Name: のためのシステム ex vivoで培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶマウス胚膵芽のex vivo培養法。E11.5またはE12.5の胚から背側膵芽を分離し、MacTechディッシュで最大1週間培養します。分化・形態形成・細胞骨格の可視化により、膵臓発生のメカニズム解明に貢献します。

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の研究 スパニョーリラボ。ヘルムホルツ協会、FP7-IRG-2008-ENDOPANC助成とERC-2009-開始HEPATOPANCREATIC助成金によって賄われています。

ここで説明されたプロトコルは、もともとパーシバルとスラック9に記載されており、共焦点顕微鏡検査用に最適化手法から適応されています。 1。グラスボトム培養皿のコーティング次の手順は、層流フード内の無菌条件下で行われるべきである。 <ol><li>膵臓外植片を直径20mmガラス底マイクロウェル（ 例えばマテック株式会社）と35mmのペトリ皿で培養される。片培養当たりと文化の全期間1ガラスボトムディッシュを使用しています。膵芽の解剖と分離前日に、フィブロネクチンでコートガラス底マイクロウェル。 </li><li> 50μg/ mlの最終濃度になるように細胞培養グレードの水で滅菌フィブロネクチンを希釈し、全体のガラスの表面を覆うマテックプレートの20mmのマイクロウェル（ 図1E）にそれ（〜150μL）の最小ボリュームを追加します。皿を置き一晩インキュベーションし、4℃の冷蔵庫インチ</li><li>解剖当日、フィブロネクチンを吸引し、細胞培養グレードの水でウェルを洗浄し、ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）を補充BME（イーグル基礎培地）培地150μlの最低限のボリュームを追加、グルタミン（1％ ）、50μg/ mlのゲンタマイシン[解剖ミディアム]。プレート外植片をする準備ができるまで、層流フードでコーティングされた料理を残す。 </li></ol>すべてではないフィブロネクチンコートディッシュが使用されている場合、それらは4℃で1週間用に保存することができます料理は、乾燥解剖ミディアムを埋めて、冷蔵庫にそれらを配置させてはいけない。 フィブロネクチンに加えて、膵臓の外植片は正常ラミニン9、マトリゲル10,11または微多孔膜12として、様々な基板上に培養されている。なぜなら分岐への影響のため、我々は、基板としてフィブロネクチン9を使用します 。 2。 Dの解剖E11.5からorsal膵原 - E12.5マウス胚<ol><li>胎生（E）は11.5または12.5にtimed妊娠雌マウスを屠殺し、胚は、以前の70％エタノールで洗浄解剖器具を使用して収集されます。 50μg/ mlのゲンタマイシンを補充した氷冷PBSを含む10cmのプレートで子宮切開を置きます。 </li><li>そっとはがし、小さなハサミやデュモン鉗子を使用して、個々の胚セグメントに上記、個別子宮、子宮の筋肉からの照明付き実体顕微鏡下と脱落膜に囲まれている個々の胚を、削除してください。胚を露出させ、卵黄嚢と羊膜を除去するために13個の標準胚の解剖技術を使用しています。その後、胚の上体（肝臓上）とテール領域を削除します。これは、内部器官（ 図1B）の露出をできるようになります。氷のように冷たいBME郭清培地を含む10cmのプレートに胚の中間体を転送します。 </li><li>今可視化し、実体顕微鏡下で背膵原を解剖するために下からのみ透視を使用しています。優しく、鉗子で横切開を行うことによって、胚の半ば身体を開きます。胃と脾臓の位置を確認します。背膵原は、胃の後方領域（ 図1C）に横方向に取り付けられている。デュモンピンセットを用いて、例えば胃、脾臓などの隣接する構造から、背側膵原を離れて解剖したが、（ 図1D）上皮間葉の周りにいくつかを残す。ガラスパスツールピペットを用いて、10％ウシ胎児血清を添加した冷たいBME郭清培地[培地]を含む35mmのペトリ皿に孤立したつぼみを転送します。すべての膵臓が隔離されるまで、これらのステップを繰り返します。異なる遺伝子型の膵臓が分離されている場合は、ヌンク4ウェルプレートを用いて分離し、それらを保つ。 </li></ol> 3。膵臓外植片のめっきと文化ファイナルプラットフォーム外植片のINGは文化の物理的な動きを最小限にするために組織培養室および/または組織培養インキュベーターに近接して行われる。 <ol><li>層流フード内で無菌条件下でBME培地の〜150μlを37℃に予め温め℃でフィブロネクチンコートマテック皿のBME解剖媒体を交換</li><li>慎重に、ガラスパスツールピペットを用いて長期培養用の被覆マテック皿（皿当たり1外植片）に膵臓外植片を移す。培養中に拡散を保証するために、外植片を取り囲む間葉が若干細い針で、必要に応じて、リッピングすることができます。 </li><li>数時間外植片は、ガラス底マイクロウェルにアタッチできるように、静かに、インキュベーター（5％CO 2、37℃）、組織培養において培養を置く。一度、それらが結合している、BME培地2mlの37℃予め温め℃に1.5mlでマテック料理を埋める解剖の日を0日目とも呼ばれます。 </li><li>マン膵臓外植培養のipulationは、層流フード内の無菌条件下で行われる。