Name: ASCの分化を制御するための二層ゲルをエンジニアリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学ぶ二層ゲル構造を用いたASC分化制御法。コラーゲンとPEG-フィブリンの異なる微小環境により、ASCが二方向に移行し、幹細胞性状の維持と血管系分化を同時に誘導する。皮膚創傷治癒と組織再生への応用が期待される革新的なバイオマテリアル技術である。

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SNは、ピッツバーグ·ティッシュエンジニアリング·イニシアティブからポストドクトラルフェローシップ·グラントによってサポートされていました。 DOZは、ジュネーブ財団から授与の助成金によってサポートされています。

<ol><li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bilayer+construct+controls+adipose-derived+stem+cell+differentiation+into+endothelial+cells+and+pericytes+without+growth+factor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A bilayer construct controls adipose-derived stem cell differentiation into endothelial cells and pericytes without growth factor stimulation.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 941-953 (2011).</li>
<li>Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+hydrogel+niches+that+promote+hMSC+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability.</a> Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).</li>
<li>Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+production+prevents+anoikis+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Mater Res A. 81, 259-268 (2007).</li>
<li>Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+stem+cells+and+biomaterial+scaffolds+for+constructing+tissues+and+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery.</a> , (2008).</li>
<li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell+delivery+into+collagen+gels+using+chitosan+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1369-1384 (2010).</li>
<li>Bubnis, W. A., Ofner, M. C. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+epsilon-amino+groups+in+soluble+and+poorly+soluble+proteinaceous+materials+by+a+spectrophotometric+method+using+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).</li>
<li>Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PEGylated+fibrin+patch+for+mesenchymal+stem+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A PEGylated fibrin patch for mesenchymal stem cell delivery.</a> Tissue Eng. 12, 9-19 (2006).</li>
<li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Lab Invest. 7, 134-137 (1958).</li>
<li>Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+differentiation+of+bone+marrow+stem+cells+is+directed+by+a+tunable+three-dimensional+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Vascular differentiation of bone marrow stem cells is directed by a tunable three-dimensional matrix.</a> Acta Biomater. 6, 3395-3403 (2010).</li>
<li>Rochon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+epithelial+cells+regulate+the+size+and+morphology+of+tissue-engineered+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Normal human epithelial cells regulate the size and morphology of tissue-engineered capillaries.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1457-1468 (2010).</li>
<li>Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+for+expansion+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).</li>
</ol>

なし競合する経済的利益は存在しません。 免責事項ここに記載されている意見やアサーションは、作者の私的見解であり、公式、または国防省、または米国政府の部門の意見を反映して解釈されるべきではありません。著者らは、米国政府の従業員であり、この作品は、その職務の一部として作成されました。すべての作業は、米陸軍医学研究および資材コマンドでサポートされていました。本研究では、米陸軍医学研究および資材コマンド治験審査委員会によって、承認されたプロトコルに従って検討し、承認されたプロトコルの下で実施されました。

ASCはアイソレーションと、様々な種類の細胞に向かって分化する能力の容易さのためによく知られている。この原稿に記載された技術で、我々は、同時に複数のbiomatricesにこれらの細胞を曝すことによってASCの可塑性を悪用することができます。細胞は、CSMのベースから離れての移行とその周囲の細胞外環境を入力すると、細胞は足場からキューを取得し、いずれかの &quot;stemness&quot;（コラーゲン）を維持したり、血管と血管支持細胞型（フィブリン）に向かって分化を誘導することができます。私たちのラボは、皮膚および軟部組織の創傷治癒に興味を持っているので、我々は戦略的にフィブリンが自然に血管網の形成9を誘導する一方、コラーゲンは、ホストによって真皮と表皮の再生をサポートしているのでコラーゲンとフィブリンの二重層を実装しました。さらに、現在のクロストークは、皮膚のケラチノサイト、線維芽細胞、および基礎となる血管網の増殖の間で発生することを理解され、そしてこのような複雑な機構は、適切な創傷治癒10の非常に重要です。基本的な血管網がなければ、組織工学皮膚移植は、ホスト組織とinosculat...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液（HBSS） </td><td>ギブコ</td><td> 14175 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ハイクローン</td><td> SH30071.03 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプII </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> C6685 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 70μmのナイロンメッシュフィルター</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352350 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 100μmのナイロンメッシュフィルター</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352360 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> MesenPRO増殖培地システム</td><td>インビトロジェン</td><td> 12746-012 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> L-グルタミン</TD&gt; <td>ギブコ</td><td> 25030 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>のCaCl 2·2H 2 O </td><td>シグマ</td><td> C8106 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> T75組織培養フラスコ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 137787 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>キトサン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 448869 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>酢酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 320099 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> n-オクタノール</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 150630025 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ソルビタン、モノオレイン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S6760 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P1767 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> L-4859 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>エタノール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 270741 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>トリニトロベンゼンスルホン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P2297 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>塩酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 320331 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>エチルエーテル</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 472から484 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 8μmの組織培養プレートインサート</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 353097 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-408-129 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> MTT試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> M6494 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D8779 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> Qtracker細胞標識キット（Qトラッカー655） </td><td>分子プローブ</td><td> Q2502PMP </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 1型コラーゲン</td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S8045 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 12ウェル組織培養プレート</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 353043 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>フィブリノゲン</td><td>シグマ</td><td> F3879 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>シグマ</td><td> T6884 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ポリエチレンのBenztriazoleデリバティブ</td><td> Sunbio </td><td> DE-034GS </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>トリスバッファータブレット液（pH7.6） </td><td>シグマ</td><td> T5030 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5417R </td><td>エクイpment </td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>ニューブランズウィック州Scienctific </td><td> C24 </td><td>機器</td></tr><tr><td>空気-5％CO 2の加湿インキュベータ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 370 </td><td>機器</td></tr><tr><td>オーバーヘッドスターラー</td><td> IKA </td><td> Visc6000 </td><td>機器</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>コー​​ニング</td><td> PC-210 </td><td>機器</td></tr><tr><td>減圧デシケーター</td><td> - </td><td> - </td><td>機器</td></tr><tr><td>粒径分析器</td><td>マルバーン</td><td> STP2000 Spraytec </td><td>機器</td></tr><tr><td>水浴</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> Isotemp210 </td><td>機器</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>ベックマン</td><td>ベックマン·コールターDU 800UV/Visible分光光度計</td><td>機器</td></tr><tr><td>渦</td><td> Diagger </td><td> 3030a </td><td>機器</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>モレキュラーデバイス</td><td> SpectraMax M2 </td><td>機器</td></tr><tr><td>光/蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX71 </td><td>機器</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> FV-500レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>機器</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>カールツァイスマイクロイメージング</td><td>レオ435 VP </td><td>機器</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td>機器</td></tr></tbody></table>

