マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

この手順の全体的な目標は、マウスの脳に移植された幹細胞のin vivo挙動の標準化された追跡調査を達成することです。これは、最初に骨髄由来の間質細胞を標識することによって達成され、EGFPとルシフェラーゼを蛍光ミクロンサイズの酸化鉄粒子で共発現させました。第2のステップは、MPIOで標識されたBMCをマウスの脳組織に適切に注入することです。

次に、細胞移植片の生存と局在化を、生物発光イメージングと磁気共鳴イメージングを使用して非侵襲的に追跡します。最後のステップは、死後組織学的分析を使用してin vivoイメージング結果を検証することです。この方法は、マウスの脳に移植した後の幹細胞の挙動に関する洞察を得ることができますが、モデル生物や疾患の研究など、他のシステムにも適用できます。

静脈内注射や脳内注射は実施が難しく、動物の生存に対する特定のリスクを含んでいるため、動物の取り扱い手順を学ぶのが難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることは非常に重要です。この手順を開始するには、6つの氷河のブルーミクロンサイズの酸化鉄粒子に75倍10を添加し、サブコンフルエント成長細胞培養に添加します。さらに16時間インキュベートしてエンドサイトーシスによる粒子の取り込みを可能にし、残りの粒子を洗い流します。

細胞をさらに24時間増殖させて、G-B-M-P-I-Oの細胞の流暢性と均一な分布を取得します。その後、蛍光顕微鏡を使用して、EGFP陽性細胞とG-B-M-P-I-O陽性細胞の比率を計算することにより、粒子の取り込みを視覚的に検証します。次に、BMSCルシフェラーゼEGFP細胞と標識されたG-B-M-P-I-Oを10ミリリットルで2回洗浄します。

PBSは細胞をトリプシンEDTAで処理し、その後それらを収穫します。次に、報酬を細胞を洗浄し、PBS中の1ミリリットルあたり10の6番目の細胞の133倍の最終濃度で再懸濁します。最後に、移植まで細胞を氷の上に保ちます。

この手順では、ケタミンを80ミリグラム/キログラムで、キシラジンを1キログラムあたり16ミリグラムで混合した腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけます。マウスが眠りにつくまで5分間待ってから、頭を剃って無菌操作を可能にします。次に、マウスを定位フレームに置き、皮膚をアルコールで消毒します。

その後、脱水症状を防ぐためにその目に軟膏を塗ります。海馬を標的にするために、頭蓋骨を露出させるために頭皮の正中線切開を行います。デンタルドリルのバリを使用して、後方2ミリメートル、横2ミリメートルの頭蓋骨に穴を開けます。

この時点で、細胞懸濁液を短時間ボルテックスし、次にシリンジ内で細胞懸濁液を吸引します。その後、ニードルシリンジを硬膜下2.5ミリメートルの深さまで下げ、1分間圧力平衡化させます。.1分後、針を硬膜の下の2ミリメートルの位置まで引っ込めます。

次に、自動マイクロインジェクションポンプを使用して、毎分0.70マイクロリットルの速度で3マイクロリットルの細胞懸濁液を注入します。注入後、注入された細胞懸濁液の逆流を防ぐために、さらに5分間待ちます。次に、針をゆっくりと引っ込めます。

その後、皮膚の境界を消毒し、皮膚を縫合します。脱水症状を防ぐために、300マイクロリットルの0.9%塩化ナトリウム溶液を皮下に注入します。.最後に、マウスを加熱ランプの下に置き、麻酔からの回復を可能にして生物発光イメージングを行います。

3%iso、フッ素、および酸素の混合物でマウスを麻酔します。次に、マウスをフォトンイメージャーに置きます。イソフッ素を1.5%に調整して麻酔レベルを下げます次に、体重1キログラムあたり150ミリグラムでdルシファーを静脈内注射します。.

フォトビジョンソフトウェアを使用して5分間画像を取得します。その後、M three ビジョンソフトウェアを使用して画像処理を行い、固定関心領域を使用して観測信号を定量化します。磁気共鳴画像法を行うには、酸素と一酸化窒素の混合物に3%ISOフッ素をマウスに麻酔します。

次に、マウスを水平の9.4テスラMRシステムの拘束具に置きます。イソフッ素を1%に調整して麻酔液を下げます次に、マウスの目に軟膏を塗布して脱水症状を防ぎます。その後、直腸プローブを使用して体温を監視します。

次に、マウスの腹の下にセンサーを配置して、呼吸数を監視します。呼吸数を1分間に10回±110回に保ち、体温は摂氏37度±0.5度の狭い範囲で一定に保ちます。次に、表面のRFコイルをマウスヘッドの上に置きます。

マウスをマグネットの中央に置きます。次に、ParaVision 5.1を開き、付属の原稿に従ってシーケンスパラメータを設定します。次に、特定の解剖学的情報を取得するために、10個のcoronal T 2加重スピンエコー画像のセットを取得します。

NT 2 つ星加重勾配エコー画像は、幹細胞の移動を 70 マイクロメートル四方の平易な解像度で研究するためのものです。このステップでは、マウスを犠牲にし、脳を取り出します。脳組織を室温で4%パラアルデヒドのPBSに2時間固定します。

2時間後。脳組織を摂氏4度のスクロースの異なる勾配に配置することにより、脳組織を脱水します。翌日、液体窒素を使用して脳組織を凍結し、準備ができたら切片化するまで組織を摂氏マイナス80度で保存します。

クライオスタットを使用して脳組織を厚さ10マイクロメートルの切片に切片化します。その後、蛍光顕微鏡下で、未染色のクライオ切片をスクリーニングし、G-B-M-P-I-O粒子からの青色蛍光とEGFP発現細胞からの緑色蛍光を観察します。次に、炎症細胞からの緑色、赤色の背景蛍光について、未染色のクライオ切片をスクリーニングします。

記載されている氷河の青色MPIO標識手順により、BMSC、ルシフェラーゼEGFP細胞の非常に効率的な標識が可能になり、蛍光顕微鏡で容易に検証できます。次に、マウスのCNSでG-B-M-P-I-O、標識BMSC、ルシフェラーゼEGFP細胞を移植すると、ルシフェラーゼ活性に基づくin vivo生物発光イメージングにより、細胞移植片の生存を監視できます。さらに、グラフト細胞の正確な局在は、氷河の青色MPIOの鉄含有量に基づくin vivo磁気共鳴画像法によって監視できます。

最後に、組織学的解析では、生物発光イメージングと磁気共鳴イメージングによって得られた結果の検証が示されています。安定した生存は、その開発後の時間内に安定したEGFP発現によって確認されました。この技術は、分子イメージングの分野の研究者が、神経変性疾患のさまざまな動物モデルで幹細胞移植後の細胞および分子イベントを調査する道を開きました。

このビデオを見れば、分子イメージングの実施方法、生物発光イメージングや磁気共鳴イメージングの適用方法、死後組織学的評価を用いたin vivo結果の検証方法について十分に理解できるはずです。