Name: 成長曲線とプレートカウントにより、量子ドットや細菌の毒性試験の可溶化とバイオ共役 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 学ぶCdTe量子ドットの可溶化とポリミキシンBとのバイオ共役による抗菌効果の評価法。光照射による活性酸素種生成と成長曲線測定により、ナノ粒子薬剤の抗菌活性を高スループットでスクリーニングする手法を解説。

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この作品は、NSERC個々の検出プログラム、NSERC / CIHR共同保健研究プログラム（CHRP）と、NSERC CREATEカナダのアストロバイオロジー·トレーニング·プログラム（CATP）によって資金を供給された。

1。 QD可溶化これは、CdTeのために適切な方法です。類似した方法はそのような有するInP / ZnSを20のCdSe / ZnSを21としての量子ドットの他のタイプで使用することができます。 <ol><li> 15μMの（最初の励起子のピーク時には光学密度= 2.5）でトルエン中膜CdTe量子ドットの溶液を調製します。 </li><li>ガラスバイアルには、この株式の200μLを転送します。プラスチックを使用しないでください！ </li><li> 800μLトルエン、200 mMホウ酸緩衝液（pH 9）、11.5 Mメルカプトプロピオン酸（MPA）の2μLの1 mLを加える。 </li><li>バイアルをキャップ30〜60秒間激しく、それを振る。 </li><li>水溶液と有機溶媒相は、自発的に分離されます。水相は、量子ドットの色になります。トルエン層を避けるために、それを削除し、それを破棄します。その後きれいなバイアルに水相を転送します。 </li><li> 500μL、10000、分子量カットオフの遠心フィルターを用いて4回洗浄/フィルタリングすることにより可溶化された量子ドットを浄化する。フィルタがなければなりません13分3000 xgでスピンした。少なくとも最後の2回洗浄するため、所望の最終バッファーで洗浄する。 </li><li>最終洗浄後、4℃で、所望のpHと店舗で50 mMホウ酸緩衝液で洗浄した量子ドットを中断彼らは1〜2週間は安定になります。 </li><li>公開され、式22に基づいて濃度を推定するための吸光度および発光スペクトルを測定します。 </li></ol> 代表的な結果：図1は、UVランプの照明の下で膜CdTe量子ドットの画像を示しており、水可溶化前後の発光スペクトルは、キャップの交換からごくわずかの変化を示す。サイズの値は、電子顕微鏡で測定したコアの直径です。 2。抗生物質にQDコンジュゲートプロトコルのこの部分は、ほとんどの商用量子ドット、金属粒子、さらに19を含む任意の負に帯電した水可溶化ナノ粒子にも適用可能である。 <ol><li>すべての分子が動作するようEITHERの負に帯電した可溶化された量子ドットに自己組み立て、またはそのような第一級アミンとして、結合させることができる反応性基を持っています。この例では、正に荷電共役試薬を必要とせずに自己組み立てされたポリミキシンB（PMB）を使用しています。 60μMでH 2 OでPMBを溶かす。 （選択された抗生物質がH 2 Oに溶解しない場合は、0.1から1 mMの濃度でDMSOまたはエタノールに溶解）。これは、10x溶液（H 2 O）、または100倍溶液（溶媒中）になります。 </li><li>あなたは細菌の毒性実験のために必要になりますどのくらいのQDソリューションを計算します。 4重にウェルあたり0.3 mLを96ウェルプレートの場合は、200 nMの結合体の0.5mLが必要になります。 50mMのホウ酸緩衝液に1μM量子ドットの100μLを含む二つのチューブを準備します。 </li><li>第一級アミンに結合する場合は、1 -エチル-3 - [3 -ジメチルアミノプロピル] H 2 Oのカルボジイミド塩酸塩（EDC）の19 mg / mLの（100 mM）の溶液を調製溶液中でEDCは安定していません、すぐに使用し、残りを捨てる。 </li><li> 10倍の抗生物質溶液（H 2 O）または共役チューブに100倍溶液（溶媒中）の5μLの50μLを追加します。 PMBの場合：30:1のモル比でCdTeの接合、60μMのPMBの50μLを追加します。 H 2 OまたはQDのみ制御管に溶媒を追加します。 </li><li>必要に応じて、コンジュゲートチューブにEDCストック溶液の1μLを追加します。 </li><li>適切な緩衝液（; Trisなどのアミン含有しないバッファを、彼らはEDCを阻害するとして、ホウ酸緩衝液またはPBS）で0.5mLの共役ボリュームを起動します。 </li><li> 1時間nutatorやロッカーの上にアルミニウム箔と場所で光からシールドチューブ。凝集が発生した場合は、抗生物質の低濃度との結合を繰り返します。