カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）を用いてヒト神経膠芽腫のスロー非分裂細胞の同定および単離

このビデオプロトコルでは、カルボキシフルオレセインジアセテート（CFSE）を用いて、ヒト膠芽腫における低分裂細胞を同定および単離する方法を解説します。まず、ニューロスフィアアッセイを用いて膠芽腫腫瘍細胞を培養します。その後、得られたスフィアを単一細胞に解離させ、CFSEで染色します。

CFSEを導入した細胞を再び播種します。ニューロスフィア培養では、得られたスフィアを単一細胞に解離させ、フローサイトメーターで解析します。細胞分裂に伴う蛍光強度の変化に基づいて、分裂速度の遅い細胞と速い細胞を識別し、分取します。

頻度の不均一性は、がんにおける本質的な特徴です。この不均一性は腫瘍の堅牢性を支えており、完全に効果的な治療法の開発にとって大きな障害となっています。したがって、遺伝的、表現型的、および機能的に定義されるこの不均一性を研究し理解するためのツールやアッセイを開発することが極めて重要です。

このビデオプロトコルでは、fluesおよびI-C-F-S-Cを用いたスタンディング法について説明します。この手法により、異なる機能的特性を持つヒト神経膠芽腫（グリオブラストーマ）由来細胞の培養物中から、個々のサブポピュレーションをフローサイトメトリーで同定および分離することが可能になります。我々はこの手法を用いて、腫瘍の開始に関連することが示されている機能的特性である、低分裂率を示す腫瘍細胞集団を単離し、特性解析を行いました。Gliomas sphere Cultureは、画面上のアドレスにある別のビデオで説明されているneuros sphere assayを用いて構築および維持されます。

神経膠腫のスフィアの直径が150～200 µmに達したら、スフィアを含む培地を除去して適切なサイズの滅菌組織培養チューブに移し、室温で800 RPMまたは110 Gで5分間遠心分離します。その後、上清を捨て、スフィアのペレットを1 mLの予温したtrypsin EDTAに再懸濁し、37 °Cのウォーターバスで3～5分間インキュベートします。次に、等量のトリプシン阻害剤を加え、ピペッティングで穏やかに混ぜ合わせることでスフィアを解離させます。

細胞懸濁液を再度遠心分離します。上清を除去し、細胞を1 mLのニューロステム細胞基礎培地で再懸濁します。単一細胞懸濁液10 µLを90 µLのトリパンブルーとよく混ぜ合わせ、染色対象の細胞100万個ごとに細胞計数を実施します。

5 mMのCFSE染料1 µLを神経幹細胞基礎培地1 mLに添加し、最終染色濃度を5 µMとした染色試薬1 mLを調製します。その後、染色溶液を適切に混合します。次に、必要数の細胞を別のチューブに移して遠心分離し、上清を除去します。

次に、CFSE染色液をペレットに加えて均一になるまで穏やかに混合し、室温で10分間インキュベートして染色工程を停止させます。CFSEを導入した細胞に、氷冷した神経幹細胞基礎培地を5〜10倍量加え、十分に混合します。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去します。

この時点で、チューブの底部に緑色を帯びた細胞のペレットが形成されており、染色の成功が確認できるはずです。過剰なCFSE染料を除去するため、ペレットを1 mLの神経幹細胞基礎培地で再懸濁し、遠心分離して上清を捨てるという洗浄操作を2〜3回行います。

3回目の洗浄後、細胞を1 mLの神経幹細胞基礎培地で再懸濁し、前述の方法で細胞数を計測して播種します。完全神経幹細胞培地には、最終濃度が20 ng/mLとなるようにEGFを添加します。その後、CFSE負荷群および非負荷群の細胞を、最終濃度が50,000 cells/mLとなるようにそれぞれのチューブに加えてください。

次に、細胞懸濁液を十分に混合し、滅菌済みの組織培養フラスコに播種します。その後、フラスコにラベルを貼ります。蛍光顕微鏡下で細胞を観察してCFSE染色の確認を行い、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーターに5～10日間置きます。

