高密度ヒト胚性幹細胞の培養線維芽細胞からの迅速な除去

本実験の全体的な目的は、迅速かつ効率的にヒト幹細胞コロニーを単離することです。これは、ヒト胚性細胞をマウス胚性線維芽細胞の高密度層の上に培養することによって達成されます。時間の経過とともに幹細胞集団が拡大することで、ヒト幹細胞の数が増加し、同時にメディウム内に島状のコロニーが形成されます。

次に、吸引によってメチルセルロース層を除去し、ヒト胚性幹細胞の個々のコロニーを残します。幹細胞マーカーの免疫組織化学染色の結果、この手法がフィーダー細胞を排除し、コロニーの完全性を維持するための有効な分離方法であることが示されました。私がこの手法を考案したのは、研究室で細胞の共培養を行っていた際、過剰に合流した培養系から幹細胞培養物を救いたいと考えたときのことでした。

このシステムを使用する際、多くの人が直面する問題は、ヒト幹細胞の培養経験が不足していることです。私たちは、ソートや手作業による幹細胞コロニーのピックアップなどの他の手法と比較して、実験のために大量のヒト胚性幹細胞を単離する必要がある場合に、この手法が特に有用であることを見出しました。この方法は、高密度培養からコロニーを単離する上で、より迅速かつ効率的です。

マウス胚性線維芽細胞は、胚性幹細胞と共培養する前に、細胞分裂を停止させるためにマイトマイシンCによる処理または放射線照射を行う必要があります。mEFの播種2時間前に、プラズマ処理した60mm培養ディッシュに0.05%ゼラチンを2mLずつコートします。処理済みのmEFバイアルを融解し、1,500 RPMで5分間遠心分離した後、ゼラチンコートしたディッシュに1cm²あたり約20,000個の細胞密度で播種します。細胞が付着するまで一晩インキュベートしてください。新しい培養は、凍結保存細胞から開始するか、現在の培養物をmEFコートしたディッシュに継代させることで開始できます。ヒト胚性幹細胞の大きなコロニーが含まれるプレートから開始する場合は、加温したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）3mLで1回洗浄してください。

1 mg/mLのコラゲナーゼIV溶液を3 mL加え、37 °Cで5〜10分間インキュベートします。トリプシンを用いた場合とは異なり、細胞が個々に分離したり凝集したりすることはありません。5 mLピペットチップの先端を用いて、コロニーに格子状の溝を作り、小さな細胞塊に分散させます。

ピペットチップの先端を培養プレートに対して垂直に持ち、プレートの底をスクレイピングして、表面からすべての細胞を剥離させます。細胞をファルコンチューブに移して回収し、1000 RPMで5分間遠心分離した後、培地を吸引除去します。次に、前日に播種したマウス胚性線維芽細胞から培地を吸引除去します。

次に、ヒト胚性幹細胞を元のプレートから1:3の比率で播種し、3 mLのヒト胚性幹細胞培地で給餌します。ヒトHECSを高密度で10〜14日間培養します。アスピレーティングピペットのチップをプレートの端に当て、吸引を用いてメチルセルロース（meth）シートの端をゆっくりと引き上げます。

ディッシュから培地を除去します。チップでセルシートを捉え、プレートの上でチップをゆっくりと弧を描くように動かします。シートでピペットが大きく詰まった場合は、培養物からシートを取り除いてください。

アスピレーターで培養皿の上部を軽く叩いて細胞を完全にバラバラにし、完全に吸引して細胞を除去します。直ちにヒト胚性幹細胞培地を加え、培養皿に播種した後、培養物を細胞培養インキュベーターに戻します。この共培養システムにより、マウス胚性線維芽細胞に囲まれた高密度のヒト胚性幹細胞コロニーが形成されます。

吸引法を用いることでMESを除去し、乱れのない小さなヒト胚性幹細胞コロニーを作成できます。無傷のコロニー周囲にMESがほとんど残っていないため、胚性幹細胞コロニーは非常に大きなコロニーへと大幅に拡大することが可能です。例えば、メチル化除去直後に示されているこのヒト胚性幹細胞コロニーは、除去後10日目までのコロニーの免疫蛍光同定において、非常に大きなコロニーへと拡大しました。

枯渇させても、コロニーは多能性マーカーの発現を維持し、中胚葉への分化を示さないことが分かります。これらの透過光画像は、免疫蛍光染色したコロニーの形態を異なる倍率で示したものです。DAPIは細胞の核を染色しています。

重要な点として、ヒト胚性幹細胞はヒト幹細胞マーカーであるSSEA-4、TRA-1-60およびTRA-1-81を発現しています。画像には、典型的な滑らかな境界を持つコロニーが描かれていることに注意してください。これらの細胞は中胚葉分化の早期マーカーであるFLK-1を発現しておらず、またDDR2染色の欠如から示されるように、線維芽細胞も含まれていませんでした。

このビデオを視聴することで、自然環境を操作する培養技術を用いてヒト幹細胞コロニーを単離する方法について、十分に理解できるはずです。この操作に習熟すれば、わずか数秒で完了させることができます。また、培地や不要な層を除去する際に、培養物が乾燥しないように十分注意してください。