粒子が凝集しないまで濃度を上に滴定する。 </li><li>適切なフィルタを通過させることによって複合体を洗浄します。万の分子量カットオフは、ほとんどの抗生物質ではなく、タンパク質または抗体で動作します。 </li&gt; <li>吸光度または蛍光分光法、ゲル電気泳動、またはフーリエ変換赤外分光（FTIR）：分子に応じて、異なる方法がQD当たりの抗生物質の分子数を推定するために使用することができます。 </li></ol> 代表的な結果は、この例では、PMBの接合は、量子ドットの発光スペクトルの変化によって特徴付けられる。 図2は、PMB添加したCdTe量子ドットのスペクトルを示す。 3。 96ウェルスクリーンのために細菌の準備、抗生物質のIC 50の決定これは、適切な媒体18で成長し、ほとんどすべての菌株に適用可能である。録音を続行する必要がある時間の正確な長さは細菌の成長率に依存します。この例では、溶原性培養液（LB）培地中で培養した大腸菌を使用しています 。 <ol><li>適切なQD共役濃度を選択するためには、知っておくことが大切です抗生物質のIC 50単独で量子ドットは有毒である場合、結合させることとします。これは2日接合実験前に開始する必要があります。夕方に、新鮮なコロニーからシード細菌の増殖培地10mLを、適切な滅菌とバイオ技術を使用します。 </li><li>次の日、1〜2時間の実験の前に、増殖培地のほぼ最大量との明確な底96ウェルプレートのウェルの各々を記入してください。細菌培養の1から50μL（濃度が特定の株の成長にどのくらいの速に依存するであろうとあなたのラボで校正する必要があります）で各ウェルにマルチチャンネルピペット、シードを使用します。 </li><li>プレートリーダーの上にプレートを入れて決定される波長（通常は600 nm）で2時間10分ごとに読み込みするように設定します。細菌があまりにも速く密度が高すぎる成長しないように板を監視します。 </li><li>細胞はすべてOD = 0.1から0.15に達すると、プレートリーダーからプレートを削除して、録音を停止します。 </li><li>一人で薬を追加して、一人で量子少なくとも連で異なる濃度。 &quot;暗い&quot;コントロールと点灯するの半分として、板の片面を使用しています。推奨レイアウトは、 図3に示されている。濃度は1非常に小さな細菌を抑制する濃度、およびそれらのすべてを殺すいずれかが含まれてするのに十分広い範囲に及ぶべきである。 </li><li>アルミ箔でプレートの &quot;暗い&quot;側面を保護する。所望の波長でランプに反対側を公開します。我々は、2.4 mWのLED（ 図4）と30〜60分間照射から作られたカスタム96ウェル、440 nmのランプを使用しています。明確な底を持つ黒のプレートは、迷光から未露光の細菌を保護に役立ちます。空の列も公開と非曝露の側面の間で使用される可能性があります。 </li><li>露光した後、プレートリーダー、記録OD 600が成長率に応じて5から12時間、10分ごとにプレートを置く。温度が&lt;32°C、可能であれば文化の乾燥を避けるために保管してください。 </li><li>成長曲線をプロットします。選択した時点で対ログ[濃度]とヒルの式を用いて抗生物質のIC 50を決定します 。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> Hはヒル係数である、Y maxは、成長（理想的には台地上の）最高点であり、y minは高原にも理想的には、ゼロ点である。それだけでは量子ドットは、使用濃度で細胞に非常に毒性を示すことはほとんどありませんので、値が決定されることはありません。 代表的な結果。記録期間の終了時に、明確な井戸が完了した細胞死を示しますと、細胞密度の勾配は、薬剤の濃度の増加に沿って表示されます。細菌はS字型成長曲線を（ 図5）を示すべきである。最大の高原の場所は緊張する株から大きく異なり、また、温度に依存します。与えられた時点では、することができます代表として選ば ​​れ、値がとログ[抗生物質] IC 50（ 図5 B）を与えるためにプロットされます。 QD毒性を評価するために、生存とログ[QD]もプロットし、それだけでは量子ドットとの有意な殺菌を達成する（ 図5 C）はまれである可能性があります。 4。抗生物質/量子ドットと96ウェルスクリーンのために細菌の調製<ol><li>正しい滅菌とバイオ技術を使用して、適切な富栄養培地に新鮮なコロニーから実験、文化の種10mLの、前日。それは非常に不安定でない限り、QD-抗生物質複合体は、この日に準備する必要があります。 </li><li>実験の前に1-2時間は、増殖培地のほぼ最大量との明確な底96ウェルプレートのウェルの各々を記入してください。細菌培養の1から50μLを各ウェルにマルチチャンネルピペット、シードを使用します。 </li><li>プレートリーダーの上にプレートを入れて、パート3と同じ波長で2時間10分ごとに読み込みするように設定します。</li><li>細胞はすべてOD = 0.1から0.15に達すると、プレートリーダーからプレートを削除して、録音を停止します。 </li><li>少なくとも四重の異なる濃度でQD結合体を追加します。 &quot;暗い&quot;コントロールと点灯するの半分として、板の片面を使用しています。推奨レイアウトは、 図6に示されている。細菌のみのコントロール·ストリップは、 常に文化の場合と同様の問題に含まれるべきである、温度などの成長条件に影響を与えます。単剤のストリップのみとのみQDのも、彼らが制御板は、以前に行わ一致していることを確認するために含まれるべきである。井戸の残りの部分は、適切な統計ができるようにするためにコンジュゲートに専念しています。 </li><li>アルミ箔でプレートの &quot;暗い&quot;側面を保護する。所望の波長でランプに反対側を公開します。 </li><li>露光した後、プレートリーダー、記録OD 600 5月12日時間は10分ごとにプレートを置く。 &lt;32°C、DRを避けるため、可能であれば温度を保つ文化のYingさん。 </li></ol> 代表的な結果 。量子ドットと抗生物質の組み合わせは、単独で抗生物質よりも毒性が低いかもしれません。同様に有毒な、またはより多くの毒性。これは、成長曲線とIC 50の測定値を用いて定量することができます。 図7は、その抗生物質と同等に有毒なだけで、より有毒である複合体の例コンジュゲートの例を示します。 5。平板計数<ol><li>段階希釈し、コロニーカウントに使用する治療を96ウェルプレートの1以上のウェルを選択してください。 </li><li> PBSまたは生理食塩水（0.9％NaCl）を選択した細菌の各サンプルの希釈を行う。菌液20μLを移し、180μlの生理食塩水で希釈、ピペットチップ、ミックスを変更し、180μLの食塩水に希釈した菌液の20μLを転送します。 6回繰り返します。 </li><li>適切な各希釈し、プレートから10μLを取る<html>固体培地プレート。それは物事を並べるが容易になりますように長方形の料理が好まれるものの1サンプルの全8濃度は、10センチメートルラウンドペトリ皿上に播種することができます。 </li><li>それは15分間のベンチに乾かします。その後16時間のために細菌のための適切な温度でインキュベートする。 </li><li>コロニーをカウントし、コロニー形成単位を計算する（CFU）によると（＃コロニーのx希釈倍率）/ボリュームメッキ= CFU / mLである。 </li></ol> 図8は、例CFUプレートを示しています。 6。代表的な結果<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> 図1 CdTeの量子ドット。 （）のCdTe量子ドットのエイトの製剤は、紫外線の杖（365 nm）と点灯。水可溶化前と後の5選択したサイズの（B）の吸光度と発光スペクトル。破線はトルエンのスペクトルで、実線は水である。 files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。QD-PMBコンジュゲートのスペクトルとゲル分析。オレンジ色の発光CdTeの量子ドットは、この例を使用しました。量子ドットの他の種類の影響は、各実験のために評価する必要があります。 （A）一般的な吸光度（灰色線）とPMBの結合とPMB 160モル当量を加えた後の排出量（破線）の前に量子ドットの発光スペクトル（黒線）。 PMBの比とQDの発光強度（四角）とピーク波長の位置（三角形）の間（B）の関係。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> 図3は 、制御成長板のプレートレイアウトを提案した。 PMBとQD濃度の広い範囲が表されます。プレートの半分（青強調表示）が照射されると、同一の半 ​​分は光から保護されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">ここをクリック</a>拡大図を表示します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> 図4均一プレート照射用のカスタム96-LEDランプ、外観を披露します。典型的なハンドヘルドUVランプを使用してもよいが、均一にプレート全体をカバーしています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> 図5。制御成長板の例の結果。 （A）別の薬物濃度の代表的な細菌の増殖曲線は、0から細胞死を完了します。オープンシンボルが与えられた濃度を持つ唯一のPMBであり、固体のシンボルは照射せずに膜CdTe-PMBであり、半充填のシンボルは、照射による膜CdTe-PMBがあります。