成長曲線とプレートカウントにより、量子ドットや細菌の毒性試験の可溶化とバイオ共役

この手順の全体的な目的は、抗生物質との結合の有無によるナノ粒子の抗菌効果の高スループットスクリーニングを行うことです。ここでは、これを達成するために、ポリミキシンBを結合させたカドミウムテルル量子ドットの抗菌効果を試験します。まず、量子ドットをメルカプトプロピオン酸で可溶化します。

次に、量子ドットをポリミックスに結合させ、抗生物質を添加してプレートに播種した細菌を、抗生物質結合量子ドットと非結合量子ドットの両方で処理します。その後、サンプルの半分に440 nmの青色光を30分間照射し、量子ドットにエキシトン（励起子）および活性酸素種を生成させ、量子ドット処理が細菌の増殖と生存に及ぼす影響を評価します。吸光度を測定し、コロニー数をカウントします。得られたデータから、抗生物質結合テルル化カドミウム量子ドットを適用し、続いて光照射を行うことで、テストした条件の中で最大の殺菌効果が得られることが示されました。

本手法は、テルル化カドミウム量子ドットおよびそのポリリシンBとの接合が大腸菌の増殖に及ぼす影響についての知見を提供できますが、他の種類のナノ粒子や抗生物質を用い、さまざまな細菌株に適用することも可能です。一般的に、本手法に不慣れな方は苦労することがあります。これは、MPAが過剰にあると量子ドットが凝集してしまい、また少量のトルエンであってもピペットで吸い出すとフィルターを損壊させてしまうためです。

本日は、抗生物質を結合させたKE IDE量子ドットの抗菌効果を評価する方法を実演します。同様の手法を、リン酸インジウム、硫酸亜鉛、および硫酸亜鉛化カドミウムなどの他の種類の量子ドットにも適用できます。まず、ガラスバイアル内で15 µMのトルエン溶液としてテルル化カドミウム（CdTe）量子ドットを調製します。吸収分光法を用いて吸光度（OD）を測定し、ピペットでこのストック溶液200 µLをガラスバイアルに移します。

プラスチック製品を使用しないでください。次に、800 µLのトルエン、1 mLの200 mMホウ酸バッファー、および2 µLの11.5 M 2-メルカプトプロピオン酸（MPA）を添加し、バイアルに蓋をして30〜60秒間激しく振とうします。振とう後、水相と有機溶媒相が自然に分離します。

水相が量子ドットの色になります。タイリング層を避けるため、まずそれを取り除き、次に量子ドット相を取り出して清潔なバイアルに移します。可溶化した量子ドットを精製するには、それらを500 µLの遠心フィルターに移します。

50 mM の BORATE 緩衝液を 100 µL 添加し、3,000 ×g で 13 分間遠心分離します。この洗浄操作を 4 回繰り返します。最終洗浄後、洗浄した量子ドットを 500 µL の BORATE 緩衝液に懸濁し、4 °C で保存します。

これらは1〜2週間安定します。量子ドットの濃度を推定するため、吸光スペクトルおよび発光スペクトルを測定します。この図は、UVランプ照射下のCDTE量子ドットと、水溶化前後の発光スペクトルを示しており、リガンド交換による光学特性の変化が無視できる程度であることを示しています。

プロトコルのこの部分は、モス、市販の量子ドット、金属粒子など、あらゆる負に帯電した水溶性ナノ粒子に適用可能です。この例では、抗生物質のポリミキシンB（PMB）を、30:1のモル比で量子ドットに結合させます。PMBは正に帯電しており、結合させる必要なく自己組織化します。試薬として、PMBと水を用いて溶解させます。

濃度は60 µMとします。1ウェルあたり0.3 mLの細菌を使い、4連（quad duplicates）で96ウェルプレートに分注する場合、200 nMのコンジュゲート0.5 mLあれば十分です。これは、50 mMボア緩衝液に溶解した1 µMの量子ドット100 µLをマイクロ遠心チューブに加えることで調製します。

