Name: タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶ 磁気ビーズを用いた液相アフィニティキャプチャーアッセイでタンパク質間相互作用を解析する方法。ポリオウイルスとナノボディの相互作用を定量的に評価し、構造変換感受性タンパク質の研究に応用できます。

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著者らは、放射性標識されたウイルスを調製するための医薬バイオテクノロジーと分子生物学の部門、特にモニーク·デ·Pelsmackerのスタッフに感謝します。私たちは、エレン·メルクスとその興味深い発言や議論のためにHadewych Halewyckに、ラボで彼の助けのためのヘリット·デ·Bleeserに感謝しています。この作品は、財政的にブリュッセル自由大学（OZR1807）、フォンvoor Wetenschappelijk Onderzoe​​kブラーンデレン（G.0168.10N）と世界保健機関（TSA 200410791）のOZRの助成金によって支えられている。リセSchotteはフォンvoor Wetenschappelijk Onderzoe​​kブラーンデレン（FWO）の博士号を取得する前の仲間です。

原則（）とメソッドの概要（B）は図1に示されている。 1。バッファーの調製<ol><li>水の中でリン酸二水素ナトリウム（50 mm）と塩化ナトリウム（300 mM）を溶解することによって結合/洗浄バッファーを準備し、pHを8.0に調整します。さらに、メチオニンツイーン20（0.01％（M / V）の最終濃度）、（2％（M / V）の最終濃度）とアルブミン（0.1％（M / V）の最終濃度）を追加し、必要なボリュームに調整します。 </li></ol> 2。磁性ビーズの調製取扱説明書に従って、磁気ビーズを準備します。簡潔に： <ol><li>渦を用いた磁気ビーズを再懸濁します。 </li><li>転送は、各サンプルの、チューブに再懸濁した磁性ビーズ（40 mg / ml）を10μlの。 </li><li>上清が透明になるまで、磁石を用いた磁気ビーズを収集する（+ / - 30秒）し、上清を注意深く除去する。 </li><li>洗う磁気ビーズを2回：結合/洗浄バッファー150μlでビーズを再懸濁します。磁気ビーズ上清が透明になるまで磁石を用いたチューブの一方の側に移行し、慎重に上清を除去します。 </li><li>ビーズ（10 mg / ml）を懸濁するため、各サンプルについて、結合/洗浄バッファー40μlを使用しています。 </li></ol> 3。親和性捕捉アッセイ注：（宇宙の）バックグラウンド放射能（0％放射能）を測定するには、no放射標識されたウイルスは対照試料1に追加されていません。代わりに、同じボリューム結合/洗浄バッファーが追加されます。 注：100％の放射能が、すべてのコンポーネントがnanobodyのを除いて追加されるように制御サンプル2で定義されています。代わりに、同じボリューム結合/洗浄バッファーが追加されます。 <ol><li> 96ウェルマイクロタイタープレートに80μlに結合/洗浄バッファーで希釈した（β-放射）ポリオウイルスセービン株の種類1〜9、標識された35 Sの2000 CPMをもたらします。 </li><li> 10＆mを追加するU;ウェルにnanobodyの希釈lの。 </li><li>シェーカーを使用して約10秒間混ぜる。 </li><li>サンプルは室温で1時間インキュベートすることができます。 </li><li>洗浄した磁気ビーズ懸濁液40μlを追加し、連続的に振盪し、室温で10分間インキュベートします。 </li><li>ビーズとマグネットを使用して上清を分離し、チューブにクリアし、上清を移す。 </li></ol> 4。放射能の測定<ol><li>カウントフラスコに、ステップ3.6からの上清50μlを転送します。 </li><li>シンチレーション液と混合の3ミリリットルを追加します。 β-シンチレーションカウンターで放射能を測定します。 </li></ol> 5。ビーズのリサイクル<ol><li> 2分間500 xgで、または透明な上清が得られるまで、チューブと遠心分離機で使用される磁気ビーズを収集します。 </li><li>上清を除去し、6ミリリットル、0.5 M NaOHでビーズを再懸濁します。 </li><li> multiplに懸濁液を移す電子管と5分間超音波浴中でインキュベートします。 </li><li>磁気ビーズを収集し、上清を除去するために磁石を使用しています。 </li><li>各チューブに1 mLの2％SDS-ソリューションを追加し、ボルテックスを用いて再懸濁します。 5分間沸騰させる。 </li><li>ビーズを収集し、上清を除去します。 1ミリリットルの0.2 M EDTA（pH = 7）でビーズを再懸濁します。 </li><li> 5分間超音波浴中でチューブをインキュベートし、もう一度、上清を除去します。 </li><li>各チューブに1 mlの水を追加して、ビーズを懸濁します。ビーズを収集し、上清を除去します。二回の洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>上清を除去し、1mlの10mMのCoCl 2溶液中でビーズを再懸濁します。 10分間シェーカー上に置く。 </li><li>ビーズを収集するために磁石を使用して上清を除去し、結合/洗浄バッファー1 mlに再懸濁します。 </li><li>上清を除去し、20％（v / v）エタノール1 mlを用いて2回ビーズを洗浄</li><li> 20％の元の体積（v / v）の他にビーズを再懸濁し40 mg / mlの濃度で再生ビーズを得るためにhanol。 </li></ol> 6。結果の解釈<ol><li>ない放射性標識ウイルスを添加しなかった対照試料1は、バックグラウンド放射能を修正するために、0％の放射能値を設定するために使用されます。 nanobodyのが含まれており、その結果、すべての放射標識されたウイルスは上清に残っている、されないコントロールサンプル2は、100％の放射能値として設定されています。 </li><li> nanobodyので放射性標識ウイルスの - 上清中の放射能の割合（=％）が全体の降水量（％= 100）の測定値です。 </li></ol> 7。代表的な結果この親和性捕捉アッセイの代表的な結果は、 図2、図3と図4に示されています。 図2では、PVSS38C、ポリオウイルスのためにnanobodyの、特定の、の親和性が示されています。 PVSS38Cの親和性はpoliovの3つの異なる抗原に対してテストされていますirus：ネイティブ抗原（N-抗原）、加熱抗原（H抗原）と14Sサブユニット。 N-抗原は感染性である無傷のウイルスです。ウイルスは加熱（56時20分°C）または固体表面（未発表データ）、ウイルスRNAの（部分的）損失とキャプシドタンパク質VP4の結果カプシド変更のコンフォメーション、空に接続されている場合キャプシドは、その後、H抗原と呼ばれるが形成される。 14Sサブユニットは、アセンブリの中間体である。これらの抗原は、免疫後10抗体の異なるセットで認識されるため、異なるエピトープと抗原部位を持ってしています。図では上清中に見つかった放射能の割合はnanobodyの濃度の関数として表されます。それは放射性標識14Sサブユニットを含むサンプルの上清中の放射能はnanobodyのPVSS38C濃度の増加とともに減少することがわかる。これは、14Sサブユニットの消費ポリオウイルス量の増加のように変換することができますnanobodyのPVSS38Cおよび間接的に磁気ビーズに接続されています。キャプチャ価（放射性標識ウイルスの50％を捕捉するために必要なnanobodyの数=濃度）がグラフィカルに0.099 nMのように計算することができます。ポリオウイルスのN抗原とH抗原性フォームのPVSS38Cの親和性が観察されていません。これらのデータからそれがPVSS38Cは、ポリオウイルスの二つの他の抗原フォーム上の排他的に14Sサブユニット上に存在していないエピトープと相互作用していると解釈されます。 上清からの放射能の消失だけで、その抗原に対するnanobodyの特定の親和性によるものであることを示すために、同一のアッセイは、スルホロバスsulfataricusのlrpB転写制御因子に対して生成されたnanobodyの、NB1で行われ、との相互作用を持たないことが知られていた任意のポリオウイルス抗原。このアッセイの結果を図3に示します。すべての放射性標識ウイルスのない反応がないことを示す上清に残っているポリオウイルスの3抗原の形態に対してNB1。 結果の再現性は、別の日に一つ与えられたnanobodyの（すなわち、PVSP29F）の8回の合計で実験を繰り返すことで、異なる人によってテストされています。結果を図4に示されています。上清中の放射能の割合の平均値は、各nanobodyの濃度を算出し、その標準偏差に対応して表されます。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> 図1。アッセイの原理（A）の概要と方法（B）。 A. Hisタグ特異的に特定のポリオウイルスの抗原を認識ナノボディは、コバルト被覆磁気ビーズと対話することができますし、放射標識されたウイルスを沈殿させます。 B. Hisタグナノボディは、放射性標識したポリオウイルスを添加し、インキュベートする。コバルト被覆磁気ビーズです。追加され、バインド/非結合抗原の磁気分離が実行されます。上清の放射能が測定され、キャプチャされた抗原の量を導出することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> 図2。 nanobodyのPVSS38Cによって異なるポリオウイルス抗原の磁気ビーズをアフィニティーキャプチャー 。上清中に見つかった放射能の割合はPVSS38Cの濃度の関数として表されます。 14S用濃度 - 反応関係は14Sに排他的に存在するエピトープとPVSS38Cの相互作用を示す、見つけることができます。非常に高濃度で無視非特異的取り込みが注目されているものの、N-、また、H-抗原との有意な相互作用が検出できません。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> 図3。 nanobodyのNB1によって異なるポリオウイルス抗原の磁気ビーズの親和性のキャプチャ </stronG&gt;。上清中に見つかった放射能の割合は、NB1の濃度の関数として表されます。 NB1は、任意のポリオウイルス抗原またはサブユニットとの相互作用を持たないことが知られています。放射能の100％が上清中に検出されたので、どんなウイルスが非特異的にNB1にバインドされませんでした。 図2中の放射能の消失は、したがって、その抗原に対するnanobodyの特定の親和性のみによるものである。 <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> 図4。アッセイの再現性 。上清中の放射能の割合の平均値はnanobodyの濃度の関数として表されます。実験は、異なる日に、別の人による8回繰り返した。標準偏差は、縦棒として表されます。

