Name: 天然ムチンの分布を調べ不定、凍結組織を用いた (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学ぶOCT包埋凍結組織を用いたムチン糖鎖の自然分布解析法。レクチンと組織化学染色で糖鎖構造を検出し、パラフィン包埋との比較で糖タンパク質保存性を評価できます。

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著者らは、撮影時の彼の助けニコールM.ネメト（ジョージア大学）と鶏の組織を収穫で彼らの助けのためのジャンヌ·M·フェア（LANL）と、スティーブンA.スプリンガーに感謝したいと思います。この研究ではすべての鳥の世話は、ロスアラモス国立セキュリティ、LLCは、ロスアラモスのオペレータの機関動物実験委員会によって承認された実験動物とすべてのプロトコルの人道的使用のための健康のガイドラインの国立研究所を満たしていた米国エネルギー省との契約番号DE-AC52-06NA25396下の国立研究所。本研究ではマウスのケアはUCSDの動物承認されたプロトコルに準拠しています。ヒトの組織は、UCSDの承認されたIRBのプロトコルの一部として得られた。この作品は、神経疾患や脳卒中の国立研究所（ニューロ顕微鏡共用施設、UCサンディエゴ）からカリフォルニアラボ料大統領プログラム（PG）の大学とグラントNS047101から助成118645によってサポートされていました。

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

凍結組織の粘液とグリカンエピトープの保全は、パラフィン包埋した組織のものよりも優れている。我々は、分泌された粘液層の保全（ 図1および図3）、パラフィン包埋された組織と比較して凍結した組織内の3糖鎖構造（ 図3）の分布を示した。そのようなカルノア液（60％エタノール、30％クロロホルム、10％酢酸）17などの特殊な固定剤は、組織サンプル中の粘液層の最適な保全のために開発されている。理想的には、この溶液は粘液研究のために専用されており、粘液層16から17の滑らかな外観を維持することが示された組織サンプルを収集するために使用されるべきである。 10月中に埋め込まれた未定着凍結サンプルの粘液層が表示され、ゴツゴツしたいくつかの地域で組織から切り離すかもしれませんが、全体的な層の厚さはカルノア液およびembeddで固定した組織で観察されたものと一致しているパラフィン16から17のed。 16 -例えば、凍結ヒト結腸組織切片における粘液層がCarnoy&#39;s固定ヒト結腸サンプル55.4±2.5μmである（204.8μmの範囲7.7）のために報告された範囲内にある〜100μm程度（ 図1）です。 それは、何十年も前から知られており、その結果生体試料18〜30％収縮し、組織13からキシレンなどの有機溶剤、Citrisolvとある程度クロロホルム抽出脂質、糖脂質とは、タンパク質がその中のエタノール脱水の結果。固定（10％緩衝ホルマリン）、脱水（増加エタノール濃度）、およびクリア（Citrisolvまたはキシレン）：パラフィン包埋組織のための処理は、次の手順が含まれます。未固定凍結組織切片の上にこれらの手順を模倣することによって、我々はCitrisolvが（Figurパラフィン包埋組織のものに類似している組織形態が生じる凍結組織切片からの粘 ​​液を抽出することを実証e 2と、右パネル）。これとは対照的に、粘液層（ 図2、左と中央パネル）ホルマリンまたはエタノールとのインキュベーションによって変化しなかった。 Citrisolv /キシレンで長時間のインキュベーション、粘液層の崩壊の結果を必要とする標準的なパラフィン包埋手順のクリアステップ、このことが示唆している。ホルマリン固定は粘液層にダメージを与えないとホルマリンで固定した凍結組織切片を、容易にグリカン、糖脂質およびタンパク質（ 図2、図3及び図6）に対するレクチンや抗体で染色することができます。これらの効果は、膜結合タンパク質および組織病理学の研究のために無視できるかもしれないが、彼らはそのような分泌粘液層のような高度に水和した構造のために荒廃しています。しかしムチンの組織学的研究はまだ粘液層の保全が次善であるパラフィン包埋サンプルを主に行っています。そのような自体の正確なIDとして粘液層組成の深さの分析でcretedまたは膜結合MUC糖タンパク質の組み合わせは、特異的抗体とタンパク質バックボーンの同定のための質量分析を必要とします。粘液層の保全は、このような研究のための初期の要件ですが。 多くの研究室では、さまざまなプロジェクトのために、過去に収集した10月中に凍結組織サンプルを持って、これらの組織は、容易にムチン、糖脂質および粘液の保全のために独自に設計された特殊な固定液中に組織を収集する必要性を排除する糖鎖分布を調べるために使用することができます。凍結した組織では、最小限の処理を受けるため、自然の中で水和している糖鎖の天然分布は、保持されます。これは、微生物 - 宿主相互作用の分野では特に重要である。これらの &quot;障壁&quot;分子飾る分泌ムチンと多くのグリカン構造の自然主義的な分布と個体数の知識は、宿主の防御、微生物の搾取とpathogenesを理解する上で鍵となるだろうです。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 2 - メチルブタン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 03551から4 </td></tr><tr><td> AECのペルオキシダーゼ基質キット</td><td>ベクトルラボ</td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td>アルシアンブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3157 </td></tr><tr><td>抗CA19-9モノクローナル抗体</td><td>カルビオケム</td><td> CA1003 </td></tr><tr><td>抗MUC5ACモノクローナル抗体</td><td>ミリポア</td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td>アビジン - ビオチンブロッキング·キット</td><td>ベクトルラボ</td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td>ビオチン化ロバ抗マウス抗体</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 90863 </td></tr><tr><td>ビオチン化SNA </td><td>ベクトルラボ</td><td> B-1305 </td></tr><tr><td>ウシ血清albu分</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4503 </td></tr><tr><td>キチン加水分解物</td><td>ベクトルラボ</td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td>クライオスタットミクロトーム</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>ライカCM 1800 </td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td> Surgipath医療ケガニ</td><td> 3801570 </td></tr><tr><td>過酸化水素30パーセント</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> H325-100 </td></tr><tr><td>ジャカリン - FITC </td><td>ベクトルラボ</td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td>マイヤーのヘマトキシリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> MHS32 </td></tr><tr><td>メリビオース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M5500 </td></tr><tr><td>核ファーストレッド</td><td>ベクトルラボ</td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> OCTコンパウンド</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 94638 </td></tr><tr><td>シッフ試薬</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 26052 </td></tr><tr><td> sWGA-ローダミン</td><td>ベクトルラボ</td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> TKH2モノクローナル抗体</td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount水性封入剤</td><td>ベクトルラボ</td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 8310から4 </td></tr><tr><td>ピールウェイ金</td><td>ポリサイエンス社</td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