ascの分化を制御するための二層ゲルをエンジニアリング

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

年間の天然高分子ため、そのホストの生体適合性、in vitro および in vivo での細胞と相互作用する能力のより重要性を得ています。再生医療の約束を保持している研究分野は、新規の生体材料と幹細胞の組合せを使用することです。組織工学の分野における基本戦略は、細胞機能を指示するための三次元足場（例えば、細胞外マトリックス、ヒドロゲル、マイクロ/ナノ粒子を脱細胞）の使用です。この技術は、細胞は、彼らが付着し、増殖し、それらの分化した細胞の表現型と機能2-3を表現できる上に基板が必要であることを発見から進化してきました。最近では、それはまた、細胞が付着するため、これらの基質を使用していますが、また相互作用し、マトリクス基板（例えば、細胞外マトリクス、ECM）4から手がかりを取るだけでなく、ことが決定されている。したがって、細胞と足場は、その相互接続を使用している組織開発、組織、および究極の機能を制御するのに役立ちます。脂肪由来幹細胞（ASCS）マルチ系統分化を示し、細胞の容易に利用可能なソース（すなわち、プレ血管内皮および周皮細胞）として機能することができ、脂肪組織内に存在する間葉系、非造血幹細胞である。我々の仮説は、脂肪由来幹細胞は、二層のマトリックス1で単に共存培養することにより同時に表現型を異なる方向に向けることができるということです。私たちの研究室では、皮膚創傷治癒に焦点を当てています。この目的のために、我々は皮膚固有の創傷治癒ECM環境の特性や機能を模倣することができます自然の生体材料、フィブリン、コラーゲン、キトサンから単一の複合マトリックスを作成しました。

このプロトコルは、その周囲の細胞外マトリックスからヒントを得るために、複数の表現型に分化するよう誘導される幹細胞の固有の能力を活用に焦点を当てています。このメソッドの原稿は、同時に脂肪由来幹細胞を共区別するために、PEG-フィブリンおよびコラーゲンから成る二層ハイドロゲルを利用したモデルでは、我々の説明とその特性を拡張する<sup&gt; 1</sup&gt;。