<ol><li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li>
<li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li>
<li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method%3A+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li>
<li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li>
<li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent%3A+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+camel+antibodies%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li>
<li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li>
<li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li>
<li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li>
<li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWild%2C+D+%22The+Immunoassay+Handbook%22">The Immunoassay Handbook</a>. , Third edition, Elsevier. (2005).</li>
<li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li>
<li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

プロトコルでは、nanobodyのと相互作用する抗原の放射能を上清からの放射標識されたウイルスの損失として定義されています。したがって、沈殿した放射能（= 1​​00 - ％）の量は、（磁気ビーズに結合した）上清中の放射能（=％）で間接的な方法で推定することができます。その一方で、それは500 mMのイミダゾールを用いた磁気ビーズから免疫複合体を溶出することにより直接的な方法で抗原の沈降結合画分の放射能を測定することも可能です。それは以前に放射能の合計量と上清とペレット画分に認められた放射能の合計の間に完璧にマッチがあることを11が示された。したがって、それは許容し、上清の放射能を測定する時間の節約です。磁気ビーズから免疫複合体の溶出方法は、タイスらによって記載されています。、2011 11。 アパポリオウイルスのRTは、他のピコルナウイルスは、経済的に重要な口蹄疫ウイルス（FMDV）2のように、立体配座変換を誘発した固体表面に敏感であることが知られている。形状やプラスチックに結...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong試薬の&gt;名前</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;<td<strong&gt;コメント</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ダイナHisタグの単離とプルダウン</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt;磁気ビーズ</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Optiphase &#39;HiSafe 2&#39;</td&gt;<td&gt;パーキンエルマー</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt;シンチレーション流体</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