天然ムチンの分布を調べ不定、凍結組織を用いた

Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

ムチンは重量1-3で70％以上の炭水化物を含む複雑かつ高度にグリコシル化され、O-結合型糖タンパク質である。杯細胞と胃粘膜によって生成分泌ムチンは、腸や気道の3,4行は上皮そのマイクロメートル厚の粘液層のための足場を提供する。ムチンに加えて、粘液層は、抗菌ペプチド、サイトカイン、および免疫グロブリン5-9を含む。粘液層は、ホスト自然免疫の重要な部分であり、微生物8,10-12を侵略に対する最初の防衛線を形成している。このように、粘液は、微生物との多数の相互作用に従うものとし、両方の病原体と共生し、分泌ムチンは、これらの相互作用のための重要なインタフェースを形成します。そのような生物学的相互作用の研究は、通常、組織採取と染色のための組織学的方法を含む。組織採取とpreserv用の2つの最も一般的に使用される組織学的方法クリニックで、研究所でationは、次のとおりです。冷凍保護剤メディアに埋め込む続いパラフィン包埋し、組織の凍結が続き、ホルマリン固定。 パラフィン包埋組織サンプルは、明快さと明確に定義された形態を含む組織学的可視化のための最適な性質を持つセクションを生成します。しかし、パラフィン包埋処理中にエピトープの数が変更され、これらのエピトープを勉強するためには、組織切片は、さらに多くのエピトープ検索方法13のいずれかで処理しなければならないとなる。分泌されるムチンと脂質は有機溶剤（キシレンまたはCitrisolv）とのインキュベーションを延長する必要パラフィン包埋クリア化ステップの間に、組織から抽出されます。したがって、このアプローチでは、in vivoでのムチンや粘液の性質や分布に着目した研究のためのサブ最適です。 これとは対照的に、最適切断温度で凍結組織（OCT）は培地埋め込みボイド試料の脱水及び清算、サンプルの水和を維持します。これは、水和した粘液層のより良い保存を可能にし、従って上皮生物学におけるムチンの多数の役割の研究を可能にします。この方法は、組織の最小限の処理を必要とするため、組織は、より自然な状態で保存されています。したがって凍結組織切片は染色前に、追加の処理を必要とせず、容易に免疫組織化学法を用いて解析することができます。 我々は、冷凍結腸サンプルにおけるマイクロメートル厚の分泌粘液層の保全を実証している。同じ組織をパラフィン包埋されている場合、この層を大幅に低減されます。我々はまた、植物レクチンを用いたムチン型糖鎖上に提示されるエピトープの免疫蛍光染色を示す。このアプローチの利点は、それが特別な固定剤の使用を必要とし、すでに研究室に保存されることもあり凍結組織を活用できていないということです。

