ホット水 - フェノール抽出によるグラム陰性菌からの精製とリポ多糖の可視化

この手順の全体的な目的は、グラム陰性細菌からLPSを抽出することです。まず、適切な培地で細菌を5 mLで一晩培養し、600 nmにおける吸光度（OD600）を0.5に調整します。次に、マイクロ遠心分離によって細菌をペレット化し、SDSおよびbeamまたはcaptoエタノールを含むTris緩衝液で細胞を再懸濁します。

次に、細胞溶解物を煮沸し、プロテアーゼおよびヌクレアーゼで処理します。最後に、加熱したフェノール水溶液とジエチルエーテルを用いて2回の連続抽出を行い、水層（青色層）を慎重に除去して回収します。最終的に、SDS-PAGEによる分離およびLPS特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析、またはゲル内での多糖類の直接染色により、LPSの有無や量、細菌株、およびO抗原鎖長の様態を示す結果を得ることができます。

HitchcockおよびBrownによるプロテアーゼ処理と比較した本手法の利点は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングでより良好に分離可能な高純度のLPSサンプルが得られることです。本法は、E. coliやSalmonellaを含むほぼすべてのグラム陰性菌におけるリポ多糖の合成および調節に関する知見を提供でき、さらにEllaやAcetobacterのようなバイオディフェンス関連および新興病原体にも適用可能です。細菌を培養し、LPSを抽出するために、抗生物質を添加した5 mLのLB培地を用いてグラム陰性菌の一晩培養を行います。

必要に応じて、振盪インキュベーターを用いて 200 RPM、37 °C で overnight 培養します。LBを用いて菌液を 1/10 に希釈し、その結果に基づき 600 nm での光学的密度（OD600）を測定します。最終的な OD600 が 0.5 となるように、1.5 mL の菌懸濁液を調製します。

マイクロ遠心機を用いて、10,600 ×g で10分間遠心し、細菌をペレット化します。その後、上清を除去し、廃棄します。LPSを抽出するために、以下の溶液を調製します：1X SDSバッファー、4% β-メルカプトエタノールまたはBME、4% SDS、および0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) に少量のブロモフェノールブルーを加えた20% グリセロール溶液。また、滅菌蒸留水を用いて、DNAse、RNAse、およびプロテイナーゼKをそれぞれ 10 mg/mL の濃度で調製し、再懸濁します。

200 µLの1×SDSバッファー中の細菌ペレットを、ピペッティングによって完全に再懸濁させます。懸濁した細菌をウォーターバスで15分間ゆっくりと沸騰させます。その後、室温で15分間冷却します。

オプションの手順として、DNA溶液とRNA溶液をそれぞれ5 µLずつ加え、サンプルを37 °Cで30分間インキュベートします。プロテアーゼK溶液を10 µL加え、サンプルを59 °Cで3時間インキュベートします。各サンプルの隣に、氷冷したTris飽和フェノールを200 µL加えます。

キャップをしっかりと閉め、各チューブを5〜10秒間ボルテックスします。サンプルを65 °Cで15分間インキュベートします。時々ボルテックスしながら、室温まで冷却します。

次に、ドラフトチャンバー内で、各サンプルに室温のethyl etherを1 mL加え、5〜10秒間ボルテックスします。サンプルを20,600 ×gで10分間遠心分離し、慎重に遠心機から取り出します。上層の透明な層を避け、各サンプルの下層の青色層を抽出します。

氷冷したTris飽和フェノールをさらに200 µL加え、各チューブで抽出を繰り返します。2X SDSバッファーを200 µL加えます。各LPSサンプルの5～15 µLを、8～15% SDSポリアクリルアミドゲルで分離します。

ここに示しているのは、嚢胞性線維症患者の痰検体から分離されたbur cold area de losaの異なる菌株から調製したLPSサンプルの12%SDS-PAGEゲルの結果です。異なるバンドパターンは、コアオリゴ糖に結合しているO抗原の反復単位の数が異なることを反映しています。サンプル1と6では、同様の数の反復単位が見られます。

フェノール-ジエチルエーテルを用いた操作は危険を伴うため、白衣、手袋、ゴーグルなどの個人用保護具の着用などの予防策を講じ、本手順は必ずドラフトチャンバー内で実施してください。処理中のサンプルの損失を防ぐため、抽出は迅速に行うことが重要です。本手順の後、菌株間の関連性を視覚化するために、ウェスタンブロッティングや、銀染色またはその他の方法によるリポ多糖の可視化を行う必要があります。