照射は、PMB-サンプルのみに影響を及ぼさなかった、これらの曲線は、わかりやすくするために省略されていたので。 QD比：すべてPMB-CdTeのコンジュゲートは30:1 PMBがあります。 （B）200分とログ[PMB]で、成長曲線の値のプロットとは、式にフィットします。 （1）。 CONTに光の影響のためにROLは、曲線は、光照射の30分の抗生物質を使用して行われます。 （C）200分対QD濃度で細菌の生存率は、CdTe量子ドットを用いた。いくつかの毒性は、IC 50値を決定するための露光が、あまりにも少しで見られます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> 図6は、。共役テストプレートのレイアウトを提案した。プレートの青色でハイライト表示された半分は光にさらされるべきであり、強調表示が解除されている半分は保護されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> 図7の例共役試験板の結果。 200分での成長曲線の値はPLでしたottedと式に適合します。 （1）。 （A）膜CdTe-PMB複合体は、単独でPMB以上増加した毒性を示しています。 （B）金ナノ粒子のAu-PMB複合体は、単独でPMB上には増加した毒性を示さない。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> 図8 CFUプレートの例。E. 96ウェルプレートに播種し、大腸菌を 30分間照射の有無にかかわらずQD-PMBで処理した。その後4時間32°Cでインキュベートした。各細菌サンプルの連続希釈液を食塩水で作られた、10μLの100 X 10 7 X希釈液を寒天プレート上に播種した。プレートを37℃でインキュベートしたCとコロニーが16時間後に計数した。プレートは、指定されたように行に沿って希釈を示しています。列は、次のとおりです。（）0.06μMPMB + 2 nMの膜CdTe、（B）0.12μMPMB + 4nmの膜CdTe（C）0.2μMPMB + 6.7 nMの膜CdTe、（D） 0.06μMPMB + 2 nMで照射し、（E）0.12μMPMB + 4 nMのCdTeの照射、（F）0.2μMPMB + 6.7 nMのCdTeのイルラのCdTeのdiated。

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利害の衝突が宣言されません。

ナノ粒子は、新しい抗微生物剤の創出に有望なアプローチを表しています。成長曲線分析は、成長を阻害細胞から積極的に増殖する細胞を区別する細菌の細胞密度をモニターする方法です。プレートカウントと組み合わせる場合には、複合体の抗生物質の可能性を徹底的に分析が可能になります。 96ウェルフォーマットは、このような露光量として濃度の比較的高いスループットの変動やその他の条件を可能にし、後者は、量子ドットなどの光活性化剤のために重要である。この基本的なアプローチには多くのバリエーションがnanotoxicologyのための汎用メソッドを作ることが可能です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>緩衝成分＃1ホウ酸塩</td><td>フィッシャー</td><td>ホウ酸-74から1 </td><td></td></tr><tr><td>緩衝成分第2ホウ酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td>四ホウ酸ナトリウムB9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 28から9322 </td><td>利用可能なさまざまなMWCO </td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td>フィッシャー</td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td>ポリミキシンB </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td>細菌のグラムowth培地（LB）コンポーネント第1位</td><td>フィッシャー</td><td> NaClのS271 </td><td></td></tr><tr><td>細菌の増殖培地（LB）コンポーネント第2位</td><td> BD </td><td>トリプトン211705 </td><td></td></tr><tr><td>細菌の増殖培地（LB）コンポーネント第3位</td><td> BD </td><td>酵母エキス211929 </td><td></td></tr><tr><td>露光用ランプ</td><td>カスタム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明底96ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td> 07-200-567 07-200-730または</td><td></td></tr><tr><td>蛍光分光計</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸光度プレートリーダー</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固体メディアのBactoAgar </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿のラウンド</td><td>フィッシャー</td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td>長方形のペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td> 08から757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

成長曲線とプレートカウントにより、量子ドットや細菌の毒性試験の可溶化とバイオ共役

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

量子ドット（QD）は波長の幅広い選択肢によって励起することができる大きさに依存する発光スペクトルを有する蛍光半導体ナノ粒子である。量子ドットは、イメージング、診断、およびそれらの明るい、安定した蛍光1,2 3,4,5による治療のために多くの関心を集めている。量子ドットは、細菌および哺乳類細胞を6に結合するためのバイオ活性分子の様々に結合させることができる。 量子も広く細菌の標的殺害の細胞毒性薬として検討されています。乗算耐性菌株の出現は急速に、特にグラム陰性病原体7の場合には、公衆衛生の危機となっています。ので、特に特定のナノ材料は、Agの既知の抗菌効果で、細菌8にナノ粒子の毒性を調べる試験の何百ものがあります。細菌の研究はスペックだけでなく、半導体ナノ粒子の他のタイプと実行されているially TiO 2の 9,10-11なく、ZnOを12とCuOの13を含む他人。菌株のいくつかの比較は、通常、グラム陽性とグラム陰性菌株を比較すると、これらの研究で行われてきた。粒子や酸化毒性を引き起こす可能性があり、金属イオンの直接の放出によって活性酸素種のphotogeneration（ROS）次のいずれかのこれらの粒子のすべてに、毒性のメカニズムは酸化に起因しています。これらの材料であっても、別の試験の結果が大きく異なります。いくつかの研究ではグラム陽性菌株は伝えグラム陰性10を超えると小文字が区別されます。他のものでは、それは反対側の14です。これらの研究は十分に15件されています。 すべてのナノ粒子の研究では、粒子の組成、サイズ、表面化学、サンプルのエージング/内訳、波長、パワー、光曝露の期間はすべて劇的に結果に影響を与えることができます。加えて、synthesiの副産物と溶媒は、16 17を考慮する必要があります。ハイスループットスクリーニング技術は、効果的な新しいナノメディシンエージェントを開発することができるように必要とされている。 CdTeの量子ドットは、抗微生物効果を単独で18または抗生物質との併用を持っています。以前の研究では、CdTeのために抗生物質の結合はコンジュゲート19からの活性酸素種の減少、生産のために、細菌への毒性を増加させるが、哺乳動物細胞への毒性を減少させることができることを示した。それはカドミウム含有化合物は、ヒトでの使用が承認されることはほとんどありませんが、そのような製剤は、表面や水の殺菌の消毒に使用することができる。 このプロトコルでは、メルカプトプロピオン酸（MPA）とCdTeの量子ドットの可溶化への直接的なアプローチを提供します。量子ドットは1時間以内に使用する準備が整いました。その後、抗菌剤への結合を示しています。 プロトコルの第二部共役および非共役量子ドットを用いた96ウェル細菌の阻害アッセイを示しています。光学密度は、QDのほか、回復期間の直後と同様に評価されるように露光の効果を可能にして、多くの時間にわたって読み込まれます。我々はまた、細菌の生存率を定量化するためのコロニー数を示しています。

このような半導体量子ドット（QD）のようなナノ粒子は、抗微生物や抗がんアプリケーションのために光活性化剤を作成するために使用することができます。このテクニックは、テルル化カドミウム（CdTe）量子ドットを水可溶化抗生物質にそれらを共役、成長曲線とプレートカウントに基づいて、細菌の阻害アッセイを実行する方法を示します。

量子ドット（QD）は、サイズに依存した発光スペクトルを持ち、広範な波長の励起光によって励起可能な蛍光半導体ナノ粒子である。...