最適切断温度の媒体（10月）に埋め込まれた未固定凍結組織サンプルは分泌粘液の自然分布とグリコシル化を研究するために使用することができます。このアプローチ組織処理に最小限であり、糖脂質、ムチンおよび糖鎖エピトープの自然なプレゼンテーションが保存されています。組織切片を蛍光や発色検出を用いた免疫組織化学によって分析することができる。

ムチンは、重量の70%以上を糖鎖が占める、複雑で高度に糖鎖付加されたO結合型糖タンパク質である1-3。…によって産生される分泌型ムチンは、

本実験の全体的な目的は、組織サンプルにおける分泌粘液の糖鎖修飾の自然な分布を維持することです。これは、まず組織を最適凍結切片作成用包埋剤（OCTコンパウンド）で包埋して組織処理を最小限に抑え、その後に糖鎖構造、ムチン、および粘液の検出を可能にすることで達成されます。切片は、レクチン、抗体、および組織化学染色剤を用いてインキュベートされます。レクチンの結合特異性を確認するために、競争的阻害や糖鎖エピトープの酵素切断によって、レクチンの結合をさらに検証することができます。最終的に、粘液および凍結組織サンプルの保存状態を、化学分析を用いてパラフィン包埋サンプルの粘液保存状態と比較することが可能です。パラフィンへの組織包埋やカルノ固定液による固定などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、特殊な固定液を使用する必要がなく、研究室に既に存在する凍結組織を利用できる点にあります。まず、急速凍結した組織をクライオミクロトームのチャンバーに入れ、-20°Cまで昇温させます。その間に、浅い発泡スチロール製のボックスに2-メチルブタンを入れ、さらにドライアイスを加えることで凍結バスを作成します。次に、剥離可能な凍結モールドの底を覆うだけのOCTを加え、組織をモールド内に配置します。組織が目的の向きでモールドの底に接していることを確認してください。組織をさらにOCTで覆い、モールドを凍結槽に入れます。組織が凍結するにつれて、OCT化合物は白くなります。凍結後、凍結ブロックからモールドを剥がし、ブロックをラベル付きのフリーザーバッグに入れます。組織をセクショニングするまで、凍結ブロックを−80°Cで保存します。目的の凍結ブロックをクライオマイクロトームのチャンバーに約30分間置き、−20°Cまで到達させます。ブロックが適切な温度になったら、3〜5 µmの厚さで切片を作成し、その切片の上に正電荷ガラススライドを載せます。組織を30～60分間風乾させると、組織がスライドに付着します。10%緩衝ホルマリンを用いて室温で30分間スライドを固定し、その後、250 mLの緩衝液に10回素早く浸漬させる操作を3回繰り返し、PBSでスライドを洗浄します。組織をアルミブルーで染色する前に、スライドを水ですすぎ、3%酢酸中で3分間インキュベートします。次に、組織をAUM blue溶液でインキュベートします。30分後、スライドを流水で10分間洗浄し、続いてDI waterで洗浄します。核をnuclear fast redで5分間対比染色し、その後、スライドをDI waterで3回洗浄します。次に、95% ethanolで1分間インキュベートし、続いて100% ethanolで素早く3回置換し、さらにcitrus resolveで各2分間、3回置換することで、スライドの脱水および透徹を行います。最後に、組織を過ヨウ酸シフ染色するため、CytoSeal 60などの封入剤を用いてスライドガラスにカバーガラスを被せます。まず、スライドを水で洗浄し、次いで調製したばかりの1%過ヨウ酸で5分間インキュベートします。その後、スライドをDIウォーターで3回洗浄します。スライドをMilli Q水に一度浸した後、組織をSchiff試薬で染色します。15分後、スライドを水道水の流水でさらに10分間洗浄し、その後DI水に一度浸します。核をサフラニンOで30秒間対比染色し、最後にスライドをDI水で3回洗浄します。最後に、スライドを30秒間インキュベートします。スコッツのタップウォーターブルーイング試薬で処理した後、脱イオン水（DI水）でさらに3回洗浄し、カルシウムブルー染色と同様に組織を脱水します。レクチンを用いたグリカンエピトープの蛍光検出のため、カバーガラスを用いてスライドを封入します。まず、PBSで調製したBSAを用いて、スライドを10～30分間ブロッキングします。次に、スライドをavadonで15分間インキュベートして内因性ビオチンをブロックし、PBSで洗浄した後、さらにPBSで洗浄し、0.01%ビオチンで15分間インキュベートします。スライドを染色ボックスに配置し、各組織切片の上に調製したばかりの目的のレクチン混合液を滴下し、最後にレクチン混合液をparfumで静かに覆います。1時間後、スライドを暗所でインキュベートします。緩やかにパーフュームを除去し、PBSでスライドを3回洗浄します。次に、スライドにconjugated SCI fiveのstrep avidを重ね、再び30分間暗所でインキュベートし、スライドをPBSで3回洗浄した後、DAPIで核を対比染色します。最後に、sase酵素コントロールについては、Vector Mountなどの水溶性封入剤を用いて、カバーグラスでスライドを封入します。