ASCの分化を制御するための二層ゲルをエンジニアリング
2012年5月25日
このプロトコルは、その周囲の細胞外マトリックスからヒントを得るために、複数の表現型に分化するよう誘導される幹細胞の固有の能力を活用に焦点を当てています。このメソッドの原稿は、同時に脂肪由来幹細胞を共区別するために、PEG-フィブリンおよびコラーゲンから成る二層ハイドロゲルを利用したモデルでは、我々の説明とその特性を拡張する 1。
この手順の全体的な目標は、創傷治癒を助けるために幹細胞を送達および分化するために使用できる天然の生体材料から作られた複合マトリックスを作成することです。これは、まず試験動物から脂肪由来幹細胞またはSCを単離することによって達成されます。次に、A SCを既製のキトサン微小球にロードします。
次に、FIBRILLIZEDコラーゲンゲルをキャストし、コラーゲンゲルの上にA-S-C-C-S-Mビーズを重ねます。最後に、PEGフィブリンゲルをA-S-C-C-S-Mコラーゲンゲルにキャストし、培地を添加します。最終的には、CSMビーズからコラーゲンおよびPEGフィブリンマトリックスの両方へのA SCの双方向同時移動を示す結果を得ることができます。
この手順により、1つの幹細胞源がコラーゲンおよびPEGフィブリン微小環境から異なる手がかりを取得し、異なる刺激を受けて多面的因子を産生し、血管前構造のネットワークを形成することができます。この手法の主な利点は、単一材料複合材料や脱細胞化皮膚代替品などの既存の方法よりも優れているため、これらの他の製品は、宿主による製品の血行再建に積極的に対処しないことです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、単離されたRAD A SEがブタのフィブリンマトリックスで培養すると血管表現型に分化する傾向があることに気付いたときでした。
この観察結果から、単一の幹細胞源を、他の異なる生体材料で構成されるシステムで同時に利用できるという考えが生まれました。脂肪由来幹細胞またはASCを単離および培養した後、キトサンマイクロスフェアまたはCSMを調製し、ASCをCSMにロードし、ポリエチレングリコール、フィブリンヒドロゲルを調製し、4ミリリットルのトリス緩衝生理食塩水にサクシニルグルトディレート修飾ペグを溶解します。実験の直前に、0.22ミクロンのフィルターを使用して溶液を滅菌します。
6ウェルプレートミックスの培養井で、500マイクロリットルのフィブリノーゲンストックと250マイクロリットルのPEGストックを、摂氏37度の5%二酸化炭素加湿インキュベーターで20分間インキュベートします。次に、予め調製したA-S-C-C-C-S-Mの250マイクロリットルをペグ化フィブリノーゲン溶液と混合し、直ちにトロンビンストック溶液1ミリリットルを加え、ピペットを使用して素早くトライレートを1回または2回、直ちに細胞ゲル混合物を12ウェルプレートに入れ、37°Cの5%二酸化炭素加湿チャンバーで10分間インキュベートする。次に、得られたペグフィブリンをHBSSで2回洗浄し、標準的な光学顕微鏡技術を用いて、摂氏37度の5%二酸化炭素加湿インキュベーターで10%FBSを添加したアルファ最小必須培地と11日間にわたってインキュベートします。
CSMからゲルミックスA-S-C-C-C-S-Mへの細胞の移動を観察し、2つの正常水酸化ナトリウムを使用してラット尾腱から抽出した1型コラーゲンを含む。pHを6.8に調整し、フィブリル化します。フィブリル化コラーゲンA-S-C-C-S-M混合物を12ウェルプレートに加え、5%二酸化炭素加湿インキュベーターで摂氏37度で30分間インキュベー
トします。細動が完了したことを確認した後、コラーゲンA-S-C-C-S-Mゲルを5%二酸化炭素加湿インキュベーターで摂氏37度で最大11日間インキュベートします。標準的な顕微鏡技術を使用して、CSMからゲルへの細胞の移動を11日間観察し、幹細胞の単一供給源の遊走特性と共誘導特性を研究するための二重層構造を開発します。2つのバイオスキャフォールドを使用。
コラーゲンゲルとPEGフィブリンゲルの両方を以下のわずかな変更を加えて調製し、コラーゲン1ミリリットルあたり7.5ミリグラムの1ミリリットルを調製します。次に、混合物を6ウェル組織培養インサートに移し、摂氏37度で30分間インキュベートします。完全な細動化後、コラーゲン表面に5ミリグラムのA-S-C-C-S-Mを200マイクロリットルの培養液で覆います。
マイクロスフェアがゲル上に沈殿した後、250マイクロリットルの細胞培養培地を使用してPEGフィブリンゲルを調製します。次に、ペグ化フィブリノーゲントロンビン溶液をA-S-C-C-S-Mコラーゲン層に重ねます。完了したら、5%二酸化炭素加湿インキュベーターでコンストラクトを30分間インキュベートして、完全な化を達成します。
最後に、1ミリリットルの培地をコンストラクトの上の上部チャンバーに置き、3ミリリットルの培地を下チャンバーに置きます。この足場に埋め込まれたSCの特性評価により、SCを充填したCSMは、コラーゲンとペグフィブリンの層の間に同時に挟まれ、両方の細胞外環境から異なる形で手がかりを得て、新しい条件下で繁栄することが明らかになりました。ここに示されているように、コラーゲンは、ASCが幹細胞を保持する能力をサポートしており、緑色でstro oneが発現していることや、線維芽細胞のような形態が示しています。
対照的に、PEGフィブリンは、ここに示されているチューブ状の形態によって示されるように、ASCが無血管表現型に向かって分化するように誘導し、ルーメンとここに赤で示されているフォンウィローブランドの内皮細胞特異的発現を備えています。さらに、ここで示したように、これらの観察された表現型は培養の初期に発生し、11日間にわたって維持されたようです。このビデオを見れば、ラット脂肪由来幹細胞を単離し、それらをキトおよびマイクロスフェアにロードし、FDA承認の生体材料を使用して二層ハイドロゲルに組み込む方法について十分に理解できるはずです。
このプロトコルで利用される生体材料と細胞は動物や人間に由来し、宿主からの病原体で汚染されている場合、非常に危険である可能性があることを忘れないでください。また、これらの手順を実行する際には、個人用保護具や無菌細胞培養技術などの予防措置を常に講じる必要があります。
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概要
このプロトコルは、幹細胞が周囲の細胞外マトリックスから刺激を受け、複数の表現型に分化する能力を活用することに焦点を当てています。全体的な目標は、自然な生体材料で作られた複合マトリックスを作り、それによって幹細胞を届け、分化させ、創傷治癒を助けることです。
主要な研究構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 組織工学
- 創傷治癒
背景
- 脂肪由来の幹細胞（ASC）は、さまざまな細胞タイプに分化する可能性があります。
- 細胞外マトリックスは、幹細胞の挙動を導く重要な役割を果たします。
- 複合マトリックスは、幹細胞の送達と分化を促進する可能性があります。
- 幹細胞の移動を理解することは、効果的な組織再生にとって不可欠です。
研究の目的
- 幹細胞分化のための二層水 gels モデルを開発すること。
- ASCの同時共同分化を調査すること。
- 創傷治癒応用における複合マトリックスの効果を評価すること。
使用された方法
- 実験動物から脂肪由来の幹細胞を分離すること。
- 事前に作られたキトサンマイクロ球にASCをロードすること。
- 繊維状コラーゲンゲルを鋳造し、その上にASCを層状にすること。
- コラーゲンゲルの上にPEGフィブリンゲルを鋳造し、培地を加えること。
主な結果
- マイクロ球からコラーゲンとPEGフィブリンマトリックスの両方へのASCの双方向同時移動。
- 複合マトリックスにおけるASCの効果的な分化の実証。
- 創傷治癒戦略強化の潜在的影響。
- ASCと細胞外マトリックス成分との相互作用の特性化。
結論