本手順の全体的な目的は、抗生物質との結合の有無によるナノ粒子の抗菌効果を高スループットでスクリーニングすることです。ここでは、この目的を達成するために、ポリミキシンBを結合させたテルル化カドミウム量子ドットの抗菌効果を試験します。まず、量子ドットをメルカプトプロピオン酸に溶解させます。次に、量子ドットをポリミキシンBに結合させ、抗生物質をプレートに塗布した細菌を、抗生物質結合量子ドットと非結合量子ドットの両方で処理します。その後、サンプルの半分に440 nmの青色光を30分間照射して量子ドットにエキシトンと活性酸素種を生成させ、量子ドット処理が細菌の増殖と生存に及ぼす影響を評価します。吸光度を測定し、コロニー数をカウントします。得られたデータから、抗生物質結合テルル化カドミウム量子ドットを適用し、続いて照射を行うことで、テストした条件の中で最大の殺菌効果が得られることが示されました。本手法は、カドミウムテルル量子ドットおよびそのpolyx in Bへの接合がE coliの増殖に及ぼす影響について知見を提供できますが、他の種類のナノ粒子や抗生物質をさまざまな細菌株に適用することにも利用可能です。一般的に、本手法に不慣れな者は、MPAが過剰になると量子ドットが凝集し、またtolineを少量でもピペットで出しすぎるとフィルターを破壊してしまうため、操作に苦労することがあります。本日は、抗生物質を結合させたCdI₂量子ドットの抗菌効果を評価する方法について実演しますが、インジウムリン酸塩、硫酸亜鉛、および硫化亜鉛カドミウムなどの他の種類の量子ドットでも同様の方法を用いることができます。まず、ガラスバイアル内で15 µMのトルエン溶液としてカドミウムテルル（CdTe）量子ドットを調製します。吸光分光法を用いて光学密度（OD）を測定し、ピペットを用いてこのストック溶液200 µLをガラスバイアルに移します。プラスチック製器具は使用しないでください。次に、800 µLのトルエン、1 mLの200 mMホウ酸緩衝液、および2 µLの11.5 M 3-メルカプトプロピオン酸（MPA）を加え、バイアルに蓋をして30〜60秒間激しく振盪します。振盪後、水相と有機溶媒相が自然に分離します。水相は量子ドットと同色になります。タイリング層を避けるため、それを除去し、次に量子ドット相を取り出して清潔なバイアルに移します。可溶化した量子ドットを精製するには、それらを500 microliterの遠心フィルターに移します。50 mMのBore 8バッファーを100 µL加え、3000 ×gで13分間遠心分離します。この洗浄工程を4回繰り返します。最終洗浄後、洗浄済みの量子ドットを500 µLのBoreバッファーに懸濁し、4 °Cで保存します。これらは1〜2週間安定に保持されます。量子ドットの濃度を推定するため、吸光および発光スペクトルを測定します。この図は、UVランプ照射下のCdTe量子ドット、および水溶化前後の発光スペクトルを示しており、リガンド交換による光学特性の変化は無視できる程度であることがわかります。プロトコルのこの部分は、モス、市販の量子ドット、金属粒子など、あらゆる負に帯電した水溶性ナノ粒子に適用可能です。本例では、抗生物質のポリミキシンB（PMB）を、モル比30:1で量子ドットに結合させます。PMBは正に帯電しており、結合させる必要なく自己組織化します。試薬としてPMBと水を用い、溶解させます。濃度60 µMで調製します。1ウェルあたり0.3 mLの細菌を含む96ウェルプレートを4連重複で用いる場合、200 nMのコンジュゲート0.5 mLあれば十分です。これは、マイクロ遠心チューブに1 µMの量子ドット100 µLと50 mMのboreバッファーを加えることで調製できます。次に、10xまたは60µMのPMB抗生物質水溶液を50µL、コンジュゲートチューブに加えます。コントロールチューブには水50µLを加えます。50mMのATEバッファーを用いて液量を0.5mLまで調整します。チューブをアルミホイルで遮光し、ローテーターで1時間回転させます。