宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

この手順の全体的な目的は、多数の寄主植物揮発性物質について、潜在的な生物学的活性を迅速にスクリーニングすることです。まず、目的とする寄主植物の揮発性物質を回収し、GCMSで分析します。その後、化学成分の同定および検証を行います。

第3のステップでは、電気化学的分析を用いて、個々の成分の生物活性を十分な反復回数でスクリーニングします。最終ステップでは、活性成分のブレンドを調製し、評価を行います。最終的に、これらの結果から、対象となる昆虫を用いた行動研究におけるさらなる調査に適した、絞り込まれた成分シリーズまたは成分ブレンドを得ることができます。

この手法の主な利点は、時間のかかる行動学的研究などの既存の手法と比較して、電気生理学的解析による迅速なスクリーニングを行うことで、手順を実証するための他の研究に供する必要がある化合物の数を大幅に減らせる点にあります。MR Wageは私の研究室の技術者ですか？ガスクロマトグラフィーおよび質量分析によって関連する揮発性物質が特定されれば、利用可能な各揮発性物質に対して、まず電気触覚図解析（EAG）を行うことが可能です。

ただし、使用可能な揮発性物質を調製しておく必要があります。密閉可能な容器を用い、各揮発性物質をペンタンで5 mg/mLの濃度に調製し、4 °Cで保存します。次に、刺激用ピペットを準備します。

揮発性物質ごとに10本のパステールピペットにラベルを貼り、チップ部分をパラフィルムの小さな破片で巻きます。低レプリケート数の予備スクリーニングにおいて、各性の個体に揮発性物質を投与するには10本のピペットで十分です。次に、残りの5本のピペットをラックホルダーに並べ、各ピペットの開口端にバイオアッセイディスクを挿入します。

ピンセットでディスクをそっと折り曲げ、ディスクの2〜3 mmが露出するようにピペットの太い端に部分的に挿入します。ピペッターまたはシリンジを使用して、各ディスクに10 µLの揮発性溶液をロードします。再現性を確保するためには、溶液を正確に計算し、調製し、準備することが極めて重要です。

2分間待機した後、ディスクをピペットに完全に押し込みます。ロードが完了したら、直ちに各ピペットをparamで密閉します。必要な繰り返し回数分、このピペット準備を繰り返します。

同一のプロトコルを用いて、ペンタンのみの陰性対照と、今回はアセトフェノンおよび性ホルモンの陽性対照を準備します。次に、昆虫の触角の調製に進みます。

この実験では、プリアンプがフォーク電極からの信号をEAGデータ収集装置に伝達します。EAG装置に付属のソフトウェアを適切に設定する必要があります。まず、サンプリングレートを106.7に設定して構成してください。

「フィルター」タブで、「rectify」トグルを「know」に設定し、フィルターを0〜42 Hzに設定します。EAGフィルターを「on」にし、ローカットオフを0.1 Hzに設定します。その後、今後の使用に備えて設定を構成ファイルに保存します。

プログラムの操作は、新しいプロジェクトファイルを開き、特定の名前で保存して記録を開始するという簡単な手順で行われます。赤い三角形のアイコンで記録プロセスを開始すると、各パフごとにあらかじめ設定された時間分、記録が継続されます。触角へのすべてのパフが完了したら、黒いXアイコンで記録を停止させることで、EAG応答をより正確に読み取ることが容易になります。

小さな定規をコンピュータ画面上の信号のベースラインにテープで固定することができます。応答はミリメートル（mm）で記録し、後でマイクロボルト（µV）の振幅に変換します。必要に応じて、記録を再生してさらに評価を行うことができます。

この例では、羽化後3〜4日のナビオレンジ（naval orange）の雄および交尾済みの雌の蛾を使用します。ただし、本プロトコルは他の昆虫にも適用可能です。各昆虫を蓋付きの小さなプラスチック容器に移します。

分析当日のバイオアッセイ直前に、昆虫をピペットチップの広い開口部に挿入します。このチップは、昆虫の頭部がちょうど収まる程度の小さな開口部を持つものを使用します。次に、より小さなピペットチップを用いて、ステレオ顕微鏡下で頭部が見えるまで、昆虫を慎重に小さな開口部の方へ押し出します。触角が保持チューブ内で固定され、切除するための触角の基部が露出していることを確認してください。