この記事では、単純な、定量、液相の親和性捕捉アッセイが提示されています。一つのタンパク質をタグ付けすることができます提供され、別のタンパク質が標識され、このメソッドは、タンパク質 - タンパク質相互作用の調査のために実装することができます。これは、コバルト被覆磁性ビーズによるタグ付きタンパク質の認識に、タグ付きタンパク質と標識された第2の特異的なタンパク質間の相互作用で一方一方に基づいています。最初に、ラベルとタグ融合タンパク質を混合し、室温でインキュベートされています。タグを認識した磁性ビーズは、追加され、標識タンパク質の結合画分は、磁石を使用して非結合画分から分離されています。キャプチャされた標識タンパク質の量は、非結合画分に残った標識タンパク質の信号を測定することにより、間接的な方法で決定することができます。コンフォメーションの変換に敏感なタンパク質が尻である場合に記載の液相親和性アッセイは、非常に便利です。ayed。アッセイの開発とアプリケーションがポリオウイルスとナノボディ1を認識してポリオウイルスの間の相互作用を実証しています。ポリオウイルスは、固体表面（未発表データ）に接続されたコンフォメーションの変換2〜敏感であるため、ELISAの使用が制限されており、液相ベースのシステムは、したがって、優先されるべきである。しばしばpolioresearch 3,4で使用されている液相ベースのシステムの例としては、マイクロタンパク質免疫沈降テスト5です。このテストは、その適用性を実証しているにもかかわらず、それが6,7ナノボディで不在であるFcの構造を必要とします。ただし、別の機会として、これらの興味深いかつ安定した単一ドメイン抗体8は簡単に別のタグを使用して設計することができます。広く（彼の）6-tagはそのような自分の順番で簡単に磁気ビーズ上にコーティングすることができ、ニッケルやコバルトなどの二価イオンに対する親和性を示しています使用されます。したがって、我々はこの単純な定量を開発しましたコバルト被覆磁性ビーズに基づく親和性捕捉アッセイ。ポリオウイルスは、ナノボディで妨害さの相互作用を有効にして定量的な検出が可能にする35 Sで標識した。メソッドは、実行が容易で、さらに効果的に再生磁気ビーズの可能性によってサポートされている、低コストで確立できます。

この記事では、単純な、定量、液相の親和性捕捉アッセイが提示されています。それは一方では、磁気ビーズとタグ融合タンパク質（例えば、ナノボディ）との間の相互作用や他のタグ付きタンパク質と第二、標識タンパク質（例えば、ポリオウイルス）との間の親和性に基づく信頼性の高い手法である。

