妊娠中期のマウス胚の低菱形リップの in vitroエレクトロポレーションで

本手順の全体的な目的は、妊娠初期の段階でエレクトロポレーションによりプラスミドDNAを導入し、胚の後脳前駆細胞における遺伝子発現を操作することです。まず、妊娠11.5日の胚を単離し、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水中で背面を上にして配置します。次に、0.01% fast greenで希釈した発現プラスミドを約50 µL注入します。

注入が成功すると、脳室系全体がDNA fast green混合液で満たされます。次に、胚に電気パルスを加えます。正電極に近い側の胚にプラスミドDNAが取り込まれます。

反対側を内部陰性対照として使用します。最終ステップは、胚を組織培養に少なくとも24時間置くことです。最終的に、電気穿孔された遺伝子は培養24時間後に発現し、免疫組織化学染色によって評価することが可能です。

本手法が既存の方法に比べて優れている点は、胚の後脳前駆細胞の操作をより早い妊娠期間に行えることです。この手法は、異なる神経遺伝子が胚前駆細胞の運命にどのように影響するかといった、この分野における重要な疑問を解明するのに役立ちます。付属の原稿に従い、解剖器具とラミナーフローフードを滅菌して、本手順を開始してください。

胚を回収するために、妊娠11.5日目（E 11.5）のpopsを妊娠した安楽死させた雌マウスを、フード内の解剖トレイの上に置きます。次に、マウスの腹部を70%ethanolでスプレーします。腹腔を開き、壁面を解剖トレイにピンで固定します。

次に、子宮角を引き出し、腹腔内に保持します。ピンセットを用いて、子宮角の壁を慎重に切開します。20 mmのスプーンを用いて、卵黄嚢に包まれた胚を胎盤からそっと取り出します。

その後、胚を100 mmの組織培養ディッシュに移します。ディッシュには、あらかじめ加温した滅菌済みの1×PBSを10 mL満たしておきます。このステップでは、37 °Cにあらかじめ加温した滅菌済みの1×PBSを10 mL満たした新しい100 mmディッシュに、最初の胚を移します。

次に、卵黄嚢を注意深く取り除いて廃棄します。その後、胚の背面が上を向くように配置します。解剖顕微鏡下で、7 mmの電極パドルを用いて胚を静かに固定します。

電極を、後脳の第四脳室のレベルで神経管の両側に1本ずつ配置します。その後、1 ccシリンジを用いて、プラスミドDNAと0.01% Fast screenの混合液を吸い取ります。一般的に、8〜10個の胚をエレクトロポレーションするには、500 µLの混合液で十分です。次に、1 CCシリンジに取り付けた25ゲージ 5/8インチのツベルクリン針で、第四脳室上の屋蓋板をそっと穿刺します。

次に、DNA DI混合液約50 µLを脳室に注入します。注入が成功すると、DNA DI混合液が脳室系全体に充満します。DNA DI混合液を導入する別の方法として、中脳上の透明隔膜を穿刺して脳室系にアクセスし、パルスジェネレーターを起動させ、電極パルスジェネレーターと7 mmの電極パドルを用いて5回の矩形パルスを印加し、正極に最も近い組織に導入する方法があります。

プラスミドを取り出す間、ラミナーフローフード内で、37 °Cに予熱した10%ウシ胎児血清、5%馬血清、1%グルタミン、1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した2 mLのDME MF 12培地を、12ウェル培養皿の各ウェルに満たします。次に、ピンセットで胚の中央部をつまみます。その後、胚の後部を取り除き、前部を培養皿の充填したウェルの1つに入れます。

すべての胚に対してこの手順を繰り返し、12ウェルプレートの外側のウェルのみを満たします。培養物の汚染を防ぐため、エレクトロポレーションしたプラスミドを発現させる目的で、胚を37 °C、5% carbon dioxideのインキュベーター内で24時間培養します。より長期間の培養が必要な場合は、新しい12ウェルプレートのウェルに2 mLのD-M-E-M-F 12培地を満たしてください。

滅菌したスプーンを用いて、胚を新しいプレートのウェルに転移させます。その後、37 °Cのインキュベーターに戻し、分析のために胚を固定させるため、最大48時間培養します。12ウェルプレートに1×PBSを満たし、胚を転移させて4 °Cで5分間洗浄します。

次に、胚を4°Cで2時間、1×PBSで調製した2%パラホルムアルデヒドで固定します。その後、4°Cの1×PBSで5分間、3回洗浄します。さらに、新しい12ウェルプレートに1×PBSで調製した30%スクロースを満たします。

胚をこれらのウェルに移し、4 °Cで一晩平衡化させます。次に、ドライアイスエタノールバスを用いて、胚をOCT（最適切片温度）コンパウンドに包埋するか、-20 °Cで保存します。最後に、クライオスタットを用いて胚を30 micronの厚さに切片化します。

スライドに封入し、-20 °Cで保存します。ここに示した後の研究結果は、培養24時間後の電穿孔されたE 11.5胚の横断切片におけるGFPの免疫組織化学染色の代表的な結果です。ここに示す矢印は、二次抗体がトラップされた屋根板（roof plate）を示しています。

結果から、下側ROIC唇のエレクトロポレーション領域は限定的であり、神経管の前後軸全体には及ばなかったことが分かった。ここでは、分析した2つのタンパク質、MASH1およびmath1の結果を示す。エレクトロポレーションおよび培養後、大多数の胚が対照群の胚（11.5日齢）と比較して正常な発現レベルを維持していることが観察された。この手法を習得すれば、適切に実施することで1〜2時間で完了させることができる。

このビデオを視聴することで、マウス胚膜の前駆細胞における遺伝子発現を操作するためのin vitroエレクトロポレーションアッセイの使用方法について、十分に理解できたはずです。