次に、少量の電極ゲルの塗布したフォークホルダーを触角のすぐ近くに配置します。マイクロシザースを用いて触角を切り出し、両方の触角を摘出します。その後、タイマーを開始し、この操作から次の刺激を与えるまでの時間を記録します。先端に少量のゲルを付けたワイヤチップツールを用いて、片方の触角を拾い上げ、フォークの上に載せます。触角の基部が、フォークの赤色ではない無差別接地電極の上に配置されていることを確認してください。

2本目のアンテナについても同様に行います。アンテナの基部をフォークの同じ側に、配置済みのアンテナから2～3 mm離して設置します。必要に応じてアンテナの先端をトリミングしてください。

ブラシを使用して電極にゲルを塗布し、気泡が入らないよう、電極の基部と先端が十分にゲルに浸っていることを確認します。揮発性物質のパフにさらされるアンテナの表面積を最大化するため、アンテナの中央部分はゲルで覆わないようにしてください。準備が適切に完了し、ゲルが安定したら、フォークをプローブ・プリアンプに接続します。

次に、触角標本の生存能を維持するため、標本に加湿空気を送ります。切除から10分後に、最初の刺激を開始します。刺激操作の順序は、ポジティブコントロールで始まり、ポジティブコントロールで終わるようにし、その間に同一の化合物を連続して使用しないランダムな順序で化合物を刺激します。また、少なくとも1つのネガティブコントロールを含めます。触角に投与される化合物の数は、種によって異なります。

Naval orange worm mothの標本は30分以上にわたって活性を維持できるため、少ない反復数で最大10種類の揮発性化合物を容易に分析することが可能です。このサンプル送達の原理は、予備スクリーニングで反応を誘発したことが判明した混合化合物のその後のスクリーニングにも適用されます。最初の刺激用ピペットは、パフを適用する30秒前に準備する必要があります。ピペットのシールを外し、触角の切除から10分後に、触角から2～3 mmの距離に気流が向くようにホルダーに配置してください。

最初の刺激パフを、300 milliliters per minuteの速度で1〜2秒かけて投与します。次に、最初の刺激から1分後に2回目の刺激が投与されるよう、速やかにピペットを交換してください。サンプル間で一貫性を保つことで、実際にパフされる揮発性物質の量の変動を最小限に抑えることができます。

最後の陽性対照パフを投与した後、アンテナを取り外し、フォークを洗浄します。エタノールに浸したワイプで拭き、次に使用する前に完全に乾燥させてください。アッセイのスループットを向上させるため、助手は前の準備が終了する10分前に、洗浄済みのフォークを備えた次のアンテナを準備しておく必要があります。

試験シーケンスでは、本手法に1つ以上のフォークが必要です。各実験後、試験用の蛾をドライアイス環境下で安楽死させ、雌蛾を解剖して交尾状態を確認します。同居していた雄蛾は交尾したと想定します。ナビエルオレンジワームの触角の準備を行い、2秒間のパフで刺激を与え、5 mVのスケールで10秒間のウィンドウを用いて10秒間の記録を行いました。

典型的な反応は負の偏向でした。しかし、絶対値が記録されました。陽性対照への反応が弱かった雌の調製物はすべて破棄されました。

残りの調製物の平均反応は2,600 microvoltsでした。同様に、性pHコントロールに対する雄の平均反応は通常3000 microvoltsでした。したがって、反応が基準以下であった個体は除外されました。また、試験期間中に反応の低下が見られた触角からのデータも除外されました。

最終ポジティブコントロールのパフに対するAntonの反応が、プリコンコントロールの最初のパフの75%未満であるか、あるいは残りの実験ランにおいてプリコンコントロールの2回目のパフ未満であった場合に、劣化が生じたと判定した。反応値の解析は、各ランの未加工測定値から、そのランのネガティブコントロールの反応値をすべての値から差し引くことで行った。次に、各ランのすべてのポジティブコントロールを平均し、1000 Microvoltsに補正し、各ランの1000 microvoltsへの補正比を記録した。

次に、試験化合物の値を陽性対照補正比で乗じました。最後に、全ランにおける各試験化合物の平均補正応答を比較し、さらなる検討に向けた各化合物の候補としての妥当性を評価しました。化学物質の取り扱いは非常に危険を伴う場合があるため、常に適切な予防措置を講じることを忘れないでください。