ラット腸間膜具象化：血管新生に関与する細胞のダイナミクスを調べるためのモデル

本実験の目的は、既存の血管から新しい血管が成長することと定義される血管新生に関与する、細胞の空間的および時間的なダイナミクスを特定することである。簡便で再現性のあるモデルを用い、まずラットの腸間膜を短時間外に露出させて血管新生を刺激し、刺激後の異なる時点で腸間膜組織を回収する。次に、組織切片の免疫標識を行う。

例えば、血管内皮細胞マーカーを使用して組織内のリモデリング血管全体を可視化し、成長する微小血管ネットワークの不可欠な二次元視覚化イメージを作成します。このモデルは、比較的短期間で複数の血管新生指標が劇的に増加するため、非常に有用です。単一細胞レベルでネットワークを可視化し、これらの指標を多細胞ラベリングと相関させることは、毛細血管の出芽に関与する新しい細胞表現型の特定において極めて有用であることが証明されています。

この手法は、微小血管ネットワークの成長に関与する細胞ダイナミクスに関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。これには、毛細血管の出芽プロセスにおいて、いつ、どこに特定の細胞が存在するかが含まれます。この手法の主な利点は、簡便であり、外科的介入を最小限に抑えられ、比較的短期間で強力な血管新生反応を誘導できることです。

さらに、単一細胞レベルまで無傷のネットワークを観察できる組織である、ラット腸間膜を利用します。私たちの経験では、この手法は習得が非常に容易であり、その結果として研究者間での再現性も高く、本手順でそれを実演します。本日は、当研究室の大学院生であるPeter Staplerが、付属テキストに詳述されている通りに手術の準備を行います。

ラットの腹部を剃毛した後、麻酔をかけたラットを体温維持用のヒーティングパッドの上に仰向けに配置し、腹部を70%イソプロピルアルコールとヨードに浸した滅菌ガーゼで交互に拭いて清浄化します。胸骨から約1インチ下の位置で、皮膚および白線に沿って小さな縦切開を加えます。あらかじめカットしてあるドレープを、開口部を切開部位に合わせるようにして腹部に被せます。切開部位の周囲を軽く圧迫して小腸を露出させます。綿棒を用いて小腸の一部をそっと引き出し、滅菌生理食塩水を入れたプラスチックステージ上に腸間膜を広げて配置し、回腸を確認します。

小腸に栄養を供給している動静脈ペアの間に位置する、薄く半透明な膜である血管化した腸間膜窓を6〜8箇所特定します。摘出の開始時間を記録し、20分のタイマーを設定します。腸に近い脂肪領域にある、中央に位置する2つの腸間膜窓に、滅菌済みの7-0縫合糸で印を付けます。

組織が浸漬され、湿った状態を維持できるよう、滅菌済みの5 mLシリンジを用いてペトリ皿内の生理食塩水を断続的に補充します。体外に露出させていた時間が経過した後、腸間膜を腹腔内に戻します。腹壁の筋肉を5-0モノフィラメント縫合糸を用いて結節縫合で閉鎖します。

その後、4-0モノフィラメント縫合糸を用いて結節縫合で皮膚を閉じ、70%イソプロピルアルコールとヨードを浸した滅菌ガーゼで交互に拭き、ラットの両眼に潤滑剤ジェルを塗布して回復のためにケージに戻します。目的の日に、刺激後のラットを施設ガイドラインに従って麻酔し、安楽死させます。次に腹腔を再度開き、腹部をプラスチックラップで覆います。そして、小腸をそっと引き出し、ピンセットとマイクロ鋏を用いて、あらかじめマークしておいた2つのウィンドウを確認します。

脂肪組織の縁を含めて、外在化した腸間膜ウィンドウをそれぞれ切り出します。ウィンドウの脂肪縁の中にある動静脈対を切断すると、ウィンドウ内に血液が充満する可能性があるため、これを避けるようにしてください。また、腸内容物が流出するため、腸管の切断も最小限に抑えてください。

窓を取り出した直後に、各窓をPBSに浸します。次に、ピンセットを使用して、組織を正電荷顕微鏡スライドに広げます。1枚のスライドにつき2つの組織を固定します。組織が部分的に乾燥した後、メスを用いて余分な脂肪を除去します。