まず、空のチップボックスの底に水を加え、加湿チャンバーを作成します。陰性コントロールのスライドを、チップボックスの上部トレイに上向きに配置します。組織切片の上にUS溶液を150〜200 µL滴下し、気泡が入らないように注意して各スライドをカバーガラスで覆います。ボックスの蓋を閉め、37 °Cで2時間30分間インキュベートします。室温のPBSでスライドを3回洗浄し、遊離したslic酸を除去します。次に、競合阻害を行うため、スライドをSNAとともに室温で1時間インキュベートします。コントロールとして、レクチン混合液200 µLを2本のエッペンドルフチューブに分注します。一方のチューブに200 mMのJacqueline阻害剤Meli biosを加え、もう一方のチューブには1/10に希釈したSWGA阻害剤であるキチン加水分解物を加えます。次に、阻害剤を含む混合液を用いて、スライドを室温で1時間インキュベートします。この最初の組織図では、OCTで凍結またはパラフィンに包埋したマウスまたはニワトリの結腸標本切片を、PAS染色でピンク色に、またはCalcium Blueで青色に染色しました。パラフィン包埋組織サンプルとOCT凍結保護剤で包埋した凍結組織を比較したところ、凍結組織におけるムチン糖タンパク質の保存状態および染色の質に顕著な差があることが明らかになりました。パラフィン包埋組織において、杯細胞内のムチンに加えて、矢印で示されるように分泌された粘液も確認されました。粘液の染色は杯細胞に限定されていました。本図では、シトラスリゾルブで処理した組織において、ムチンの大幅な消失が観察されます。凍結した鶏回腸標本の連続切片を10%緩衝ホルマリンで固定して水分を保持させた後、70%、90%、100%のエタノールにそれぞれ20分間ずつ順次浸漬して脱水させたか、あるいはエタノールで脱水した後にcitrus allで1時間透徹させた。エタノールによる脱水のみ、およびエタノール脱水とcitrus allによる透徹の組み合わせにより、組織形態が改善した。さらにエタノール脱水のみを行った場合、青色染色の結果に有意な影響は認められなかった。対照的に、citrusで全培養を行うと、青色の染色は減少して goblet cells に限定され、前図のパラフィン包埋組織で観察されたものと同様のパターンとなりました。枠線は、allium青色染色組織切片における高倍率の領域を示しています。次の一連の画像では、OCTで凍結した、またはパラフィンで包埋した鶏回腸標本に対し、Jacquelineを青色、SWGを緑色、SNAを赤色でプローブした凍結組織を示しています。OCT凍結組織切片において、矢印で示されているように、Jacquelineがolinkグリカンに結合したところ、杯細胞から管腔へと漏出しているように見える構造が明らかになりました。対照的に、パラフィン包埋組織におけるJacquelineの結合は、これらの矢印で示される杯細胞および絨毛の刷子縁に限定されていました。凍結組織およびパラフィン包埋組織の両方において、$\beta$1,4-GLのSWGA染色は、矢印で示されるように、Jacquelineレクチンの結合と部分的に共局在しています。対照的に、赤色で矢印頭で示されているSNAレクチンは、細胞内のα2-6結合シアル酸に結合しており、この図で青色で点線矢印で示されているJacquelineとは共局在していません。シアル酸エピトープは、組織切片をNeuraminidaseで消化することで鶏回腸検体から切断されたか、あるいはここに示されているように酢酸ナトリウム緩衝液でインキュベートすることで未切断のまま保持されました。Neuraminidase処理により、未処理の組織で見られたビオチン化SNAによる染色は消失しており、SNAのシアル酸に対する結合特異性が確認されました。レクチンの特異性は、Jac lectin染色にはmely bios、SWGA染色にはキチン加水分解物などの競合的阻害剤を加えることでも確認できます。ここでも同様に、ニワトリ回腸標本をJac lectinとSWGAの混合液とともにインキュベートしました。今回は、特異的なレクチン阻害剤であるmely biosまたはキチン加水分解物を共存させました。その結果、Jac lectin染色はmely biosによって阻害されましたが、キチン加水分解物では阻害されませんでした。逆に、SWGA染色はキチン加水分解物によって阻害されましたが、mely biosでは阻害されませんでした。この最後の画像シリーズは、クリニックや研究室で日常的に採取されるスナップ凍結組織サンプルをさらにOCTで包埋し、ムチン、糖タンパク質、糖脂質、および糖鎖上の糖鎖の研究に使用できることを示しています。絨毛癌および粘液癌組織からのこれらの大腸癌生検検体は、液体窒素でスナップ凍結され、OCTで包埋された後、示された各種のムチンおよび糖鎖エピトープに対して正常に染色されました。このビデオを視聴することで、組織をOCTで包埋する方法と、免疫化学的手法を用いて粘液および組織の糖鎖修飾を分析する方法について十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