凝集が発生した場合は、より低濃度の抗生物質を用いてコンジュゲーションを繰り返します。粒子が凝集しなくなるまで、濃度を徐々に上げて調整し、コンジュゲートを洗浄します。溶液を10,000分子量カットオフフィルターに通します。このフィルターはほとんどの抗生物質に有効ですが、タンパク質や抗体には使用できません。最後に、吸光光度法、蛍光分光法、ゲル電気泳動、またはフーリエ変換赤外分光法を用いて、量子ドット1個あたりの抗生物質分子数を推定します。この図は、PMB接合前の量子ドットの典型的な吸光および放出スペクトルと、160モル等量のPMB添加後の放出スペクトルを示しています。正方形で示されるPMB比と量子ドットの発光強度の関係、および三角形で示されるピーク波長の位置がここに示されています。PMB濃度が増加するにつれて、QDの発光強度は低下し、その結果、ピーク発光波長がシフトします。プロトコルの次の部分は、結合実験の2日前の夜に、抗生物質の半数最大抑制濃度（IC 50）および量子毒性を決定するために行われます。E. coliの新鮮なコロニーを用いて、10 mLのLB培地に接種します。翌日、実験の1〜2時間前に、透明な96ウェルプレートの各ウェルを充填します。増殖培地を用いたアッセイプレートを、ここに示すように配置してください。サンプルは3連でプレートし、抗生物質の濃度は、細菌の増殖をほとんど抑制しない濃度から、完全に死滅させる濃度までを網羅する十分に広い範囲に設定してください。接合実験で使用する濃度の量子ドットを含むウェルについても、同様に3連で含める必要があります。マルチチャンネルピペットを使用して、各適切なウェルに1〜50 µLの細菌培養液を分注します。濃度は、特定の菌株の増殖速度によって異なるため、それに応じて調整する必要があります。増殖をモニターするために、プレートをプレートリーダーにセットし、600 nmで10分ごとに2時間測定するように設定します。すべての細胞のODが0.1から0.15に達した時点で、プレートリーダーからプレートを取り出し、記録を停止します。次に、量子ドット含有PMBを適切なウェルに添加し、プレートの半分をアルミホイルで遮光して3連（triplicate）にします。その後、2.4 milliwattのLEDで作られたカスタム440 nanometerランプの下にプレートを30分間置き、プレートの照射側を露光させます。光照射後、プレートをプレートリーダーに入れ、増殖速度に応じて5〜12時間、10分ごとにOD 600を記録します。ソフトウェアを用いて、培養液の乾燥を防ぐため、可能な限り温度を32 degrees Celsius以下に保ってください。選択した時点における増殖曲線を選択した対数濃度に対してプロットし、画面に表示されているヒル方程式を用いて抗生物質のIC 50を決定します。ここでHはヒル係数です。Y maxは増殖の最高点であり、Y minは同様にプラトー上にあることが望ましいゼロ点です。記録期間の終了時に、ウェルが透明であれば完全な細胞死を示しており、薬剤の濃度上昇に伴って細胞密度の勾配が現れているはずです。細菌は、ここに示すようなS字型の増殖曲線を示すはずです。最大プラトーの位置は菌株によって大きく異なり、温度にも依存します。代表的な時点を選択し、その値を抗生物質の対数に対してプロットすることで、量子ドットを評価するためのIC 50を算出できます。毒性生存率を量子ドット濃度の対数に対してプロットすることもできますが、使用した濃度で量子ドット単独により有意な細菌殺菌を達成することは稀です。量子ドット単独および抗生物質単独の毒性が決定されたら、同じプロトコルを適用して抗生物質の毒性を決定できます。結合した量子ドットを示しています。以下はアッセイのレイアウト例です。コンジュゲートは濃度を上げて4連（quad duplicate）でテストすることに注意してください。また、細菌のみのコントロールストリップ、薬剤のみのストリップ、および量子ドットのみのサンプルウェルを含める必要があります。その後、OD 600の測定値を用いて増殖曲線を生成し、以前と同様にIC50値を算出します。