Name: ホット水 - フェノール抽出によるグラム陰性菌からの精製とリポ多糖の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 学ぶグラム陰性菌からのリポ多糖精製法。ホット水-フェノール抽出とSDS-PAGEによる可視化で、LPSの性状解析と免疫学研究に貢献する技術を習得できます。

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この作品は、健康と嚢胞性線維症財団の国立研究所からの補助金によってサポートされていました。

1。 LPS抽出のための細菌の調製<ol><li>必要に応じて抗生物質を補充したルリア培地（LB）、5mlに一晩培養を開始します。 °C、200 rpmは37℃で振盪インキュベーターで一晩培養し（12-18時間）に成長。 </li><li> LBで培養1:10に希釈し、分光光度計でOD 600値を読み取ります。 OD 600が読みに基づいて、0.5のOD 600に細菌の1.5 mLの懸濁液を作る。 </li><li>ペレットを10分間10600×gで遠心中の細菌。上清を除去し、廃棄します。 LPSはすぐに抽出される予定されていない場合、ペレットは、-20℃で保存することができます。 </li></ol> 2。 LPSの抽出<ol><li>最初に、2倍のSDSバッファーを準備します。 4パーセントβ-メルカプトエタノール（BME）、0.1 Mトリス-HCl、pH 6.8で4％SDS、20％グリセロール50mLの溶液を作る。ソリューションを染めるためにブロモフェノールブルーのピンチを追加します。 2X sを希釈することにより、1×SDS-緩衝在庫を作る滅菌蒸留H 2 Oでタック午前1時01分これは室温で保存することができます。 </li><li>のDNase I、RNaseを、滅菌蒸留H 2 O中のプロテイナーゼKの3つの独立した10 mg / mLのソリューションを作成する</li><li> 1X SDS-緩衝液200μlのステップ1.3からペレット化細菌を再懸濁します。ペレットが完全にゆっくりと上下にソリューションをピペッティングにより再懸濁していることを確認します。ボルテックスしないでください。 </li><li> 15分間水浴中に懸濁させ、細菌を沸騰させる。ソリューションは、室温で15分間冷却することができます。 </li><li> 2.2で調製したDNase IとRNaseの両方のソリューションの5μlを追加します。 30分間37℃でサンプルをインキュベートします。 *このステップはオプションです。ヌクレアーゼ処理および非処理サンプル間のLPSの質の最小の差があります。 </li><li> 2.2で調製したプロティナーゼK溶液10μlを追加します。 3時間59°Cでサンプルをインキュベートします。時間の制約がある場合は、このステップは、一晩行うことができます。 </li><li>各サンプル、広告へのd 200μlの氷冷したトリス飽和フェノール（トリス飽和フェノールが利用できない場合は水飽和フェノールを代替として使用されるかもしれません）。チューブのキャップがしっかり閉じていることを確認し、約5〜10秒間ボルテックスし、各サンプル。 </li><li>時折ボルテックス、15分間65℃でサンプルをインキュベートします。室温まで冷却インキュベートした後、その後5〜10秒ごとにサンプルをボルテックスに室温でジエチルエーテル1mLを追加します。それは揮発性であるので、ドラフト内でハンドルエーテルを実行してください。 </li><li> 10分間、20600×gでサンプルを遠心分離します。遠心機からサンプルを削除して、底青色層を抽出します。上部の、明確な層を避けるようにしてください。青層に少量の後ろのままにしておくと、上位層の汚染に好適である。 </li><li> 2.9 - 手順2.7を繰り返して、サンプルを再抽出します。二つの抽出は、通常は十分です。サンプルは曇って表示される場合は、より多くの抽出は、performeかもしれませんD。 SDS-PAGEで分離する前に抽出したサンプルのそれぞれに2×SDS-緩衝液200μlを追加します。サンプルは、8％-15％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で実行することができます。この方法を用いて調製したLPSの5〜15μlの可視化のために通常は十分です。 </li></ol> 3。代表的な結果上記のように調製したLPSのサンプルは、標準的な銀染色プロトコルまたは市販のLPS染色キットを用いたSDS-PAGE上で分離した後、直接染色により可視化することができます。また、ポリアクリルアミドゲル上で分離し、LPSをニトロセルロース膜に移し、LPS特異的抗血清を用いてイムノブロッティング西にさらされる可能性があります。このプロトコルのために、我々は、Pro-Qエメラルド300リポ多糖ゲル染色キット（Molecular Probes社）を使用し、製造元の指示に従った。 図1に示すようには、Pro-Qエメラルド300染色された12％SDS-ポリアクリルアミドゲルである。各レーンは、DIFから調製したLPSの15μlを含まれていますバークホルデリアdolosaのferent株は、嚢胞性線維症患者の喀痰検体から分離された。ラダーパターンをバンド別のLPSは、異なる数値型糖鎖コアに接続された繰り返し単位のO-抗原の反射は、このメソッドを使用して明白である。たとえば、レーン1と6のサンプルでは、​​お互いに類似したバンディングパターンを持っている（赤の囲み）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3916/3916fig1.jpg" /> 図1プロQエメラルドバークホルデリアdolosa臨床分離株から300ステンドLPS。 7 BからのLPSこのプロトコルで説明するように嚢胞性線維症患者の発生からdolosa株が単離された。十五μlを12％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Pro-Qエメラルド300で染色し、製造元の指示に従って行った。 LPSコアは、矢印を示され、O抗原の繰り返し同様のバンドパターンを示したLPSは、赤で囲んだされています。 M =分子量マーカー。