実験的な要件が異なるタイミングを（化学剤による外植片の例インキュベーション）を指示しない限り、BME培地は、一日おきに変更されます。外植片は最大一週間に5日間、この状態で培養することができる。 </li></ol> 4。膵臓外植片のためのホールマウント蛍光免疫染色プロトコール免疫プロトコルの全ての工程は（イメージングへの固定​​から）プラスチックボトムディッシュよりも優れた画像が得られ、同じマテック皿、中で行われる。固定後、膵臓外植培養は、無菌条件下で維持する必要はありません。 <ol><li> BME培地を吸引除去し、2ミリリットル1X PBSで一回外植片を洗う。 </li><li>植固定に2ミリリットル氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含むPBSを交換し、氷上で20分間皿を置きます。時間からプレートを静かに回し時間が、外植片を切り離す可能性があるので、ロッキングプラットフォームを避ける。 </li><li> PFAを取り外し、室温（RT）で10分ごとに、1×PBS 2mlを植3回洗浄する。 </li><li>室温で少なくとも30分間、2ミリリットルブロッキング溶液（1×PBS +0.1％トリトン-X + 3％ロバ血清）でブロック。 </li><li>ブロッキング溶液中で一次抗体を希釈し、4℃で一晩インキュベーション全体植体表面を覆うマテックプレートの20mmのマイクロウェルに直接希釈の〜150μlを加える℃まで物理的な動きを最小限に抑えるために、直接、寒い部屋（4℃）で外植片に一次抗体を加える。蒸発を防ぐために、抗体を添加する前に、湿潤チャンバーにマテックプレートを配置します。 </li><li>翌日は、抗体溶液を除去し、室温で30分ごとに+0.1％のTween-20（PBT）を2ミリリットル1X PBSで3回洗浄する。 </li><li>ブロッキング溶液中で二次抗体を希釈し、[製造元の推奨に従って、私たちはロバのAlexa Fluor染料の二次抗を使用する1:750希釈で体]、暗所で室温で1〜2時間のインキュベーションのための全体の外植片表面を覆うマテックプレート、20 mmのマイクロウェルに希釈するの〜150μlを直接追加します。核の対比については、二次抗体の希釈と共にヘキストが含まれています。蒸発を防ぐために、抗体を添加する前に、湿潤チャンバーにマテックプレートを配置します。 </li><li>室温で30分ごとに2ミリリットルの1X PBS +0.1％のTween-20（PBT）で3回洗浄する。 </li><li>マウントする前に、Tween-20を除去するために1×PBSで1回洗浄します。マテックプレートの20mmのマイクロウェルに水性封入剤（抗退色付き）1滴を加えることによって、マウントします。優しく、カバーガラスとの外植片をカバーしています。気泡を避けてください。 </li><li>マテックプレート上の外植片は、実験の目的に応じて、標準的な位相差顕微鏡や共焦点顕微鏡下で観察することができます。共焦点顕微鏡分析のために私達はツァイスLSM 700反転設定を使用します。私たちは、フルオロフォアの適切なレーザーを設定エド。画像膵臓外植片の所望の領域を務める目標を選択します。 10Xの水浸対物レンズは、視野内全体外植片を保持するのに適しています。 40X水または油浸目標は高い分解能を持つ膵臓外植片の特定の領域に焦点を当てるのに適している。外植片は、光学的に区分された後、取得したZ-スタックが適切なソフトウェアを使用して、3Dで再構築することができます。 </li></ol> 5。膵臓外植片の生細胞イメージングプロトコル<ol><li>環境室の設定：環境エンクロージャと小さなインキュベーションチャンバーを使用する顕微鏡ステージ上に座っている[温度とCO 2制御で]。胎児の膵臓の適切な培養は37℃、加湿した5％CO 2の制御された雰囲気の安定した温度を必要とします。適当なチャンバーはいくつかのベンダから提供されています （ 例えば 、ツァイス、ニコン、オリンパス）。ヒーターボックスを組み立て、それをオンにイメージングの前にトン少なくとも1時間は、機器のウォームアップと5％CO 2含有量を平衡化することができますを開 ​​始します。 </li><li>膵臓外植培養のタイムラプスイメージングのために、私たちはツァイスLSM 700倒立顕微鏡を使用しています。レーザーと客観の選択についてポイント4.10を参照してください。 </li><li>膵臓外植片は、ライブイメージングを開始する前に、よくガラスボトムディッシュに付着してみましょう。 [私たちは通常、1日目に始まるライブイメージングを行う]。 層流フードでは、最適な栄養条件で開始するために新鮮なBME培地に植培地を吸引し、交換してください。 </li><li>優しく顕微鏡室に外植片を転送し、共焦点顕微鏡の試料ホルダーにインキュベーションチャンバー内にマテック皿を置きます。 </li><li>目的を準備（ 例えば浸対物レンズの選択に応じて油または水培地を追加）し、外植片の関心領域に焦点を当てる。適切に環境室を閉じます。タイムラプス中の蒸発を防ぐために水の代わりに水浸目標と買収は、それが（ 例えばツァイスImmersol W）が市販されている粘性の液浸の液体を使用することをお勧めします。 </li><li>レーザー強度、Zスタック取得パラメータと時間間隔（これもトラブルシューティングのための議論を参照）を設定します。