天然ムチンの分布を調べ不定、凍結組織を用いた

本実験の全体的な目的は、組織サンプルにおける分泌粘液の糖鎖修飾の自然な分布を維持することです。これは、まず組織を最適凍結切片作成用包埋剤（OCTコンパウンド）で包埋して組織処理を最小限に抑え、その後に糖鎖構造、ムチン、および粘液の検出を可能にすることで達成されます。切片は、レクチン、抗体、および組織化学染色剤を用いてインキュベートされます。

レクチンの結合特異性を確認するために、競争的阻害や糖鎖エピトープの酵素切断によって、レクチンの結合をさらに検証することができます。最終的に、粘液および凍結組織サンプルの保存状態を、化学分析を用いてパラフィン包埋サンプルの粘液保存状態と比較することが可能です。パラフィンへの組織包埋やカルノ固定液による固定などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、特殊な固定液を使用する必要がなく、研究室に既に存在する凍結組織を利用できる点にあります。

まず、急速凍結した組織をクライオミクロトームのチャンバーに入れ、-20°Cまで昇温させます。その間に、浅い発泡スチロール製のボックスに2-メチルブタンを入れ、さらにドライアイスを加えることで凍結バスを作成します。次に、剥離可能な凍結モールドの底を覆うだけのOCTを加え、組織をモールド内に配置します。

組織が目的の向きでモールドの底に接していることを確認してください。組織をさらにOCTで覆い、モールドを凍結槽に入れます。組織が凍結するにつれて、OCT化合物は白くなります。凍結後、凍結ブロックからモールドを剥がし、ブロックをラベル付きのフリーザーバッグに入れます。

組織をセクショニングするまで、凍結ブロックを−80°Cで保存します。目的の凍結ブロックをクライオマイクロトームのチャンバーに約30分間置き、−20°Cまで到達させます。ブロックが適切な温度になったら、3〜5 µmの厚さで切片を作成し、その切片の上に正電荷ガラススライドを載せます。

組織を30～60分間風乾させると、組織がスライドに付着します。10%緩衝ホルマリンを用いて室温で30分間スライドを固定し、その後、250 mLの緩衝液に10回素早く浸漬させる操作を3回繰り返し、PBSでスライドを洗浄します。組織をアルミブルーで染色する前に、スライドを水ですすぎ、3%酢酸中で3分間インキュベートします。

次に、組織をAUM blue溶液でインキュベートします。30分後、スライドを流水で10分間洗浄し、続いてDI waterで洗浄します。核をnuclear fast redで5分間対比染色し、その後、スライドをDI waterで3回洗浄します。次に、95% ethanolで1分間インキュベートし、続いて100% ethanolで素早く3回置換し、さらにcitrus resolveで各2分間、3回置換することで、スライドの脱水および透徹を行います。

最後に、組織を過ヨウ酸シフ染色するため、CytoSeal 60などの封入剤を用いてスライドガラスにカバーガラスを被せます。まず、スライドを水で洗浄し、次いで調製したばかりの1%過ヨウ酸で5分間インキュベートします。その後、スライドをDIウォーターで3回洗浄します。

スライドをMilli Q水に一度浸した後、組織をSchiff試薬で染色します。15分後、スライドを水道水の流水でさらに10分間洗浄し、その後DI水に一度浸します。核をサフラニンOで30秒間対比染色し、最後にスライドをDI水で3回洗浄します。

最後に、スライドを30秒間インキュベートします。スコッツのタップウォーターブルーイング試薬で処理した後、脱イオン水（DI水）でさらに3回洗浄し、カルシウムブルー染色と同様に組織を脱水します。レクチンを用いたグリカンエピトープの蛍光検出のため、カバーガラスを用いてスライドを封入します。

まず、PBSで調製したBSAを用いて、スライドを10～30分間ブロッキングします。次に、スライドをavadonで15分間インキュベートして内因性ビオチンをブロックし、PBSで洗浄した後、さらにPBSで洗浄し、0.01%ビオチンで15分間インキュベートします。スライドを染色ボックスに配置し、各組織切片の上に調製したばかりの目的のレクチン混合液を滴下し、最後にレクチン混合液をparfumで静かに覆います。

1時間後、スライドを暗所でインキュベートします。緩やかにパーフュームを除去し、PBSでスライドを3回洗浄します。次に、スライドにconjugated SCI fiveのstrep avidを重ね、再び30分間暗所でインキュベートし、スライドをPBSで3回洗浄した後、DAPIで核を対比染色します。

最後に、sase酵素コントロールについては、Vector Mountなどの水溶性封入剤を用いて、カバーグラスでスライドを封入します。まず、空のチップボックスの底に水を加え、加湿チャンバーを作成します。陰性コントロールのスライドを、チップボックスの上部トレイに上向きに配置します。