カハール（ICC）の間質細胞は消化管（GI）管のペースメーカー細胞である。彼らは、平滑筋細胞とGI収縮を調節するためにポスト神経節神経繊維間の複雑なネットワークを形成する。ここで、我々は、免疫蛍光断面の方法とマウスICCネットワークのホールマウントの可視化を提示する。...

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ここでは、空間的に異なるマウスの結腸上皮表面細胞を根底にある陰窩基部細胞から分離するための簡単な方法について説明します。...

マウス結腸粘膜の顕微解剖のための凍結切片法

この資料に記載されている間接免疫プロトコルは、検出およびマウス乳腺中のタンパク質の局在を可能にします。完全な方法は、乳腺のサンプルを調製するために蛍光顕微鏡により画像を、組織切片の免疫組織化学を実行し、画像を再構成するために与えられています。...

マウス乳腺の凍結切片の間接免疫

ここでは、乳腺細胞外マトリックス (ECM) 式および膵管の形態を検討する提案全体、そのままマウスの隔離のためのプロトコル。マウス #4 腹部腺は、8-10 週齢雌未マウス、中性緩衝ホルマリンで固定、断面、ECM 蛋白質の免疫組織化学を用いたステンド...

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

久我らはリン酸化状態アクチン結合タンパク質 girdin チロシン 1798 (pY1798) のリン酸化などに対する特異抗体できる房細胞 (TCs) をラベルに使用することを発見しました。このプロトコルは、pY1798 抗体を用いた浮遊空腸凍結切片の免疫蛍光染色を使用して Tc...

フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

このプロトコルの目的は、哺乳動物の消化管におけるカンディダ・アルビカンス細胞の形状および局在を可視化することである。...

上皮内蛍光を用いたマウス消化管におけるカンダアルビカンスの可視化

この合理化されたプロトコルは、組織の固定から、その場で蛍光を伴う微生物の染色まで、複雑な組織サンプル 中の 細菌を検出し、画像化するワークフローを詳述しています。...

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いたペルメチル化ムチン O型糖鎖のプロファイリング

この研究では、全マウント腸組織と多光子顕微鏡を使用して分泌された粘液を定量化し、塩化カルバモイルコリンなどの刺激に応答した粘液動態の正確な体積分析と視覚化を可能にする 3D...

ホールマウント組織イメージングを用いた腸粘液の三次元定量化

学ぶOCT包埋凍結組織を用いたムチン糖鎖の自然分布解析法。レクチンと組織化学染色で糖鎖構造を検出し、パラフィン包埋との比較で糖タンパク質保存性を評価できます。

天然ムチンの分布を調べ不定、凍結組織を用いた

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