SPLINTERを使用してプールされたシーケンスからレアゲノム変異の検出

本手順の全体的な目的は、稀な機能的変異が優勢に見られる個体集団の中から、標的となる遺伝子を特定することです。これは、まずDNAサンプル集団をプーリングし、次に次世代シーケンシングライブラリを作成してシーケンシングを行うことで達成されます。

続いて、リードをリファレンス配列にアライメントし、エラーモデルを作成します。最終ステップは、splinterアルゴリズムを用いた計算解析です。最終的に、プールされた次世代シーケンシングのsplinter解析を用いて、集団内で稀な機能的バリアンスが多量に存在する遺伝子を特定します。以下にその手順を示します。

本日は、私のメンターであり共同研究者であるRob Mitraの研究室の大学院生であるFrancesco Vilaniaと、私の研究室の大学院生であるEnrique Ramosが登場します。個々のジェノタイプを決定するなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、事前の情報なしに、DNA分子の混合集団の中に存在する稀な配列変異を非常に正確に検出できることです。この手法は、大規模コホート研究において新規の疾患原因となる稀な変異の頻度をどのように決定するかなど、遺伝学およびゲノミクス分野における重要な疑問への回答に役立ちます。

最適な精度を得るためには、すべてのスプリンター実験において陰性コントロールと陽性コントロールが必要となります。PFU ultra high fidelity DNA polymeraseを用いてPCR反応ミックスを調製してください。陰性コントロールには、クローン化されたベクターバックボーンなど、遺伝的変異がないことが分かっている任意のDNA配列からのPCR産物を使用します。

ここでは、M 13 MP 18 ベクター由来の 1, 934 base pair アンプリコンを使用します。ポジティブコントロールには、全集団に存在する、以前に検証済みの任意の配列変異セットを使用できます。このデータが入手できない場合、本ラボでは、この表に記載されている PGMT easy ベクターにクローニングされた設計済み配列の混合物からなる 331 base per PCR 生成物で構成される人工ポジティブコントロールを設計しています。

これらの配列を組み合わせることで、患者プール内における真の変異の様々なマイナーアレル頻度を模倣します。本ビデオに付随する書面プロトコルで詳述した通りにサンプルのPCR増幅を行った後、Kyogen Kayak Quick Column精製、または大規模な精製の場合は真空マニホールドを備えた96ウェルフィルタープレートを用いて、各PCR産物から過剰なプライマーを除去します。精製後、標準的な手法を用いて各PCR産物の定量を行います。

すべてのPCR産物とコントロールを、分子数で標準化したプールに統合する準備をします。濃度でプールすると、大きな産物に対して小さなアンプリコンが過剰に表現される結果となります。代わりに、アンプリコンあたり標準化した分子数をプールしてください。

ピペッティング中の精度を維持するのに十分な大きさの任意の数を選択します。PCR産物およびコントロールを回収します。小さなPCR産物の断片化は、その末端側のバイアスが生じる可能性が高いため、PCR産物のライゲーションが必要です。

この理由により、断片化させる前にプールPCR産物を大きなコンストラクトにライゲーションします。プロトコルに記載されている通り、T4 Ligase、T4 PNK、およびPEGを使用して、平滑末端ライゲーション用のミックスを調製します。反応液を22 °Cで17時間インキュベートします。

続いて65 °Cで20分間インキュベートし、その後4 °Cで保持します。その後、50 ngのサンプルをアガロースゲルに電気泳動してライゲーションを確認します。ライゲーションが成功すると、レーンに高分子量のバンドが現れます。

サンプルをQiagen PB Bufferで10倍に希釈して粘性を下げ、ランダムソニケーション法によるDNA断片化の準備を行います。次に、24サンプル対応のDiagenode BioRuptorを用い、高出力で25分間（1分あたり40秒間オン、20秒間オフ）ソニケーションを行い、PCR産物の大きな濃縮物を断片化します。アガロースゲルでDNA断片化の結果を確認し、本文に記載されている通りにIlluminaシーケンシングに進みます。

シーケンシングを開始するには、リードのアライメントを行います。生のシーケンシングリードファイルをscarf形式に変換するか、または圧縮してください。圧縮は任意です。

これにより、関連情報を失うことなく、後続の解析ステップに要する時間とスペースを削減できます。付属のアライメントツールを使用して、rawリードをアノテーション済みfasterリファレンス配列にアライメントします。ターゲット領域に特化したものとして、PCR反応および陽性・陰性コントロールを含めてください。

入力形式はscarf形式または圧縮形式である必要があります。次に、本文の記述に従ってファイルのタギングを行います。各ランでは、各ランのエラーをモデル化し、正確なバリアントコールを行うために特性評価される、固有のシーケンシングエラープロファイルが生成されます。

アライメント済みのタグファイルから、配列変異が導入されていることが既知の内部コントロールを各プールサンプルライブラリに含めます。付属のツールを使用して、ネガティブコントロールのリファレンス配列を用いてエラーモデルファイルを生成します。すべてのネガティブコントロール配列を使用することも、あるいは5'端および3'端で指定されたサブセットのみを使用することも可能です。ユニークリードと擬似カウントは常に適用する必要があります。

このツールは、出力ファイル名パラメータに0、1、または2を付加した3つのファイルを生成します。これらのファイルは、splinterによるバリアントコールにおける、それぞれ0次、1次、および2次のエラーモデルに対応しています。ランのエラー率プロファイルを可視化する際は、常に2次エラーモデルを使用してください。