実験を開始します。 </li><li>イメージング、輸出Zスタックおよびすべての時点の後にして、適切なソフトウェア（ 例えば ImageJは、Volocity、Imaris、ホイヘンス）を使用してそれらを分析する。 </li></ol> 6。代表的な結果背側膵芽は（一緒に周囲の間葉付き）E11.5およびE12.5間のマウス胚から解剖し、ガラス底培養皿（ 図1）に直接播種した。血管が上皮を取り巻く間充織に存在し、血管内皮マーカーPECAM 12（データは示さず）に対する免疫染色により可視化することができる。培養の2日後、膵臓外植ウント飛躍的な成長をerwentとその核膵転写因子陽性であった分枝上皮構造、PDX1（ 図2A-C）に自分自身を整理し始めた。文化の3日目の膵外植片の平均Z-厚さは60〜80μmである。外植片の表面とボリュームが適切なソフトウェア（ 例えばホイヘンス）を用いて測定することができます。形態および免疫蛍光分析は、膵臓外植片は 、in vivo早期膵臓分化と形態形成イベント5,10,11,14（ 図2） で再現 、このプロトコルを使用して培養することを示した。培養4日に膵臓外植片は、典型的な&quot;チップとトランク&quot; CPA1を表示上皮8の分離、+トランク内部クラスタとして編成上皮枝（ 図2C）と差別化されたインスリン+およびグルカゴン+細胞の先端の前駆細胞（ 図2Dを受け）。さらに、pancreatiex vivoで培養中のc上皮は基底膜（赤図2E）で頂端F-アクチンの局在（ 図2E、緑）およびb1インテグリンと共に、適切な細胞骨格の組織と細胞極性を示した。 （ 図3）、リアルタイムで分岐膵臓を研究するために、胚性膵臓外植片は、デュアルカラー蛍光レポーターマウス系統membrane-Tomato/membrane-Green 15（マウス系統は、ジャクソン研究所で利用可能ですMT / mg）を単離した。まだ培養で増殖させたMT /ミリガウス膵臓外植片のタイムラプスムービーからフレームは図3に示します。膜構造をMT蛍光タンパク質の局在は、細胞の形態の概要を説明し、時間をかけて細胞のリモデリングおよび移行を追跡できるように、微細な細胞プロセスの解決が可能になります。 12時間タイムラプス実験後mTの蛍光シグナルは、生存可能とし、VIのまま光損傷（ 図3）に起因する可能性が最も高い、その強度が減少しているにもかかわらず、CTableの。光損傷と光毒性を回避または低減するための技術的な解決策が議論のセクションで説明します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> 図1 E12.5マウス胚から背側膵臓芽解剖の模式図。 E12.5マウス胚の（A）の明視野像。胚（肝臓上）と尾部の上体は、中間体（B）を分離するために削除されます。切開は赤の点線で示されている。胃や十二指腸領域の露光（点線のボックスで示されている）の（C）さらに解剖の結果。背膵原（赤点線の丸で囲んだ部分）、胃と脾臓原基の隣の基地である。解剖背側膵臓芽（D）は、BME培地（Eを含有するガラスボトムディッシュのマイクロウェルにパスツールピペットを用いて転送されます、F）。略語：STO（胃）、SP（脾臓）、DP（背膵原）、デュオ（十二指腸）。スケールバー、1000μmの（A、C）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> 図2：膵臓外植培養のホールマウント共焦点免疫蛍光分析。 1日目および ex vivo培養の2日目に膵臓外植片の（A）の明視野像。赤い点線は、上皮の分岐の開始を示します。 （B）はホールマウントの3D再構成は、3日目の膵文化にPDX1に対する免疫染色。膵臓外植培養の48時間で広範な分岐を受けPDX1 +細胞の細管を示した。側底膜マーカーE-カドヘリン（ECAD）、先端の前駆マーカー、カルボキシペプチダーゼ1（CPA1）およびホスホ - ヒストンH3（pHH3）に対する抗体を用いた3日目の膵外植片の（C）はホールマウント免疫染色。活発な細胞分裂pHH3 +細胞のほとんどはCPA1 +細胞による末梢先端に局在。破線リットルINESは、枝の先端を示す。内分泌系統マーカー、インスリン（INS）と3日目にグルカゴン（Gluca）の（D）のホールマウント免疫染色。黄色の矢印は、INS +とGluca +細胞のクラスターを示す。内分泌細胞クラスタのいずれかの高倍率、（D &#39;）をはめ込み。 PDX1、β1インテグリン（β1int）とF-アクチン（ファクト）の3日目膵臓外植片の（E）ホールマウント免疫染色。 PDX1陽性上皮細胞間に散在間葉系細胞（アスタリスク）。 C、D、およびEに示されている画像は、Zシリーズの単焦点光学セクションです。スケールバーは100μmを（A、B）は、50ミクロン（CE）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> 図3 のex vivo培養膵臓外植片の代表的なライブセルイメージング。 MT /ミリガウストランスジェニックマウス胚から膵臓外植片のタイムラプスムービーから（AD）のフレーム。分：撮影時は時間単位で表示されます。外植片は、1日目から始まる画像化した。 Zスタック画像40X油浸対物レンズと15時間の合計ごとに12分を取得した。破線は、上皮と間充織間の分岐と境界の一角を示す。スケールバーは、50μmである。