この図は、抗生物質単独と同等の毒性を持つコンジュゲートの例と、より高い毒性を持つコンジュゲートの例を示しています。各条件のコロニー形成単位（CFU）を決定するために、プレートカウントに使用する処理済みの96ウェルプレートから1つ以上のウェルを選択します。選択した各細菌サンプルを生理食塩水で段階希釈します。この操作を行うには、適切なカラムに生理食塩水 180 µL を分注します。細菌懸濁液 20 µL を移し、生理食塩水 180 µL で希釈します。ピペットチップを交換して混合し、希釈した細菌懸濁液 20 µL を生理食塩水 180 µL に移します。この工程を6回繰り返します。次に、最後の6段階の希釈液からそれぞれ10 µLを分注し、長方形のオーガープレートにスポットプレートします。長方形プレートには最大36スポットまでプレートすることが可能です。プレートをベンチ上で15分間乾燥させ、その後37°Cで16時間インキュベートします。コロニー数を計測し、ミリリットルあたりのコロニー形成単位（CFU/mL）を算出します。コロニー数に希釈倍率を掛け、それを塗布量で割ることで、細菌の増殖に対する処理の効果を決定します。E. coliの細胞密度をOD 600で測定しました。ここでは、薬剤濃度を0から細胞死に至るまで変化させた際の代表的な細菌増殖曲線を示しています。白抜きの記号はPMBのみを添加したもので、濃度を記載しています。塗りつぶされたシンボルは照射なしのC-D-T-E-P-M-Bであり、半分塗りつぶされたシンボルは照射ありのC-D-T-E-P-M-Bである。照射はPMBのみのサンプルには影響しなかったため、視認性を高めるためにこれらの曲線は省略した。ここでは、光の影響を制御してIC 50値を決定するため、200分時点での増殖曲線の値をlog PMBに対してプロットし、この方程式にフィッティングさせた図を示す。30分間の光照射を伴う、抗菌剤のみを用いた曲線を作成しました。この図は、CDTE qdsを用いた場合の、200分後における細菌の生存率とQD濃度の関係を示しています。光照射によるある程度の毒性が認められますが、IC 50値を決定するには不十分な値でした。これは、接合実験に使用した濃度のCDTE単独における毒性が、異なる処理が細胞増殖に及ぼす影響を比較する上で無視できることを示しています。200分時点での増殖曲線の値をプロットし、ここに示すように前述の方程式に適合させました。C-D-T-E-P-M-B接合体は、PMB単独よりも毒性が高い結果となりました。対照的に、金ナノ粒子A-U-P-M-B接合体は、PMB単独と比較して毒性の増加を示しませんでした。これにより、各処理が細菌の生存に及ぼす影響を決定しました。P-M-B-Q-D-P-M-BまたはQD単独で、放射線照射（30分間）の有無にかかわらず処理した96ウェルプレート内のE. coliについて、コロニー形成単位数を決定しました。その後、32 °Cで4時間インキュベートしました。各細菌サンプルの連続希釈を生理食塩水で行い、100倍から10⁷倍の希釈液10 µLをアガープレートに播種しました。プレートを37 °Cでインキュベートし、16時間後にコロニー数をカウントしました。この例では、プレートのA列からC列はCDTEの濃度を上げて処理した細菌です。照射なしの共役体、およびD列からF列は、共役体の濃度を上げて処理した細菌です。30分間の照射とともに、行に沿って希釈系列が示されています。データは、照射後の複合体が、照射なしの複合体と比較して細菌増殖に対してより高い抑制効果を持つことを示しています。Ca試薬は極めて毒性が強いため、この手順を行う際は、手袋、白衣、ゴーグルの着用などの予防策を必ず講じてください。このビデオを視聴することで、抗生物質への結合の有無によるナノ粒子の抗菌効果の高スループットスクリーニングの実施方法について、十分な理解が得られるはずです。

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