ASCの分化を制御するための二層ゲルをエンジニアリング

天然ポリマーは、その優れた生体適合性と、in vitroおよびin vivoにおいて細胞と相互作用する能力により、長年にわたり重要性を増しています。

この手順の全体的な目的は、創傷治癒を支援するために幹細胞を輸送し分化させることができる、天然バイオマテリアルからなる複合マトリックスを作成することです。まず、実験動物から脂肪由来幹細胞（ASC）を単離することでこれを達成します。次に、これらのASCをあらかじめ作製したキトサンマイクロスフェアにロードします。次に、線維化したコラーゲンゲルをキャストし、その上にA-S-C-C-S-Mビーズを積層します。最後に、A-S-C-C-S-Mコラーゲンゲルの上にPEGフィブリンゲルをキャストし、培地を加えます。これにより、CSMビーズからコラーゲンマトリックスとPEGフィブリンマトリックスの両方へ、A SCが双方向に同時に遊走する結果を得ることができます。この手順により、単一の幹細胞源がコラーゲンおよびPEGフィブリンの微小環境から異なる分化シグナルを受け取り、多面的に刺激されることで多分化能因子を産生し、前血管構造のネットワークを形成することができます。単一材料の複合体や脱細胞化皮膚代替物などの既存の手法に対する本技術の主な利点は、他の製品では宿主による製品の再血管化に能動的にアプローチしていない点にあります。私たちは、単離したRAD A SEを豚フィブリンマトリックスで培養した際に、血管表現型へと分化する傾向があることに気づいた時に、初めてこの手法を考案しました。この観察により、単一の幹細胞源を、異なるバイオマテリアルで構成されるシステム内で同時に利用できるという考えが生まれました。脂肪由来幹細胞（ASC）の単離および培養、キトサンマイクロスフェア（CSM）の調製、およびCSMへのASCの封入を行った後、コハク酸グルタレート修飾PEGを4 mLのトリス緩衝生理食塩水に溶解させ、ポリエチレングリコール・フィブリンハイドロゲルを調製します。実験の直前に、0.22 µmフィルターを用いて溶液を滅菌してください。6ウェルプレートの培養ウェルに、500 µLのフィブリノゲンストック液と250 µLのPEGストック液を混ぜ合わせ、37 °Cの5% CO₂加湿インキュベーターで20分間インキュベートする。次に、あらかじめ調製したA-S-C-C-S-M 250 µLをペグ化フィブリノゲン溶液に混ぜ、直ちにトロンビンストック溶液1 mLを添加し、ピペットを用いて迅速に1〜2回トリチュレーション（吸い上げと吐き出し）を行う。その後、細胞ゲル混合液を直ちに12ウェルプレートに移し、37 °Cの5% CO₂加湿チャンバー内で10分間インキュベートする。続いて、得られたPEGフィブリンをHBSSで2回洗浄し、10% FBSを添加したα-MEMを用い、37 °Cの5% CO₂加湿インキュベーター内で11日間にわたり標準的な光学顕微鏡観察を行いながらインキュベートする。CSMからゲルミックス内への細胞の遊走を観察します。A-S-C-C-S-Mには、2Nの水酸化ナトリウムを用いてラット尾腱から抽出したI型コラーゲンを使用します。pHを6.8に調整し、フィブリル化させます。フィブリル化したコラーゲンとA-S-C-C-S-Mの混合液を12ウェルプレートに加え、5% CO₂加湿インキュベーターにて37 °Cで30分間インキュベートします。フィブリル形成が完了したことを確認した後、コラーゲンA-S-C-C-S-Mゲルを37 °C、5% 二酸化炭素加湿インキュベーター内で最大11日間インキュベートします。標準的な顕微鏡観察法を用いて、11日間にわたりCSMからゲルへの細胞の遊走を観察し、2つのバイオスキャフォールドを用いて、単一の幹細胞源の遊走および共誘導特性を研究するための二層構造体を構築します。コラーゲンおよびPEGフィブリンゲルの両方を、以下のわずかな変更を加えて準備します。まず、7.5 mg/mLのコラーゲンを1 mL調製します。次に、混合物を6ウェル組織培養インサートに移し、37 °Cで30分間インキュベートします。完全に線維化させた後、コラーゲンの表面に、培養培地で希釈した5 mgのASCCSM 200 µLを重層させます。マイクロスフィアがゲルの上に沈降した後、250 µLの細胞培養液を用いてPEGフィブリンゲルを調製します。次に、ペグ化フィブリノゲン・トロンビン溶液をA-S-C-C-S-Mコラーゲン層の上に重ねます。完了後、構築物を5%二酸化炭素加湿インキュベーター内で30分間インキュベートし、完全に定着させます。最後に、上部チャンバーのコンストラクト上に1 mLの培地を、下部チャンバーに3 mLの培地を加えます。このスキャフォールド内に埋め込まれたSCの特性評価により、CSMをロードしたSCは、コラーゲン層とPEGフィブリン層の間に挟み込まれることができ、両方の細胞外環境から同時に、かつ異なるキューを受け取って、新しい条件下で生存できることが明らかになりました。ここで示されているように、コラーゲンはASCsが幹細胞として維持される能力を支持しており、それは緑色で示されたstro-1の発現および線維芽細胞様の形態によって実証されています。対照的に、PEGフィブリンはASCを無血管表現型へと分化させました。これは、ここに示されている管状の形態（ルーメンを伴う）や、赤色で示されている内皮細胞特異的なvon Willebrand因子（von Willow brandand factor）の発現によって証明されています。さらに、ここで示されているように、これらの観察された表現型は培養の早期に現れ、11日間にわたって維持されました。このビデオを視聴することで、ラット脂肪由来幹細胞の分離方法、キトサンマイクロスフィアへの負荷方法、およびFDA承認済みのバイオマテリアルを用いた二層ハイドロゲルへの組み込み方法について十分な理解が得られるはずです。本プロトコルで使用されるバイオマテリアルおよび細胞は動物およびヒト由来であり、宿主由来の病原体に汚染されている場合は極めて危険であることに留意してください。したがって、これらの手順を実施する際は、個人用保護具の着用や無菌的な細胞培養操作などの予防策を常に講じる必要があります。

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Bioengineering

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