天然ムチンの分布を調べ不定、凍結組織を用いた

最適切断温度の媒体（10月）に埋め込まれた未固定凍結組織サンプルは分泌粘液の自然分布とグリコシル化を研究するために使用することができます。このアプローチ組織処理に最小限であり、糖脂質、ムチンおよび糖鎖エピトープの自然なプレゼンテーションが保存されています。組織切片を蛍光や発色検出を用いた免疫組織化学によって分析することができる。

次の実験の全体的な目標は、組織サンプル中の分泌された粘液のグリコシル化の自然な分布を維持することです。これは、まず組織を最適な切断温度、培地、またはOCTに埋め込んで組織処理を最小限に抑え、次に糖鎖構造、ムチン、粘液の検出を可能にすることで達成されます。切片は、レクチン抗体および組織化学的染色物とインキュベートされます。

レクチンの結合は、レクチンの結合特異性を確認するための糖鎖エピトープの競合阻害または酵素的切断によってさらに困難になる可能性があります。最終的に、粘液および凍結組織サンプルの保存は、神秘的な化学分析によるパラフィン包埋サンプル中の粘液の保存と比較することができます。この技術を使用する主な利点は、パレンに組織を埋め込む方法やカーノイズ溶液で固定するなどの既存の方法よりも優れている点は、この方法では特殊な固定剤を使用する必要がなく、ラボにすでに存在する可能性のある凍結組織を利用できることです。

まず、スナップ凍結組織をクライオミクロトームチャンバーに入れて、摂氏マイナス20度まで温めます。その間、浅い発泡スチロールの箱に2つのメチルブタンを追加し、次にボックスにドライアイスを追加して、冷凍浴を作成します。次に、剥がして凍結した型の底を覆うのに十分なOCTを追加し、ティッシュを型に入れます。

ティッシュが目的の向きで金型の底に載っていることを確認してください。ティッシュをより多くのOCTで覆い、次に型を冷凍浴に入れます。組織が凍結するとOCTコンパウンドが白くなります凍結したら、凍結したブロックから型をはがし、ブロックをマークされたフリーザーバッグに入れます。

凍結したブロックは、組織を切片化する前に使用するまで摂氏マイナス80度で保管してください。凍結した対象ブロックをクライオミクロトームチャンバーに約30分間置き、摂氏マイナス20度に達するまで待ちます。暖かさのブロックが厚さ3〜5マイクロメートルのセクションを切り取り、次に正に帯電したスライドガラスをセクションの上に置きます。

ティッシュは、ティッシュを30〜60分間風乾した後、スライドに付着します。スライドを10%緩衝フォーミュラで室温で30分間固定し、次にスライドをPB PBSで3回洗浄し、250ミリリットルの緩衝液に10回すばやく浸して組織をオウムで染色します。最初に青く、スライドを水ですすぎ、次に3%酢酸で3分間インキュベートします。

次に、組織をAUMブルー溶液でインキュベートします30分後、スライドをランニングで洗い、水道水を10分間してから、DI水ですすいでください。核を核速乾で5分間対比染色し、次いでスライドを脱イオン水で3回洗浄する。次に、95%エタノールで1分間インキュベートし、続いて100%エタノールで3回のクイックチェンジを行い、次に柑橘類の3回のチェンジでそれぞれ2分間分解することにより、スライドを脱水して透明にします。

最後に、Cyto seal 60などの共鳴培地を使用してスライドにカバースリップを取り付け、周期的な酸シフトで組織を染色します。まず、スライドを水ですすぎ、次に新たに調製した1%過ヨウ素酸と5分間インキュベートします。次に、スライドを水で3回洗います。

スライドをMilli Q水に一度浸し、シフ試薬で組織を染色します。15分後、スライドをランニングで洗い、さらに10分間水道水を入れてから、一度水に浸します。sgio metinで核を30秒間対比染色した後、スライドを脱イオン水で3回洗浄します。

最後に、スライドを30秒間インキュベートします。スコットの水道水では、ブルーイング試薬をDI水でさらに3回洗い、次にカルシウムブルー染色について示したように組織を脱水した後に洗います。スライドにはカバースリップを取り付け、レクチンを用いた糖鎖エピトープの蛍光検出を行います。

まず、PBSのBSAでスライドを10〜30分間ブロックします。次に、スライドをアバドンで15分間インキュベートし、続いてPBS洗浄を行い、さらにPBS洗浄後に0.01%ビオチンで15分間インキュベーションして、内因性ビオチンをブロックします。スライドを染色ボックスに入れ、調製したばかりのレクチンの混合物を各組織切片の上に重ね、レクチン混合物をパルファムで優しく覆います。

次に、1時間後にスライドを暗闇でインキュベートします。パルファムをそっと取り出し、スライドをPBSで3回洗います。次に、スライドを結合SCI 5に溶媒ストレプスで層状にし、30分後に再び暗闇でインキュベートし、スライドをPBSで3回洗浄し、ダッピーで核を対比染色します。

