-I-Oを均一に分布させるため、さらに24時間培養します。その後、蛍光顕微鏡を用いて、EGFP陽性細胞の総数に対するEGFP陽性かつG-B-M-P-I-O陽性細胞の割合を算出することで、粒子の取り込みを視覚的に検証します。次に、G-B-M-P-I-Oで標識したBMSCルシフェラーゼEGFP細胞を、10 millilitersで2回洗浄します。トリプシンEDTAで細胞を処理し、その後回収します。次いで細胞を洗浄し、PBS中で最終濃度が133×10⁶ cells/mLとなるように再懸濁します。最後に、移植まで細胞を氷上で保持します。本手順では、ケタミン 80 mg/kg とキシラジン 16 mg/kg の混合液を腹腔内投与し、マウスを麻酔します。マウスが入眠するまで5分間待ち、その後、無菌的操作を行うために頭部を剃毛します。次に、マウスを脳立体定位固定装置に固定し、皮膚をアルコールで消毒します。その後、脱水を防ぐために眼軟膏を塗布します。海馬を標的とするため、正中線に沿って頭皮を切開し、頭蓋骨を露出させます。歯科用ドリルバーを用い、後方に2 mm、外側に2 mmの位置に頭蓋骨の穿孔を行います。ここで、細胞懸濁液を短時間ボルテックスし、シリンジで細胞懸濁液を吸引します。続いて、注射針を硬膜下 2.5 millimeters の深さまで下ろし、1分間圧力を平衡化させます。1分後、針を硬膜下 2 millimeters の位置まで引き上げます。次に、自動マイクロインジェクションポンプを用い、0.70 µL/min の速度で 3 µL の細胞懸濁液を注入します。注入後、注入した細胞懸濁液の逆流を防ぐため、さらに 5 分間待ちます。その後、ゆっくりと針を後退させます。その後、皮膚の縁を消毒し、皮膚を縫合します。脱水を防ぐため、0.9% sodium chloride solution 300 µLを皮下に注射します。最後に、マウスを保温ランプの下に置き、麻酔から回復させてから生物発光イメージングを行います。3%イソフルランと酸素の混合ガスでマウスを麻酔します。その後、マウスをフォトニクスイメージャー内に配置します。イソフルランの濃度を1.5%に調整し、麻酔レベルを下げます。次に、D-ルシフェラーゼを体重1kgあたり150mgの用量で静脈内注射します。Photo Visionソフトウェアを使用して、5分間画像を撮影します。その後、M3 Visionソフトウェアを用いて画像処理を行い、固定した関心領域（ROI）を用いて観察された信号を定量化します。磁気共鳴画像法（MRI）を行う際は、酸素と一酸化窒素の混合ガス中において、3%イソフルランでマウスを麻酔してください。次に、マウスを水平型9.4 Tesla MRシステムの拘束具に入れます。イソフルランを1%に調整し、麻酔レベルを下げます。続いて、脱水を防ぐためにマウスの目に軟膏を塗布します。その後、直腸プローブを用いて体温をモニタリングします。次に、呼吸数をモニタリングするためにマウスの腹部にセンサーを配置します。呼吸数を110 ± 10回/分に維持し、体温を37 ± 0.5 °Cの狭い範囲で一定に保ちます。その後、マウスの頭頂部に表面RFコイルを配置します。マウスをマグネットの中央に配置します。次にParaVision 5.1を開きます。付属の原稿に従ってシーケンスパラメータを設定してください。その後、特定の解剖学的情報を得るために、10枚の冠状面T2強調スピンエコー画像を取得します。70 µm²の平面解像度で幹細胞の遊走を研究するため、NT 2-star加重グラディエントエコー像を取得します。このステップで、マウスを犠牲にして脳を取り出します。脳組織を室温で、PBSで調製した4%パラホルムアルデヒドを用いて2時間固定します。2時間後、脳組織を4°Cで異なる濃度のショ糖溶液に浸し、脱水させます。翌日、液体窒素を用いて脳組織を凍結し、切片作成まで-80°Cで保存します。クライオスタットを用いて、脳組織を10 micrometer厚の切片に作成します。その後、蛍光顕微鏡下で、未染色の凍結切片におけるG-B-M-P-I-O粒子由来の青色蛍光およびEGFP発現細胞由来の緑色蛍光を確認します。続いて、未染色の凍結切片において、炎症細胞による緑色および赤色の背景蛍光を確認します。記述されたglacial blue MPIOによる標識手順により、BMSC、ルシフェラーゼEGFP細胞を極めて効率的に標識することができ、これは蛍光顕微鏡を用いて容易に検証可能です。次に、G-B-M-P-I-Oで標識したBMSC、ルシフェラーゼEGFP細胞をマウスの中枢神経系（CNS）に移植すると、ルシフェラーゼ活性に基づくin vivo生物発光イメージングによって、移植細胞の生存をモニタリングできます。さらに、glacial blue MPIOの鉄含有量に基づくin vivo磁気共鳴イメージングにより、移植細胞の正確な局在をモニタリングすることが可能です。最後に、組織学的解析により、生物発光イメージングおよび磁気共鳴イメージングで得られた結果の妥当性が示されました。移植後の経過時間において、EGFPの発現が安定して維持されていることで、安定した生存が確認されました。本手法は、分子イメージング分野の研究者が、神経変性疾患のさまざまな動物モデルにおける幹細胞移植後の細胞および分子レベルのイベントを探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、バイオルミネッセンスおよび磁気共鳴画像法を用いた分子イメージングの実施方法と、死後組織学的評価によるin vivo結果の適切な検証方法について深く理解することができます。

multimodal-imaging-stem-cell-implantation-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Daynac, M., et.alです。成体マウス脳室内ゾーンからの神経幹細胞および前駆細胞の細胞選別とそれらの細胞周期ダイナミクスのライブイメージング。J. Vis. Exp.

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マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

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