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特別な利害関係は宣言されません。

膵臓運命が指定されると、膵臓前駆細胞は、最終的に成熟しており、機能的な臓器2,4を形成するために大規模な増殖、分化、形態形成を受ける。現時点では、分岐方法は、膵臓で行われ、それがどのように前駆細胞の増殖と分化に接続されているほとんど知られていない。膵臓外植培養は 、ex vivo 5,9,11、これらのプロセスを解明するための理想的なシステムを表します。早い膵芽の ex vivo での外植片とライブセルイメージングを組み合わせることにより、1は、胚における膵臓の形態形成時に発生するイベントの鮮明な画像を得ることができます。この動画の記事はホールマウント蛍光免疫とライブイメージングに最適ですガラス支持、上胚膵臓の ex vivo培養を確立する単純なアプローチを提示している。 イメージングcに対するex vivoでの膵臓外植片の使用の多数の例エルの形態、増殖と分化がここに提示されています。重要なのは、これらの例は、胚がこのプロトコルを用...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>抗体： カルボキシペプチダーゼ E-カドヘリン F-アクチン グルカゴン インスリン β1-インテグリン PDX1 PDX1 ホスホヒストンH3 </td><td> ABD Serotec社 インビトロジェン 分子プローブ ImmunoStar ミリポア ミリポア アブカム ハイブリドーマ銀行 細胞シグナリング</td><td> 1810-0006 13から1900 - 12373 20076 4011から01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td>基礎培地イーグル（BME） </td><td>シグマ</td><td> B1522-500ML </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>細胞培養グレードの水</td><td> PAA </td><td> S15-012 </tD&gt; <td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>培養皿（ガラス底）、35 mmの</td><td>マテック株式会社</td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>ケミコン</td><td> S30-100ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清ゴールド</td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>インビトロジェン</td><td> 330100から8 </td><td>株式ゾル。細胞培養グレードの水に1 mg / mlの</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15750-037 </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030-024 </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td> 4ウェルMultidishes </td><td>ヌンク</td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡： 倒立共焦点顕微鏡（LSM 700） 実体顕微鏡（ディスカバリーV12） </td><td>ツァイス ツァイス</td><td></td><td>目的： C-アポクロマート0.45 / 10X W M27（work. DIST 1.8ミリメートル;撮像深度〜100ミリメートル）、C-アポクロマート1.2 WコアーM27（work. distの0.28ミリメートル。〜撮像深さ50μm）/ 40X 上から下および光ファイバ照明から透視</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ロート</td><td> 0335.3 </td><td>原液20パーセント</td></tr><tr><td>パスツールピペット（ガラス）、150ミリメートル</td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td>無菌Cに保たonditions </td></tr><tr><td>ペトリ皿、60ミリメートル</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、35ミリメートル</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1×PBS、pH7.4の</td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td>無菌状態に保た</td></tr><tr><td>春はさみ8ミリメートルブレードが湾曲</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15023から10 </td><td></td></tr><tr><td>トリトン-X100 </td><td>ロート</td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td>時計職人のforecepsデュモン5位</td><td>ロート</td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