本記事では、簡便な定量的液相アフィニティーキャプチャアッセイを紹介します。一方のタンパク質にタグを付加し、もう一方のタンパク質に……

本プロトコルでは、ポリオウイルスとポリオウイルス認識ナノボディの相互作用を利用し、簡便な定量的な液相アフィニティーキャプチャーアッセイを実演します。原理的に、コバルトコート磁性ビーズを用いて、タグ付きタンパク質および相互作用する放射性標識タンパク質をプルダウンします。まず、標識タンパク質とタグ付きタンパク質を混合し、室温でインキュベートします。次に、タグを認識する磁気ビーズを加え、磁石を用いてラベル化タンパク質の結合画分を非結合画分から分離します。その後、非結合画分に含まれるラベル化タンパク質のシグナルを測定し、非結合画分中のラベル化タンパク質量を決定します。この液相アフィニティーアッセイによる結果は、構造変化に敏感なタンパク質を解析する場合に非常に有用です。この液相アフィニティキャプチャーアッセイは、ポリオウイルス認識ナノボディとさまざまなポリオウイルス抗原との間の相互作用に関する知見を提供できます。この手法は、一方のタンパク質を標識でき、もう一方のタンパク質を検出できるのであれば、他のタンパク質間相互作用にも適用可能です。我々は、ポリオウイルス認識ナノボディとさまざまなポリオウイルス抗原との相互作用の調査に関心を持った際に、この手法を考案しました。ポリオウイルスは、固体表面に付着した際の構造変換に敏感であるため、e LSAの利用には制限があります。したがって、液相ベースのシステムが好まれます。ポリオウイルスの研究でよく用いられるこのような液相ベースのシステムの例として、micro proteinが挙げられます。免疫沈降法によるアッセイです。この手法の適用性は証明されていますが、従来の抗体のような結晶構造が必要であり、ナノボディにはそれがありません。非常に安定しており、興味深い単一ドメイン抗体であるこれらのナノボディは、異なるテキストを用いて容易にエンジニアリングすることが可能です。広く用いられているHisタグは、ニッケルやコバルトなどの二価イオンに親和性を示し、これらのイオンは磁気ビーズ上に容易にコーティングすることができます。そこで我々は、コバルトコーティング磁気ビーズを用いた簡便な定量的親和性捕捉アッセイを開発しました。ボルテックスで磁気ビーズのストックを再懸濁し、各サンプルにつき10 µLをチューブに移して磁石を用いてビーズをペレット化します。洗浄のため、透明な上清を除去します。結合バッファーを150 µL加えます。マグネットを用いてビーズを回収し、2回目の洗浄後、上清を除去します。各サンプルおよびコントロールについて、ビーズを40 µLの結合バッファーに再懸濁します。サンプル1のバックグラウンド用には、放射性標識ウイルスを含まず、同量の結合バッファーのみを入れたコントロールウェルを用意します。100%の放射能サンプルを2つ用意します。ナノボディを結合バッファーに置き換えて、それ以外のすべての成分をウェルに加えます。次に、結合バッファーを用いて全量を80 µLとし、2000 cpmの${}^{35}\text{S}$標識ポリオウイルス7株1型をすべてのサンプルに加えます。コントロールを承認します。サンプル1です。各サンプルに10 µLのナノボディ希釈液を添加します。シェーカーで10秒間十分に混合し、室温で1時間インキュベートします。次に、洗浄済みの磁気ビーズ懸濁液を40 µL加え、連続的に振盪しながら室温で10分間インキュベートします。磁石でビーズをペレット化し、各サンプルの放射能を測定するために、上清をチューブに移します。上清50 µLを計数用フラスコに移します。3 mLのシンチレーション液混合物を加え、シンチレーションカウンターで測定します。水を用いてチューブ内の使用済み磁気ビーズを回収し、500 ×gで2分間遠心分離します。上清を捨て、0.5 molar 水酸化ナトリウム 6 mLにビーズを再懸濁します。その後、懸濁液を複数のチューブに分注し、超音波洗浄機で5分間インキュベートします。磁石でビーズをペレット化して上清を除去した後、各チューブに2% SDS溶液を1 mL加え、ボルテックスミキサーとフォイルで5分間混合します。次に、ビーズを回収します。各チューブに0.2 M EDTA（pH 7）を1 mL加え、超音波洗浄機で5分間インキュベートします。その後、ビーズを回収し、1 mLの水で3回洗浄した後、1 mLの10 mM塩化コバルト溶液で洗浄します。チューブをシェーカーにかけ、10分間振盪します。次に、マグネットを用いてビーズを回収し、1 mLの結合バッファーに再懸濁します。1 mLの20%エタノールで2回洗浄し、最後にビーズを元の量である20%エタノールに再懸濁して、濃度40 mg/mLの再生ビーズを得ます。コントロールを設定して、バックグラウンド放射能を補正します。コントロール試料1を0%放射能値、コントロール試料2を100%放射能値として設定します。次に、各サンプルについて、ナノボディによる放射標識ウイルスの全体的な沈降の指標として、上清中の放射能の割合を算出します。本実験では、ポリオウイルスの3種類の異なる抗原（天然抗原、加熱抗原、14 sサブユニット）を用い、PVSS 38 Cとポリオウイルス特異的抗体の親和性を評価しています。興味深いことに、放射標識14 sサブユニットを含むサンプルの上清中の放射能は、ナノボディPVSS 38 Cの濃度上昇に伴って減少します。これは、ナノボディPVSS 38 Cに結合し、間接的に磁気ビーズに結合したポリオウイルス14 sサブユニットの量が増加したことを示しています。pvs S 38 CはポリオウイルスのN抗原型およびH抗原型に対して親和性を示さないため、このナノボディはポリオウイルスの14 sサブユニットに特異的であると考えられます。本手法で測定したナノボディの抗原に対する親和性は、無関係なナノボディと比較して特異的です。NB oneは、ポリオウイルスの3つの抗原型のいずれに対しても反応性を示しません。異なる日に異なる研究者が作成したこの用量反応曲線が示すように、本システムは高い再現性をもたらします。この信頼性の高い液相アフィニティーキャプチャーアッセイを習得すれば、ビーズのリサイクルを含め、2時間以内に適切に実施することが可能です。このビデオを視聴することで、異なるタンパク質間の相互作用を研究する際、特に固相ベースのシステムが使用できない場合に、磁性ビーズを用いた液相アフィニティーキャプチャーアッセイをどのように使用すればよいかについて、十分な理解が得られるはずです。