<ol><li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+O-specific+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li>
<li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide%3A+a+major+virulence+factor%2C+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li>
<li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection%3A+LPS%2C+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li>
<li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).</li>
<li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1%3AK20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%3A+a+class+of+serum-sensitive%2C+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li>
<li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li>
<li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li>
<li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohyr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83(1965).</li>
<li>Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+TD+%22Nat+Genet%22">Nat Genet</a>. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

我々は、核酸やタンパク質を含む他の細胞成分から、LPSを離れて精製する方法を説明してきました。このメソッドは、図1に示すように、SDS-PAGEゲルの炭水化物染色など、さまざまな可視化手法、数で使用することができる高品質のLPSを提供しています。このメソッドは、特定の抗血清を使用して、株の様々なLPSの血清型に、または直接可視化による分離株の間に関連性を示すために使用することができます。 Bの発生からLPSの特性との組み合わせで例えば、最近のゲノムワイドなシークエンシングプロジェクトdolosaは、これらの株の11のLPSの存在下および非存在と相関する一塩基多型（SNP）の発見につながった。我々は、さらなる分析のために高品質のLPSをもたらすのに十分な厳格なまだ、比較的短時間であるため、このメソッドは、ヒッチコックとブラウン9で記述された全細胞溶解物のプロテアーゼ処理に好適であると信じているだ。 我々は唯一のバークホルデリアdolosaを使った例を示しながら、このプロ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DNase Iを組換え、RNaseフリー</td><td>ロシュ社</td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNaseの</td><td>ロシュ社</td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>フィッシャー</td><td> BP1700 </td></tr><tr><td>フェノールトリス飽和</td><td>フィッシャー</td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>トーマス科学</td><td> C313K31 </td></tr><tr><td>プロQエメラルド300リポ多糖ゲル染色キット</td><td>分子プローブ</td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

ホット水 - フェノール抽出によるグラム陰性菌からの精製とリポ多糖の可視化

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

リポポリサッカライド（LPS）はグラム陰性細菌の外膜の主要成分である。それは外側の膜に埋め込 ​​まれている、セル1、2の表面から外側に延びるコア糖鎖とO-抗原繰り返し単位脂質から成る三分子である。 LPSは、 緑膿菌、サルモネラ属、 大腸菌 3月5日を含む多くの細菌種の病原性と病原性に重要である免疫分子であり、LPS O抗原組成の違いは、株の血清型の基礎を形成する。 LPSは、感染の開始時に宿主細胞に付着に関与しており、補体媒介性の殺害からの保護を提供されています。LPSを欠いている株は病原性6-8減衰させることができる。これらの理由から、特に臨床分離株から、LPSを可視化することが重要です。具体的なパターンとの認識をバンディングの可視化LPSntibodiesは、ひずみの系統を識別するために、様々な変異体を特徴づけるために有用なツールにすることができます。 本稿では、グラム陰性細菌の細胞からのLPSの単離および精製のためのホット水 - フェノール法を説明します。このプロトコルは、距離が短く、より集中的な抽出方法9で発生したLPSの可視化を妨げる可能性核酸とタンパク質からLPSの抽出が可能になります。 LPSは、この方法は糖鎖/糖タンパク質汚れや標準の銀染色法を用いたドデシル硫酸ナトリウム（SDS） - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）と直接に染色されたで区切ることができます用意しました。 LPSには多くの抗血清では反応性を妨げることができる外膜タンパク質または他の抗原ターゲットと交差反応する抗体を含むSDS-PAGEで区切られた粗細胞溶解物のウエスタンブロット後に観察した。単独で粗細胞溶解物のプロテアーゼ処理は、常にこの除去の効果的な方法ではありませんこのまたは他の可視化方法を使用して背景。さらに、このような背景を削除しようとの広範なプロテアーゼ処理も、上述のいずれかの方法によって解決されていない低品質のLPSにつながる可能性があります。これらの理由から、我々はWestpahlとジャン10から適応し、次のプロトコルは、LPSの抽出のための理想的であると信じています。

私たちは、グラム陰性菌からリポ多糖（LPS）を浄化するための変更されたホット水 - フェノール抽出法について説明します。一度抽出し、LPSは、その後、SDS-PAGEで分析し、直接染色またはウェスタンブロットによって可視化することができます。

リポ多糖（LPS）は、グラム陰性菌の外膜の主要成分である。これは、リピドAからなり、...