最後に、SASE酵素制御用のベクトルマウント封入剤などの水性媒体を用いて、カバースリップでスライドをマウントします。まず、空のチップボックスの底に水を加えて、湿ったチャンバーを形成します。ネガティブコントロールスライドを上向きにして、チップボックスの上部トレイに置きます。

150〜200マイクロリットルのUS溶液を組織切片に重ね、各スライドをカバースリップで覆い、気泡の形成を防ぎます。箱の蓋を閉め、2時間半後に箱を摂氏37度でインキュベートします。スライドをPBSで室温で3回洗浄し、遊離スリク酸を取り除きます。

次に、スライドをSNAと室温で1時間インキュベートし、競合阻害を行います。レクチン混合物の200マイクロリットルを2つのeinorバイアルにアリコートを制御します。次に、200ミリモルのジャクリーン阻害剤Melibiosをバイアルの1つに加え、SWGA阻害剤キチン加水分解物を1〜10希釈で他のバイアルに加えます。

次に、スライドを阻害剤含有混合物と室温で1時間インキュベートします。この最初の図組織では、OCTで凍結またはパラフィンに包埋されたクミンマウスまたはニワトリの結腸標本の切片を、ピンクの過ヨウ素酸シフまたは青色のカルシウムブルーで染色しました。パラフィンに包埋された組織サンプルとOCT凍結保護培地に包埋された凍結組織との比較により、凍結組織中のムチン糖タンパク質の保存と染色の質に顕著な違いが明らかになりました。

杯細胞のムチンに加えて、パラフィン包埋組織の矢印で示されるように、分泌された粘液も見えました。粘液染色は杯細胞に限定されました。この図では、柑橘類の分離でインキュベートされたムチンと組織の大幅な損失が観察できます。

冷凍鶏回腸標本の連続切片を10%緩衝ホルミンに固定して水和させ、エタノールで70%90%および100%エタノールでそれぞれ20分間連続インキュベートすることにより脱水するか、エタノールで脱水した後、柑橘類で1時間すべて清澄化した。エタノール脱水のみ、エタノール脱水と柑橘類のすべてがクリアリングされ、組織の形態が改善されました。さらなるエタノール脱水だけでは、青色染色に有意な影響はありませんでした。

対照的に、柑橘類のすべてのインキュベーションは、前の図で見られたパラフィン包埋組織で観察されたのと同様のパターンで、青色染色をゴブレット細胞に減少させ、閉じ込めました。ボックスは、アリウムブルーステイン組織切片の高倍率の領域を示しています。この次の一連の画像では、OCTで凍結またはパラフィンに包埋されたニワトリ回腸標本を、青のジャクリーン、緑のSWG、赤のSNAでプローブしたニワトリ回腸標本を凍結組織に示しています。

ジャクリーンがolink糖鎖に結合すると、OCT凍結組織切片の矢印で示されているように、杯細胞から内腔に滲み出ているように見える構造が明らかになりました。対照的に、パラフィン包埋組織へのジャクリーン結合は、杯細胞およびこれらの矢印で示される絨毛ブラシ境界に限定されていた。β one four GLのSWGA染色は、矢印で示されているように、凍結組織とパラフィン包埋組織の両方でジャクリーンレクチンの結合と部分的に共局在します。

対照的に、赤で矢印のじりで示されているSNAレクチンは、α two six連結シアル酸に細胞内で結合し、青色で点線の矢印で示されているジャクリーンと共局在しない。スリク酸エピトープは、USで組織切片を消化することによりニワトリ回腸標本から切断されたか、またはここに見られるようにインキュベーションおよび酢酸ナトリウム緩衝液によって切断されたままにされました。米国での治療により、未処理組織で観察されるビオチン化SNAによる染色が廃止され、シアル酸に対するSNA結合特異性が確認されました。

レクチン特異性は、ジャクリーン染色用のmely biosやSWGA染色鶏回腸標本用のキチン加水分解物などの競合阻害剤を添加することでも確認でき、再度、ジャクリーンとSWGAの混合物でインキュベートしました。今回も特定のレクチン阻害剤の存在下では、mely biosまたはキチン加水分解物ジャクリーン染色はmely biosによって阻害されましたが、キチン加水分解物では阻害されませんでした。逆に、SWGA染色はキチン加水分解物によって阻害されましたが、mely biosでは阻害されませんでした。

この最終的な一連の画像は、クリニックや研究室で日常的に採取されるスナップ凍結組織サンプルをOCTにさらに埋め込むことができ、ムチン、糖タンパク質、糖脂質、および糖鎖上の糖鎖の研究に使用できることを示しています。絨毛癌および粘液癌組織からのこれらの結腸直腸癌生検は、OCTに埋め込まれた液体窒素でスナップ凍結され、示されたさまざまなムチンおよびグリカンエピトープについて染色に成功しました。このビデオを見れば、OCTに組織を埋め込む方法と、免疫化学的手法を用いて粘液や組織のグリコシル化を分析する方法について、十分に理解できるはずです。