組織切片の上にUS溶液を150〜200 µL滴下し、気泡が入らないように注意して各スライドをカバーガラスで覆います。ボックスの蓋を閉め、37 °Cで2時間30分間インキュベートします。室温のPBSでスライドを3回洗浄し、遊離したslic酸を除去します。

次に、競合阻害を行うため、スライドをSNAとともに室温で1時間インキュベートします。コントロールとして、レクチン混合液200 µLを2本のエッペンドルフチューブに分注します。一方のチューブに200 mMのJacqueline阻害剤Meli biosを加え、もう一方のチューブには1/10に希釈したSWGA阻害剤であるキチン加水分解物を加えます。

次に、阻害剤を含む混合液を用いて、スライドを室温で1時間インキュベートします。この最初の組織図では、OCTで凍結またはパラフィンに包埋したマウスまたはニワトリの結腸標本切片を、PAS染色でピンク色に、またはCalcium Blueで青色に染色しました。パラフィン包埋組織サンプルとOCT凍結保護剤で包埋した凍結組織を比較したところ、凍結組織におけるムチン糖タンパク質の保存状態および染色の質に顕著な差があることが明らかになりました。

パラフィン包埋組織において、杯細胞内のムチンに加えて、矢印で示されるように分泌された粘液も確認されました。粘液の染色は杯細胞に限定されていました。本図では、シトラスリゾルブで処理した組織において、ムチンの大幅な消失が観察されます。

凍結した鶏回腸標本の連続切片を10%緩衝ホルマリンで固定して水分を保持させた後、70%、90%、100%のエタノールにそれぞれ20分間ずつ順次浸漬して脱水させたか、あるいはエタノールで脱水した後にcitrus allで1時間透徹させた。エタノールによる脱水のみ、およびエタノール脱水とcitrus allによる透徹の組み合わせにより、組織形態が改善した。さらにエタノール脱水のみを行った場合、青色染色の結果に有意な影響は認められなかった。

対照的に、citrusで全培養を行うと、青色の染色は減少して goblet cells に限定され、前図のパラフィン包埋組織で観察されたものと同様のパターンとなりました。枠線は、allium青色染色組織切片における高倍率の領域を示しています。次の一連の画像では、OCTで凍結した、またはパラフィンで包埋した鶏回腸標本に対し、Jacquelineを青色、SWGを緑色、SNAを赤色でプローブした凍結組織を示しています。

OCT凍結組織切片において、矢印で示されているように、Jacquelineがolinkグリカンに結合したところ、杯細胞から管腔へと漏出しているように見える構造が明らかになりました。対照的に、パラフィン包埋組織におけるJacquelineの結合は、これらの矢印で示される杯細胞および絨毛の刷子縁に限定されていました。凍結組織およびパラフィン包埋組織の両方において、$\beta$1,4-GLのSWGA染色は、矢印で示されるように、Jacquelineレクチンの結合と部分的に共局在しています。

対照的に、赤色で矢印頭で示されているSNAレクチンは、細胞内のα2-6結合シアル酸に結合しており、この図で青色で点線矢印で示されているJacquelineとは共局在していません。シアル酸エピトープは、組織切片をNeuraminidaseで消化することで鶏回腸検体から切断されたか、あるいはここに示されているように酢酸ナトリウム緩衝液でインキュベートすることで未切断のまま保持されました。Neuraminidase処理により、未処理の組織で見られたビオチン化SNAによる染色は消失しており、SNAのシアル酸に対する結合特異性が確認されました。

レクチンの特異性は、Jac lectin染色にはmely bios、SWGA染色にはキチン加水分解物などの競合的阻害剤を加えることでも確認できます。ここでも同様に、ニワトリ回腸標本をJac lectinとSWGAの混合液とともにインキュベートしました。今回は、特異的なレクチン阻害剤であるmely biosまたはキチン加水分解物を共存させました。その結果、Jac lectin染色はmely biosによって阻害されましたが、キチン加水分解物では阻害されませんでした。逆に、SWGA染色はキチン加水分解物によって阻害されましたが、mely biosでは阻害されませんでした。

この最後の画像シリーズは、クリニックや研究室で日常的に採取されるスナップ凍結組織サンプルをさらにOCTで包埋し、ムチン、糖タンパク質、糖脂質、および糖鎖上の糖鎖の研究に使用できることを示しています。絨毛癌および粘液癌組織からのこれらの大腸癌生検検体は、液体窒素でスナップ凍結され、OCTで包埋された後、示された各種のムチンおよび糖鎖エピトープに対して正常に染色されました。このビデオを視聴することで、組織をOCTで包埋する方法と、免疫化学的手法を用いて粘液および組織の糖鎖修飾を分析する方法について十分に理解できたはずです。