この手順の全体的な目的は、グラム陰性細菌からLPSを抽出することです。まず、適切な培地で細菌を5 mLで一晩培養し、600 nmにおける吸光度（OD600）を0.5に調整します。次に、マイクロ遠心分離によって細菌をペレット化し、SDSおよびbeamまたはcaptoエタノールを含むTris緩衝液で細胞を再懸濁します。次に、細胞溶解物を煮沸し、プロテアーゼおよびヌクレアーゼで処理します。最後に、加熱したフェノール水溶液とジエチルエーテルを用いて2回の連続抽出を行い、水層（青色層）を慎重に除去して回収します。最終的に、SDS-PAGEによる分離およびLPS特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析、またはゲル内での多糖類の直接染色により、LPSの有無や量、細菌株、およびO抗原鎖長の様態を示す結果を得ることができます。HitchcockおよびBrownによるプロテアーゼ処理と比較した本手法の利点は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングでより良好に分離可能な高純度のLPSサンプルが得られることです。本法は、E. coliやSalmonellaを含むほぼすべてのグラム陰性菌におけるリポ多糖の合成および調節に関する知見を提供でき、さらにEllaやAcetobacterのようなバイオディフェンス関連および新興病原体にも適用可能です。細菌を培養し、LPSを抽出するために、抗生物質を添加した5 mLのLB培地を用いてグラム陰性菌の一晩培養を行います。必要に応じて、振盪インキュベーターを用いて 200 RPM、37 °C で overnight 培養します。LBを用いて菌液を 1/10 に希釈し、その結果に基づき 600 nm での光学的密度（OD600）を測定します。最終的な OD600 が 0.5 となるように、1.5 mL の菌懸濁液を調製します。マイクロ遠心機を用いて、10,600 ×g で10分間遠心し、細菌をペレット化します。その後、上清を除去し、廃棄します。LPSを抽出するために、以下の溶液を調製します：1X SDSバッファー、4% β-メルカプトエタノールまたはBME、4% SDS、および0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) に少量のブロモフェノールブルーを加えた20% グリセロール溶液。また、滅菌蒸留水を用いて、DNAse、RNAse、およびプロテイナーゼKをそれぞれ 10 mg/mL の濃度で調製し、再懸濁します。200 µLの1×SDSバッファー中の細菌ペレットを、ピペッティングによって完全に再懸濁させます。懸濁した細菌をウォーターバスで15分間ゆっくりと沸騰させます。その後、室温で15分間冷却します。オプションの手順として、DNA溶液とRNA溶液をそれぞれ5 µLずつ加え、サンプルを37 °Cで30分間インキュベートします。プロテアーゼK溶液を10 µL加え、サンプルを59 °Cで3時間インキュベートします。各サンプルの隣に、氷冷したTris飽和フェノールを200 µL加えます。キャップをしっかりと閉め、各チューブを5〜10秒間ボルテックスします。サンプルを65 °Cで15分間インキュベートします。時々ボルテックスしながら、室温まで冷却します。次に、ドラフトチャンバー内で、各サンプルに室温のethyl etherを1 mL加え、5〜10秒間ボルテックスします。サンプルを20,600 ×gで10分間遠心分離し、慎重に遠心機から取り出します。上層の透明な層を避け、各サンプルの下層の青色層を抽出します。氷冷したTris飽和フェノールをさらに200 µL加え、各チューブで抽出を繰り返します。2X SDSバッファーを200 µL加えます。各LPSサンプルの5～15 µLを、8～15% SDSポリアクリルアミドゲルで分離します。ここに示しているのは、嚢胞性線維症患者の痰検体から分離されたbur cold area de losaの異なる菌株から調製したLPSサンプルの12%SDS-PAGEゲルの結果です。異なるバンドパターンは、コアオリゴ糖に結合しているO抗原の反復単位の数が異なることを反映しています。サンプル1と6では、同様の数の反復単位が見られます。フェノール-ジエチルエーテルを用いた操作は危険を伴うため、白衣、手袋、ゴーグルなどの個人用保護具の着用などの予防策を講じ、本手順は必ずドラフトチャンバー内で実施してください。処理中のサンプルの損失を防ぐため、抽出は迅速に行うことが重要です。本手順の後、菌株間の関連性を視覚化するために、ウェスタンブロッティングや、銀染色またはその他の方法によるリポ多糖の可視化を行う必要があります。

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Immunology and Infection

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