サンプルをフリーザーに入れ、-20°Cで30分間メタノール固定します。スライドを真空乾燥させ、過剰な緩衝液を除去します。また、抗体溶液が組織から不規則に流出するのを防ぐため、ワックスペンで組織の周囲を囲みます。

次に、希釈した一次抗体溶液を約200 µL滴下し、組織全体を覆います。室温で1時間インキュベートし、0.1% saponinを含むPBSで組織を3回洗浄します。続いて、strep adin peroxidase二次抗体溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。3回洗浄した後、サンプルをVector Nova-Redで15分間インキュベートします。

スライドを封入するため、水で洗浄します。95% ethanolに10回浸し、続いて段階的な脱水処理を行います。スライドを乾燥させ、封入剤を薄く塗り広げ、真空乾燥およびマーキング後にカバーガラスを適切な位置に被せて固定します。

スライドを用意します。組織サンプルを希釈した一次抗体溶液で覆います。室温で1時間インキュベートします。

0.1%サポニンを含むPBSで10分間ずつ3回洗浄します。その後、二次抗体を加え、1時間インキュベートします。0.1%サポニンを含むPBSで洗浄を行い、グリセロール入りPBSでスライドを封入し、マニキュアで密封します。

ここでは、一般的なペトリ皿を外科手術台として使用するための改造方法について詳しく説明します。あらかじめ開けておいた穴から腸間膜をスムーズに引き出せるよう、黄色の模型用粘土を用いて滑らかな表面を作製しました。なお、外在化期間中の手術台に示されている腸間膜窓とは、ここでの腸に栄養を供給する動脈と静脈のペアの間にある薄い半透明の膜と定義されます。

PCAM標識により、外部化後の特定の時点において、再構築される微小血管ネットワークの階層に沿ったすべての血管型を特定できます。これらの画像を用いて、刺激後の特定の時点における血管新生の指標を定量化することが可能です。

PCAMラベリングにより、動脈と静脈の判別が可能になります。通常、栄養動脈は、対となる静脈に比べて直径が小さく、内皮細胞の形態が伸長していることに注意してください。リモデリングネットワークの典型的な特徴には、血管化面積、毛細血管の発芽、および血管密度が含まれます。

これらのさまざまな血管新生指標を定量化することで、ネットワーク成長の時間経過を特徴づけることができます。既存の血管からの毛細血管の出芽は3日目から5日目の間にピークに達し、10日目までに非刺激レベルまで戻ります。当研究室では、この一時的な出芽の増加に続いて、血管化領域および血管密度の増加が認められています。

このモデルシステムは、このリモデリングプロセスの特定の時点における新たな細胞表現型の変化を特定するために用いられてきました。免疫蛍光PCAラベルによって内皮細胞が赤色に染色され、クラスIII β-チューブリンラベルによって血管新生血管に沿った神経および寄生虫が緑色に染色されます。興味深いことに、非刺激組織において、クラスIII β-チューブリンの発現は神経特異的です。

対照的に、毛細血管の出芽がピークに達する間、perivascular cells（血管周囲細胞）によってclass three beta tubulinが発現します。このような結果は、血管新生プロセスに関与する新しい細胞タイプを特定する上で、この簡便かつ堅牢な血管新生モデルが有用であることを強調しています。10日目までに、class three beta tubulinの発現パターンは非刺激時の状態に戻り始めます。

このモデルは、細胞系譜研究に利用できる可能性もあります。あらかじめ標識した骨髄細胞または間葉系幹細胞を、20分間の外部露出期間中に腸間膜ウィンドウに灌流させた予備研究により、再構築される腸間膜組織への細胞取り込みの実現可能性が支持されています。このビデオを視聴することで、微小血管ネットワークの増殖に関与する細胞ダイナミクスを調査するための、ラット腸間膜内部化モデルの使用方法を十分に理解できるはずです。

この簡便な手法は、約45分から1時間で実施可能です。外科的手術後の腸間膜は非常に繊細であるため、血管を穿刺しないよう慎重に取り扱うことが極めて重要です。免疫染色を行うことで、血管に沿った複数の細胞型を同定することができます。

また、リンパ管や神経の標識も可能です。これにより、血管新生に関与する細胞の表現型変化だけでなく、血管新生、神経新生、およびリンパ管新生の間の協調関係を調査することができます。