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不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

そのターゲットの脂質とタンパク質の相互作用をテストするために我々は、MACSとターゲットの脂質とアネキシンV結合ホスファチジルセリンから合成されたアネキシンV...

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

ウイルスの受容体分子を利用して、最近開発された新たな粒子の凝集反応（PA）アッセイは、ポリオウイルス（PV）の迅速かつ容易に識別することができました。この記事では、PVの識別のためのPAのアッセイのための手順が表示されます。...

ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。...

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

このビデオでは、サンプルから抗原を表示するウイルス様粒子(VLP)を単離する、VLPキャプチャーアッセイと呼ばれる免疫沈降アッセイのデモを行います。この抗原は、磁気ビーズに結合した特異的抗体と結合し、固定化された抗原-抗体複合体を形成し、後で分離してさらなる分析のために保存します。...

ウイルス様粒子捕捉アッセイ:中和抗体標識磁気ビーズを用いて試料から抗原表示VLPを単離する方法

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。...

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

ウイルスまたは細胞外小胞は、表面抗原を認識する抗体に結合した15nmの磁性ナノ粒子で免疫捕捉されました。捕捉されたビリオンまたは小胞は、他の表面抗原に対する蛍光抗体で標識されました。得られた複合体を高磁場中で分離し、蛍光でトリガーされる従来のフローサイトメーターで分析しました。...

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

タンパク質間相互作用は、細胞の核と細胞質の両方で発生する可能性があります。これらの相互作用を調べるために、従来の共免疫沈降と最新の近接ライゲーションアッセイが適用されます。本研究では、これら2つの方法を比較して、核と細胞質におけるNF90-RBM3相互作用の分布を可視化します。...

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化と<em&gt;その場で</em&gt;近接ライゲーションアッセイ

ここでは、抗原表示ウイルス様粒子(VLPs)上の中和エピトープを検出するプロトコルを提示する。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来VLPの免疫沈降は、G結合型磁気ビーズのタンパク質に結合したエンベロープ糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いて行う。捕獲されたVLPは、その後、SDS-PAGEおよびウイルスコアタンパク質Gag特異的抗体を採用したウェスタンブロット分析を行う。...

捕捉アッセイを用いたウイルス様粒子(VLP)ベースワクチンに対する抗原中中和感受性エピトープの検出

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

学ぶ 磁気ビーズを用いた液相アフィニティキャプチャーアッセイでタンパク質間相互作用を解析する方法。ポリオウイルスとナノボディの相互作用を定量的に評価し、構造変換感受性タンパク質の研究に応用できます。

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

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