- 二層水 gels モデルはASC分化を効果的にサポートします。
- 複合マトリックスは改良された幹細胞療法に利用できます。
- 臨床応用のためにマトリックス組成を最適化するには、さらなる研究が必要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Engineering a bilayered hydrogel to control adipose-derived stem cell (ASC) differentiation addresses a critical challenge in regenerative medicine: enabling precise, simultaneous control of cell fate within complex tissue environments. This approach enhances predictive confidence in tissue engineering by providing a platform for mechanistic de-risking and functional target validation. The method supports portfolio advancement by enabling robust evaluation of biomaterial-cell interactions relevant to wound healing and tissue regeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of ASC differentiation pathways in response to distinct extracellular matrix cues.
- Supports biological de-risking by clarifying how matrix composition influences stem cell fate decisions.
- Facilitates functional target validation for regenerative medicine applications.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible 3D scaffold system for standardized evaluation of stem cell behavior.
- Enables quantitative assessment of cell migration and phenotype via microscopy and immunostaining.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound or biomaterial screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for dermal wound healing and tissue regeneration.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-lineage differentiation in a single construct.
- Reduces translational risk by modeling complex tissue environments in vitro.
Pipeline & Workflow Integration
This bilayer hydrogel method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and translational modeling within a single workflow.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of cell-matrix interactions and differentiation cues.
- Screening: Provides a validated platform for reproducible, quantitative readouts of ASC behavior.
- Analytics: Enables measurement of migration, morphology, and marker expression to compare matrix effects.
- Translational Research: Models wound healing environments for preclinical evaluation of regenerative strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a modular scaffold system adaptable to various tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and tissue regeneration outcomes.
- Operational Value: Standardizes scaffold preparation and cell culture for reproducible results.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for biomaterial and cell therapy development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative medicine candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell isolation, biomaterial handling, and 3D culture techniques.
- Needs access to microscopy and immunostaining infrastructure for quantitative analysis.
- Demands cross-team standardization of scaffold preparation and cell loading protocols.
- Adaptable to different stem cell sources and biomaterial compositions as supported by the protocol.
- Strict aseptic technique and biosafety precautions are necessary due to animal- and human-derived materials.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:54
Preparation and Characterization of Adipose-derived Stem Cells-Chitosan Microspheres Embedded in PRG-fibrin Gels
3:40
Preparation and Characterization of ASC-CSM Embedded in Collagen Gels
4:34
Development of Bilayered PEG-fibrin-(ASC-CSM)-Collagen Gel Constructs
5:54
Representative Differentiation Results
7:02
Conclusion
