2012年5月29日
この記事では、単純な、定量、液相の親和性捕捉アッセイが提示されています。それは一方では、磁気ビーズとタグ融合タンパク質(例えば、ナノボディ)との間の相互作用や他のタグ付きタンパク質と第二、標識タンパク質(例えば、ポリオウイルス)との間の親和性に基づく信頼性の高い手法である。
このプロトコルは、ポリオウイルスとポリオウイルスの間の相互作用を使用し、ナノ体を認識して、単純な定量的な液相親和性捕捉アッセイを実証します。主にコバルト被覆磁気ビーズは、タグ付きタンパク質や相互作用する放射性標識タンパク質を引き下げるために使用されます。まず、標識および標識タンパク質を混合し、室温でインキュベートします。
次に、タグを認識する磁気ビーズを追加し、磁石を使用して標識タンパク質の結合画分と非結合画分を分離します。次に、未結合画分に見られる標識タンパク質のシグナルを測定し、非結合画分に見られる標識タンパク質の量を決定します。この液相親和性アッセイの結果は、確認可能な変換感受性タンパク質をアッセイする際に非常に有用です。
この液相アフィニティーキャプチャーアッセイは、ポリオウイルスとの相互作用に関する洞察を提供し、ナノボイと異なるポリオウイルス抗原を認識することができます。この方法は、一方のタンパク質を標識し、もう一方のタンパク質を検出できるという条件で、他のタンパク質タンパク質相互作用にも適用できます。この方法のIDを初めて入手したのは、ポリオウイルスとの相互作用を調査し、ナノボディとさまざまなポリオウイルス抗原を認識することに興味を持ったときでした。
ポリオウイルスは確認変換に敏感であるため、固体表面に付着すると、e LSAの使用は制限されます。したがって、液相ベースのシステムが好まれるべきです。ポリオウイルスの研究でよく使用されるこのような液相ベースのシステムの一例が、マイクロタンパク質です。
免疫沈降アッセイ。この試験はその適用性を証明していますが、ナノボディにはない従来の抗体のような結晶構造が必要です。これらのナノボディは、興味深く、非常に安定したシングルドメイン抗体であり、異なるテキストで容易に操作することができます。
広く使用されています。彼のスタックは、ニッケルやコバルトなどの二価イオンに親和性を示し、磁気ビーズに容易にコーティングできます。そこで、コバルト被覆磁気ビーズに基づく簡便な定量的アフィニティーキャプチャーアッセイを開発しました。
リースは、渦による磁気ビーズのストックであり、磁石を使用してビーズをチューブペレットに各サンプルの10マイクロリットルを移します。透明なスーピネートを取り外してビーズを洗います。150マイクロリットルの結合バッファーを追加します。
磁石を使用してビーズを採取し、2回目の洗浄後に仰臥位を取り除きます。制御する各サンプルについて、ビーズを40マイクロリットルの結合バッファーに再懸濁します。サンプル1の背景については、放射性標識ウイルスを含まないウェルを準備しますが、制御用に同量の結合バッファーを準備します。
100%のラジオ活動のサンプル2。ナノボディを結合バッファーに置き換えることを除いて、すべての成分をウェルに加えます。次に、S 35標識ポリオウイルス7株タイプ1を、すべてのサンプルに総量80マイクロリットルの結合バッファーに毎分2000カウント追加します。
制御を受け入れます。サンプル1。各サンプルに10マイクロリットルのナノボディ希釈液を加えます。
シェーカーで10秒間よく混合し、室温で1時間インキュベートします。次に、洗浄した磁気ビーズ懸濁液40マイクロリットルを加え、連続振とう下で室温で10分間インキュベートし、ビーズを磁石でペレット化し、透明化したSUP被覆液をチューブに移して各サンプルの放射能を測定し、50マイクロリットルのすくい酸塩を計数フラスコに移します。シンチレーション流体混合物を3ミリリットル加え、この断熱材を読み取ります。
使用済みの磁気ビーズを水でチューブ内でカウンタープルし、Gの500倍を2分間遠心分離します。仰臥位を廃棄し、ビーズを6ミリリットルの0.5モル水酸化ナトリウムに再懸濁します。次に、懸濁液を複数のチューブに分注し、超音波浴で5分間インキュベートします。
ビーズを磁石でペレット化し、仰臥位を取り除いた後、各チューブに2%SDS溶液1ミリリットルを加え、ボルテックスとホイルで5分間混合します。さあ、ビーズを収穫します。各チューブに0.2モルのEDTA pH 7の1ミリリットルを加え、超音波浴でチューブを5分間インキュベートします。
次に、ビーズを収集し、ビーズを1ミリリットルの水で3回洗浄し、続いて1ミリリットルの10ミリモル塩化コバルト溶液を洗います。チューブをシェーカーに10分間置きます。磁石でビーズを採取し、1ミリリットルの結合緩衝液に懸濁液を回収します。
20%エタノールの1ミリリットルで2回洗浄し、最後にビーズを元の容量の20%エタノールに再懸濁して、40ミリグラム/ミリリットルの濃度で再生ビーズを取得します。設定制御により、バックグラウンド放射能を補正します。サンプル1を0%放射能値として、制御サンプル2を100%放射能値として
。次に、各サンプルについて、ナノボディによる放射性標識ウイルスの全体的な沈殿量の尺度として、塩中の放射能の割合を計算します。この実験では、ポリオウイルスの3つの異なる抗原、天然抗原、加熱抗原、および14sサブユニットを使用して、PVSS 38 Cとポリオウイルス特異的抗体の親和性を評価します。興味深いことに、14 sサブユニットと標識された放射性物質を含む試料の塩中の放射能は、ナノボディPVSS 38 Cの濃度の増加とともに減少します。これは、ナノボディP pvs、S 38 C、および間接的に磁気ビーズに結合するポリオウイルス14 sサブユニットの量の増加を示しています。
ポリオウイルスのN抗原型およびH抗原型に対するpvs S 38 Cの親和性は観察されないため、ナノ体はポリオウイルスの14 sサブユニットに特異的であるように見えます。この方法によって測定されるナノ体の抗原に対する親和性は、無関係のナノ体として特異的である。注1は、ポリオウイルスの3つの抗原型に対して反応性を示しません。
このシステムは、異なる日に異なる研究者によって生成されたこの用量反応曲線に示されているように、高い再現性を生み出します。この信頼性の高い液相を習得すると、アフィニティーキャプチャーアッセイは、含まれているビートのリサイクルから2時間以内に適切に実行できます。このビデオを見れば、異なるタンパク質間の相互作用を研究する際、特に固相ベースのシステムを使用できない場合に、磁気ビートに基づくこの液相アフィニティーキャプチャーアッセイの使用方法を十分に理解できるはずです。
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この記事では、タグ付きタンパク質と相互作用させるための磁性ビーズを利用した定量的液相アフィニティカプチャーアッセイを紹介します。この方法は、タグ付きタンパク質とポリオウイルスなどのタグ付きタンパク質の間の相互作用を分析するのに特に効果的です。
Quantitative liquid phase affinity capture assays using magnetic beads address a critical need for studying protein-protein interactions where conformational sensitivity limits solid-phase approaches. This method enables robust, reproducible measurement of binding events, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. Its adaptability and low cost make it valuable for early discovery and assay development pipelines across diverse protein systems.
This assay integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical research, especially for systems where conformational integrity is essential.