エラーモデルグラフのプロットに使用されたPearlスクリプトを用いて、0次エラーモデルファイルのPDFエラープロットを生成できます。このプロットファイルにより、ラン固有のエラー傾向が明らかになり、解析に使用する最大リード塩基数を推定することが可能です。次のセクションでは、エラーモデルを用いてアライメント済みファイルにsplinterを実行し、希少な配列バリアントを検出する方法について解説します。

解析の最初のステップは、リファレンス配列とエラーモデルを用いて、アライメント済みファイルに対してsplinterを実行することです。欠陥があると判断されたシングルリードベースは、解析から除外できます。P値のカットオフ値によって、バリアントコールの解析の厳格さが決定されます。

最小カットオフ値として-1.301から開始することが適切です。プールサイズオプションは、実際のプール内の単一アレルよりも低いマイナーアレル頻度による潜在的な分散を排除することで、アルゴリズムの信号対雑音比（S/N比）の識別能を最適化します。プールサイズオプションは、実験で分析した実際のアレル数よりも大きく、かつそれに最も近い値に設定してください。

低頻度で検出されたバリアンスはノイズとして無視されます。すべてのパラメータとファイル名を入力した後、splinterを実行します。このファイルは、サンプル全体で統計的に有意なすべてのヒットを、バリアントの位置とバリアントの種類の説明とともに返します。

DNAストランドごとのバリアント出現頻度のP値、およびDNAストランドごとの総カバレッジ。リストバイアルは、サンプル全体でカバレッジを標準化するためにsplinterによって使用されます。最初のフィールドは対象となるアンプリコンを示し、2番目のフィールドは変異が存在する位置を示します。

Nは、配列の残りの部分に変異が含まれていないことを示します。標準化においては、特定のランにおける感度と特異度を最大化するために、ポジティブコントロールの解析が重要となります。これは、初期のカットオフ値である-1.301では、すべての偽陽性を排除するには不十分である可能性が高いためです。

各スプリンター解析では、検出された各バリアントの実際のP値が表示されますが、これらは事前に優先順位を予測することができません。しかし、既知の真陽性の塩基部位について、初回出力で表示された最も緩いP値を用いて解析全体を繰り返すことが可能です。これにより、真陽性をすべて保持しつつ、通常は真陽性に比べてP値の有意性が大幅に低い偽陽性の大部分、あるいはすべてを除外することができます。

このプロセスを自動化するには、カットオフテスター（cutoff tester）スクリプトを使用できます。カットオフテスタースクリプトには、splinter出力ファイルと、標準化に使用したものと同様のタブ区切り形式の陽性コントロールヒットリストが必要です。出力結果として、最適な値に段階的に到達するカットオフ値のリストが作成されます。

最終行は、そのランにおける最適カットオフ値を示しており、データ解析に使用できます。最適な結果は、感度と特異度がいずれも1に達することです。しかし、それに達しない場合は、組み込むリード塩基数を変更することで、スプリンター解析を最適化できます。

最終的なカットオフは、cutoff cutスクリプトを用いてデータに適用でき、これにより最適カットオフ値を下回るヒットがsplinter出力ファイルからフィルタリングされます。このステップにより、サンプルに含まれるsnipsおよびindelsを含む最終的なsplinter出力ファイルが生成されます。なお、挿入（insertions）の出力形式は、置換（substitutions）や欠失（deletions）とはわずかに異なりますのでご注意ください。

この種のプロットでは、プールされたサンプル中の単一アレルにおけるカバレッジの関数としての精度が可視化されます。精度は、受信者動作特性曲線（ROC曲線）の曲線下面積（AUC）として推定され、ランダムな精度である0.5から完全な精度である1.0までの範囲で示されます。この例では、200、500、1,000アレルのプールにおける単一変異アレルの検出について、アレルあたりのカバレッジの関数としてAUCがプロットされています。

ここでは、挿入、欠失、および置換の合計に対するUCをプロットしています。このエラープロットは、特定のポジションで誤った塩基が組み込まれる確率を示しています。エラープロファイルからは、シーケンシングリードの3'端に向かって上昇傾向にあるものの、低いエラー率であることがわかります。

注目すべき点として、参照ヌクレオチドによってエラー確率が異なります。このプロットは、アレルあたりのカバレッジが25倍を超えたポジションにおける、splinterによるアレル頻度推定の精度を示しています。splinterによって推定されたプールDNAのアレル頻度と、ゲノムワイド関連解析（GWAS）の結果から測定されたアレルカウントとの比較です。

非常に高い相関において、974人の集団を抽出し、20 kilobasesにわたる領域をターゲットとしてシーケンシングを行いました。希少変異の検出にはSplinterを適用しました。標準プロトコルに従い、各個体について、タグ付き変異と新規変異のジェノタイピング間のgwas一致度によるジェノタイピングを事前に実施しました。

プール検体における判定結果は良好でした。集団内では稀な2つのバリアントを含む計3つのバリアントが、シーケンス結果からde novoで判定され、個別のパイロシーケンスによって検証されました。パイロシーケンスとプールシーケンス間のマイナーアレル頻度または数学的な一致度は極めて良好でした。プール検体内で稀なバリアントの特定が完了すると、多くの研究者が、特定したバリアントがどのような機能的影響を及ぼすかを知りたいと考えます。

したがって、変異のアノテーションがプロセスの次のステップとなります。この手法は、DNAシーケンシング分野の研究者が、大規模な集団研究において希少変異を迅速かつ費用対効果の高い方法で特性評価し、研究することを可能にしました。このビデオを視聴することで、Splinterを用いてプールされたDNAサンプルから希少な配列変異を検出する方法について、十分に理解できるはずです。