膵臓は消化酵素の生産と血糖値1の規制を含め、私たちの体の重要な機能を制御します。過去10年間に多くの研究では、膵臓の器官形成を理解するための強固な基盤に貢献してきたが、重要なギャップが早期膵臓形成の2の我々の知識に固執する。これらの初期のイベントの完全な理解は、この臓器の開発への洞察を提供するだけでなく、糖尿病や膵臓癌などの膵臓をターゲット難病、になります。最後に、この情報は、糖尿病との関連で、細胞補充療法を開発するための青写真を生成します。 胚発生時、膵臓はマウス胚における3,4日胚（E）は9.5で、背側と腹側前腸内胚葉の異なる胚の増生に由来する。両方の派生物は、固体として周囲の上皮間葉に裏返しにする完全に成熟した器官2,5,6を生成するために、分岐や分化、増殖を受けるリットルの芽、。最近の証拠は、インスリン産生β細胞を含む膵臓細胞系譜、の成長や分化、分岐膵臓上皮7,8内の適切な組織アーキテクチャ、上皮リモデリングと細胞の位置に依存していることを示唆している。しかし、分枝形態形成方法と発生し、膵臓の増殖と分化との間で調整されているほとんど知られていない。これは、形態形成のイベントは非常に動的でありながら、これらの発達過程に関する現在の知識は、固定された試料の分析にほぼ独占的に依存してきたという事実のために一部になっています。 ここでは、開発膵臓（ 図1）の直接可視化を可能にするガラスボトムディッシュ上でex vivoで解剖し、培養マウス胚膵芽する方法について検討する。このカルトUREシステムは、理想的には、特に、ライブセルイメージング共焦点レーザー走査顕微鏡と、ために考案されています。膵臓外植片だけでなく、野生型マウスの胚から調製しただけでなく、遺伝子組み換えマウス系統（ 例えば、トランスジェニックやノックアウト）から、変異体の表現型のリアルタイムの研究を可能にすることができます。また、このex vivoで培養系は 、増殖、成長、伸長、分岐、細管形成と分化に関する定量的なデータを取得できるように、膵臓の開発に化学化合物の効果を研究するために貴重なものです。結論として、高分解能イメージングを組み合わせるex vivoでの膵臓移植片培養法の開発は、彼らが開発したマウス胚の中で発生した形態形成と分化のイベントを観察するための強力なプラットフォームを提供します。

ここでは、マウス胚性膵臓の分離、培養および操作のための方法を説明します。これは、優れたを表し<em&gt; ex vivoで</em形態形成、分化、成長を含む膵臓開発のさまざまな側面を研究するための&gt;システム。膵原外植片は、数日間培養し、ホールマウント蛍光免疫とライブイメージングなど、さまざまなアプリケーションの範囲で使用することができます。

膵臓は、消化酵素の産生や血糖値の調節を含む、生体の重要な機能を制御しています1。しかしながら、...