フローサイトメトリーを用いてCFSE染色の確認を行うため、CFSEをロードした群およびロードしていない陰性対照群からそれぞれ500,000個の細胞を別々の FACSチューブに移します。フローサイトメーターは、ユーザーマニュアルの指示に従って関連パラメータを調整します。まず、ロードしていない対照細胞を解析し、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）の特性に基づいてイベントを記録します。次に、細胞頻度対CFSE強度のヒストグラムプロットにおいて、主要な細胞集団にゲートを設定し、CFSE蛍光強度のレベルを確認します。

次に、CFSE負荷細胞を、コントロール細胞に使用したものと同じパラメータを用いて解析します。明らかなように、CFSE陽性細胞はコントロール細胞よりも数桁高い蛍光強度を示します。グリオーマスフィアの平均直径が約150～200 µmに達したとき。

前述の方法に従い、スフィアを継代し、CFSE負荷群と非負荷群の両方から単一細胞懸濁液を調製します。次に、細胞を適切な量の滅菌済み1×PBSに再懸濁し、細胞数をカウントして死細胞または損傷細胞を除外します。フローサイトメトリーによるソーティングでは、緩慢増殖細胞および急速増殖細胞を回収するため、細胞懸濁液1 mlあたり1 µLの濃度でプロピジウムヨードを添加します。

ソートを行う際、完全神経幹細胞培地を1 mLずつ含む滅菌済みの15 mL組織培養チューブを2本準備します。その後、細胞を氷上に置いてフローサイトメトリー施設へ運搬します。まず、未負荷細胞群の細胞懸濁液をフローサイトメーターで解析します。

死細胞または損傷細胞を除去するため、前方散乱光（forward scatter）対側方散乱光（side scatter）に基づいてイベントをプロットします。次に、側方散乱光対PI反応性に基づいて細胞をプロットし、単一の生細胞集団をポピュレーション1としてゲートします。続いて、ポピュレーション1から前方散乱および側方散乱の特性に基づいて均一な細胞集団を選択し、ポピュレーション2としてゲートします。そして、同一のパラメータおよびゲーティング戦略を用いて、ポピュレーション2を細胞頻度対CFSE強度のヒストグラム（対数スケール）としてプロットします。

CFSEラベルした細胞をフローサイトメーターで解析します。続いて、下位85%の細胞を速い分裂細胞として、上位5%の細胞を遅い分裂細胞としてゲートします。これらの目的とする異なる細胞集団を選択し、1 mLの完全神経幹細胞培地を含む15 mL滅菌組織培養チューブにそれぞれ分注してソートします。

ソーティングの閾値速度は、1秒あたり2,500イベントを超えないように調整する必要があります。ソーティング終了後、細胞を遠心分離して上清を廃棄し、ペレットを適切な量の培地で再懸濁して細胞数を測定します。その後、異なるソート済み集団の細胞を50,000 cells/mlの密度で播種します。

20 ng/mLのEGFを添加した完全神経幹細胞培地を用い、細胞を5〜10日間培養してスフィアを形成させます。これは細胞の例です。CFSE染料で負荷した後、蛍光顕微鏡で観察すると、すべての細胞に強い緑色蛍光が認められます。

これは、A-C-F-S-Eを導入した細胞を播種して6日後に得られた代表的な神経膠腫（グリオーマ）スフィアの画像です。一部の細胞では、依然として非常に明るいCFSE染色が見られることに注目してください。こちらは、CFSE強度が時間とともに減衰することを示すフローサイトメトリーのヒストグラムの例です。

青色は、CFSEを新たに導入し、蛍光強度を示している細胞を表しています。これは、赤色で示された未導入の細胞よりも数桁高い値です。緑色は、CFSE導入後6日間にわたる細胞分裂に伴い、減衰した蛍光強度を表しています。

これらは、速い分裂速度と遅い分裂速度の細胞集団を分離して7日後に育成した代表的なスフィアである。スフィア形成頻度は2つのグループ間で差はないが、CFSC保持細胞はCFSC希釈細胞と比較して増殖が遅く、結果としてより小さなスフィアとなる。CFSCを用いて細胞分裂速度に基づいた細胞サブポピュレーションを同定および分離することは、ダウンストリーム実験やさらなる特性解析の出発点となる。

本プロトコルでは、ヒト神経膠腫（グリオマ）由来の培養細胞において緩徐に分裂する細胞を同定する例を示しましたが、これは他の腫瘍細胞株や非癌性システムにも適用可能です。ご視聴ありがとうございました。本プロトコルが皆様の研究に役立つことを願っております。