次に、10 x または 60 micromolar の PMB 抗生物質水溶液 50 microliters をコンジュゲートチューブに加えます。コントロールチューブには水 50 microliters を加えます。50 millimolar の ate buffer で全量を 0.5 milliliters に調整します。チューブをアルミニウム箔で遮光し、ローテーターで 1 時間回転させます。

凝集が発生した場合は、より低濃度の抗生物質を用いてコンジュゲーションを繰り返してください。粒子が凝集しなくなるまで、濃度を段階的に上げて調整し、コンジュゲートを洗浄します。溶液を10,000分子量カットオフフィルターに通してろ過します。このフィルターはほとんどの抗生物質に有効ですが、タンパク質や抗体には適していません。

最後に、吸光光度法、蛍光分光法、ゲル電気泳動、またはフーリエ変換赤外分光法を用いて、量子ドット1個あたりの抗生物質分子数を推定します。この図は、PMB抱合前の量子ドットの典型的な吸光および放出スペクトルと、160モル当量のPMB添加後の放出スペクトルを示しています。

正方形で示されるPMB比と量子ドットの発光強度の関係、および三角形で示されるピーク波長位置の関係をここに示します。PMB濃度が高くなるにつれて、QDの発光強度は低下し、その結果、ピーク発光波長にシフトが生じます。プロトコルの次の手順は、接合実験の2日前の夜に、抗生物質の半数最大抑制濃度（IC 50）および量子毒性を決定するために実施します。

E. coliの新鮮なコロニーから、10 millilitersのLB培地に接種します。翌日、実験の1〜2時間前に、透明な96ウェルプレートの各ウェルに成長培地を満たします。アッセイプレートは、ここに示すように配置してください。

サンプルは3連でプレートに播種し、抗生物質の濃度は、細菌をほとんど抑制しない濃度から完全に死滅させる濃度までを十分に含む広範囲に設定してください。接合実験で使用する濃度の量子ドットを含むウェルについても、同様に3連で含める必要があります。マルチチャンネルピペットを使用して、各適切なウェルに1～50 µLの細菌培養液を分注してください。

濃度は、使用する特定の菌株の増殖速度によって異なるため、適宜調整する必要があります。増殖をモニタリングするには、プレートをプレートリーダーにセットし、600 nmで10分ごとに2時間読み取るように設定します。すべての細胞がOD 0.1から0.15に達したら、プレートリーダーからプレートを取り出し、記録を停止します。

次に、量子ドット含有PMBを適切なウェルに添加し、プレートの半分をアルミホイルで遮光します（3連で実施）。その後、2.4 milliwattのLEDで構成された特製の440 nanometerランプの下にプレートを30分間置き、プレートの照射側を露光させます。露光後、プレートをプレートリーダーに設置し、増殖速度に応じて5〜12時間、10分ごとにOD 600を記録します。ソフトウェアを用いて、培養液の乾燥を防ぐため、可能な限り温度を32 degrees Celsius未満に維持してください。

選択した時点における増殖曲線を対数濃度に対してプロットし、画面に表示されているヒル方程式を用いて抗生物質のIC 50を決定します。ここでHはヒル係数です。Y maxは増殖の最高点であり、Y minはゼロ点（これも理想的にはプラトー上にあること）です。記録期間の終了時に、ウェルが透明であれば完全な細胞死を示しており、薬剤濃度の増加に伴って細胞密度の勾配が現れるはずです。

細菌は、ここに示すようなS字型の増殖曲線を示すはずです。最大プラトーの位置は菌株によって大きく異なり、温度にも依存します。代表的な時点を選択し、その値を抗生物質の対数に対してプロットすることでIC 50を算出し、量子ドットを評価することができます。

毒性生存率を量子ドット濃度の対数に対してプロットすることも可能ですが、使用した濃度において量子ドットのみで有意な細菌死を達成することは稀です。量子ドット単独および抗生物質単独の毒性が決定した後、同じプロトコルを適用して抗生物質の毒性を決定することができます。図は接合量子ドットを示しています。

以下にアッセイのレイアウト例を示します。コンジュゲートは濃度を上げて4連（quad duplicate）でテストすることに注意してください。また、細菌のみのコントロールストリップ、薬剤のみのストリップ、および量子ドットのみのサンプルウェルを含める必要があります。その後、OD 600の測定値を用いて増殖曲線を作成し、前述と同様にIC50値を算出します。