この手順の目的は、マウスの胚膵芽を体外（ex vivo）で摘出し培養し、膵臓の発達を直接視覚化することである。まず、胚齢11.5日または12.5日のマウス胚を解剖し、上体部と尾部を除去して胚の中体部を単離する。次に、位置を確認するために十二指腸領域と胃を露出させ、背側膵芽を摘出する。次に、芽をMacTechディッシュのマイクロウェルに移し、最大1週間まで培養します。最後に、外植片をライブセルイメージングで解析するか、あるいは外植片を固定してホールマウント染色を行い、免疫蛍光イメージングで解析します。これにより、最終的に膵細胞の分化、細胞骨格の構築、細胞極性、および分枝形態形成を評価することが可能です。膵臓外植え組織のex vivo培養は、分枝形態形成などの膵臓器官形成における重要な疑問を解決するのに有用です。発達中の膵臓で分枝形態形成がどのように起こり、このイベントが成長および分化とどのように関連しているかを明らかにします。実験の前日に、35 millimeterのMacTechペトリ皿の直径20 millimeterのガラス底マイクロウェルに、ガラス表面全体を覆うように約150 microlitersのフィブロネクチンでコーティングします。その後、ディッシュを4 °Cの冷蔵庫に入れ、一晩インキュベートします。解剖当日に、フィブロネクチンを吸引除去します。マイクロウェルを細胞培養用精製水で洗浄し、各ウェルに最低150 µLの解剖用培地を加えます。解剖を確実に成功させるには、胚の解剖学的構造を十分に理解し、上方からの照明を備えた実体顕微鏡下で背側膵芽の位置を特定できることが不可欠です。デュモンピンセットを使用して、子宮を個々の胚セグメントに分離します。次に、子宮の筋肉を慎重に剥がし、脱落膜に囲まれた個々の胚を取り出します。標準的な胚解剖の手法を用いて胚を露出し、卵黄嚢と羊膜を除去します。続いて、尾部および肝臓より上の胚の上半身を除去します。次に、下からの透過照明のみを用いて、ピンセットで胚の中部を側方から慎重に切開し、内臓を露出させやすくします。胃と脾臓を確認します。背側膵芽は、胃の後方領域に側方で付着しています。デュモン鉗子を用いて、背側膵芽を胃と脾臓から剥離しますが、この図に示す膵芽のように、上皮の周囲にいくらかの間充織を残します。最後に、ガラスパストラーピペットを使用して、単離した芽を冷やした培地を含む35 mmのペトリ皿に移します。培地をあらかじめ温めた後、ファイバーネインコートされたマットテック皿中の解剖用培地を、約150 µLの培地と交換します。滅菌済みラミナーフローフード内において、細胞の接着と伸展を確実にするため、膵臓外胚葉をマットプレートの中心に慎重に配置することが重要です。次に、ガラス製パストゥールピペットを使用して、コーティングしたMat

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。...

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

本書では、マウスの膵臓からプライマリー膵臓腺房細胞を単離し、培養するための迅速かつ便利な手順を説明します。この方法では、新鮮な主要形質転換/ノーマル膵外分泌細胞の生理機能を研究するための貴重なアプローチを構成している。...

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

単離するためのプロトコルは、ヒト胎児膵臓細胞由来培養し、画像膵島細胞クラスター（ICCは）が記載されている。方法は、組織、文化単層として、または凝集体懸濁液中、および増殖のマーカーと膵臓細胞運命決定のための画像からのICCを生成するために必要な手順を詳しく説明します。...

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。...

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

自己再生および成体マウスの膵臓から単離された前駆細胞の分化を検出するためのインビトロコロニーアッセイに考案されています。これらのアッセイでは、膵臓前駆細胞は、メチルセルロースを含む半固形培地中で3次元空間での細胞コロニーを生じます。単一細胞、個々のコロニーの特徴を処理するためのプロトコルが記載されています。...

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

我々は、新生児マウスから無傷の膵島を単離するために、本明細書のプロトコルを記述します。膵臓は、部分的に洗浄し、ハンドピッキング続いて、コラゲナーゼで消化しました。 20から80膵島クラスタは、いくつかの島の研究に適しており、新たに生まれたマウスから膵臓ごとに取得することができます。...

新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids...

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC...

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶマウス胚膵芽のex vivo培養法。E11.5またはE12.5の胚から背側膵芽を分離し、MacTechディッシュで最大1週間培養します。分化・形態形成・細胞骨格の可視化により、膵臓発生のメカニズム解明に貢献します。

のためのシステム

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