この図は、抗生物質単独と同等の毒性を持つコンジュゲートの例と、より高い毒性を持つコンジュゲートの例を示しています。各条件のコロニー形成単位（CFU）を決定するために、処理済みの96ウェルプレートからプレートカウントに使用するウェルを1つまたは複数選択します。選択した各細菌試料を生理食塩水で段階希釈します。

この操作を行うには、適切なカラムに生理食塩水を180 µL分注します。細菌懸濁液を20 µL分取し、180 µLの生理食塩水で希釈します。ピペットチップを交換して混合し、希釈した細菌懸濁液を20 µL分取して180 µLの生理食塩水に加えます。

この工程を6回繰り返します。次に、最後に行なった6つの希釈液からそれぞれ10 µLを分注し、矩形オーガープレートにスポットプレートします。矩形プレートには最大36スポットまでプレートすることが可能です。

プレートをベンチ上で15分間乾燥させます。その後、37°Cで16時間インキュベートします。コロニー数をカウントして、ミリリットルあたりのコロニー形成単位（CFU/mL）を算出します。コロニー数に希釈倍率を掛け、それを塗布した液量で割ることで、細菌の増殖に対する処理の影響を決定します。

E. coliの細胞密度をOD 600で測定しました。ここでは、薬剤濃度を0から完全に細胞死に至るまで変化させた際の、代表的な細菌増殖曲線を示します。白抜き記号はPMBのみを添加したもので、それぞれの濃度を記載しています。

塗りつぶされたシンボルは照射なしのC-D-T-E-P-M-Bを、半分塗りつぶされたシンボルは照射ありのC-D-T-E-P-M-Bを示しています。照射はPMBのみのサンプルには影響しなかったため、視認性を高めるためにこれらの曲線は省略しました。ここでは、光の影響を制御してIC 50値を決定するために、200分時点での増殖曲線値をlog PMBに対してプロットし、この方程式に当てはめた結果を示しています。

抗生物質のみを用い、30分間の光照射を行った曲線を作成しました。この図は、CDTE qdsを用いて、200分後における細菌の生存率をQD濃度に対して示したものです。光照射によるある程度の毒性が認められますが、IC 50値を決定するには不十分な値でした。

これは、結合実験で使用した濃度のCDTE単独の毒性は無視でき、さまざまな処理が細胞増殖に及ぼす影響を比較できることを示しています。200分時点での増殖曲線の値をプロットし、ここに示すように、先に示した式に当てはめました。C-D-T-E-P-M-B結合体は、PMB単独よりも毒性が高いことがわかりました。対照的に、金ナノ粒子A-U-P-M-B結合体は、PMB単独と比較して毒性の増加を示しませんでした。これにより、各処理が細菌の生存に及ぼす影響を決定しました。

P-M-B-Q-D-P-M-B、またはQD単独で処理し、放射線照射（30分間）の有無にかかわらず、96ウェルプレートに播種したE. coliのコロニー形成能ユニット数を決定した。その後、32 °Cで4時間インキュベートした。各細菌サンプルの連続希釈を生理食塩水で行い、100倍から10⁷倍までの希釈液を10 µLずつアガープレートに播種した。プレートを37 °Cでインキュベートし、16時間後にコロニー数を計測した。

この例では、プレートのA列からC列はCDTEの濃度を上げて処理した細菌です。照射なしのコンジュゲート、およびD列からF列は、コンジュゲートの濃度を上げて処理した細菌です。30分間の照射とともに、行に沿って希釈系列が示されています。

データは、照射後のコンジュゲートが、照射していないコンジュゲートと比較して細菌の増殖をより強く抑制することを示しています。Ca試薬は極めて毒性が高いため、本手順の実施中は常に手袋、白衣、ゴーグルなどの保護具を着用し、十分な注意を払ってください。このビデオを視聴することで、抗生物質とのコンジュゲート有無によるナノ粒子の抗菌効果の高スループットスクリーニングの実施方法について、十分に理解できるはずです。