肝微小循環における血流と酸素消費量の可視化と分析：急性肝炎モデルへの応用
2012年8月4日
光学系は、FITC標識赤血球と肝微小循環を可視化するために、レーザーアシストりんと血管中の酸素分圧を測定するために開発されました。このメソッドは、微小血管の構造、直径、血流速度、および酸素分圧を分析することにより、生理学的および病理学的メカニズムを調べるために使用することができます。
蛍光標識赤血球で肝臓の微小循環を可視化し、レーザー支援リン酸化画像で微小血管内の酸素分圧を測定するための光学系が開発されました。この方法は、微小血管構造、直径血流速度、酸素圧を解析することにより、生理学的および病理学的メカニズムを調査するために使用できます。肝臓の微小循環では、血液は門脈ESから中央ESに流れ、2つの間に酸素勾配が生じます。
肝臓の酸素濃度は、酵素の発現と病理の両方に影響を与え、血流分析と酸素測定を行います。研究の重要なトピック。私たちの実験方法は、蛍光標識された赤血球を静脈内投与することです。
酸素分圧測定に蛍光を用いて微小循環を可視化するために、レーザーで励起すると血流中にリンを放出するパラジウムポルフィリンを周囲の酸素濃度に依存する程度に静脈内投与します。このプロセスにより、酸素の定量分析が可能になり、分圧測定、肝臓微小循環測定、門脈と静脈中心酸素分圧がそれぞれ59.8ミリメートルと38.9ミリメートルの水銀柱で示され、酸素濃度の効果的な測定が実証されました。次に、この方法論を肝炎モデルに適用しました。
ポータルESの正弦波と中央のESでは酸素分圧が上昇していることがわかりましたが、ポータルと中央のESの間の圧力差は減少しています。これは、肝細胞壊死による中央静脈領域の酸素消費量の減少が原因である可能性があります。これらの結果から、光学系を用いて肝臓の血行動態や酸素消費量を計測する方法論は、肝臓の微小循環における様々な肝疾患のメカニズムを解明できることを示しています。
酸素勾配は、微小分布に関連する肝疾患の一種である門脈周囲および傍中心領域での酵素の発現に関与する重要なパラメータであるため、血流と酸素消費量を定量化することが重要です。そのメカニズムを明らかにするために、私たちの方法の利点は、非接触で連続的な光学測定により、肝臓の微小循環における血流、芽球血管の直径、酸素勾配を定量化できることです。ドナーマウスから全血を採取し、赤血球をPBSで400Gの遠心分離により5分間2回洗浄した。
次に、2ミリグラムのFITCを1ミリリットル、100ミリモルのDIリン酸水素ナトリウムに溶解してから、0.2ミクロンの細孔膜でろ過します。次に、1ミリリットルのFITC溶液を試験管に入れ、0.15ミリリットルの3ミリモルの器用な溶液、0.25ミリリットルの180ミリモルのDIリン酸水素ナトリウム、および1.5ミリリットルの100ミリモルのDIリン酸水素ナトリウムと一緒に入れ、タップして混合します。室温で保ち、2時間してから、染色したRBCをPBSで2回洗浄します。
次に、スライドガラス上に少量のRBC懸濁液を載せ、正常なRBCの外観と十分な蛍光性の両方を確認する 0.9ミリリットルのPBS中に0.1ミリリットルのRBCを懸濁し、摂氏4度に保つ 次に、500ミリグラムのBSAを10ミリリットルのPBSに溶解する。その後、パラジウムポルフィリンの30ミリグラムを追加し、一晩遠心分離機、任意の未解決パラジウムポルフィリンを除去するための溶液を攪拌し、試験管に濾液の0.2ミクロンのpo膜雄弁、濾液の1ミリリットルを介してSUPナチンをろ過し、摂氏マイナス20°Cで保存します。凍結と解凍を繰り返さないように注意してください。
微小循環を顕微鏡で可視化するには、プラスチック板に直径20mmの穴を開け、その穴を一辺30mmの正方形のカバーガラスで覆います。尾静脈をカニューレした後、腹臥位でプラスチックプレートに主肝葉を広げます。次に、3 mm x 8 mm のプラスチック フード ラップを複数使用して、肺葉の周囲を覆い、呼吸や乾燥による動きを防ぎます。
透過型顕微鏡で肝循環を可視化し、視野内で少なくとも15分間血流がうっ滞していないことを確認します。血流を徐々に注入して観察します。蛍光標識されたRBCの2ミリリットルをポイントします。
酸素分圧を測定するには、0.2ミリリットルのパラジウムポルフィリン溶液を注入します。FITCで標識された赤血球は、視覚化された領域で循環しているすべての赤血球の50分の1を占め、450〜490ナノメートルのバンドパスフィルターを通過した水銀ランプを照射してFITCを励起し、CCDカメラで蛍光を記録します。パラジウムポルフィリンのリン光は比較的弱く、高感度の検出器と暗い部屋が必要です。
パラジウムポルフィリンの吸収ピークは約410ナノメートルと532ナノメートルで、第2高調波波長は532ナノメートルが推奨されます。この波長は、ネオジムYAGパルスレーザーによって生成され、レーザービームを倒立顕微鏡に接続し、ビームが焦点面の中心を照らすように調整されます。レーザーの空間分解能はスポットサイズに依存し、ビームをピンホールに通すことで調整できます。
ロングパスフィルターと光電子増倍管も顕微鏡に取り付けて、燐光を検出します。PMTは、赤色の波長、特に約700ナノメートルに敏感である必要があります。燐光信号をサンプリングし、指数関数を適用して減衰時定数を計算します。
この実験では、200キロヘルツで500ポイントをサンプリングしました。校正するには、酸素分圧が150で、水銀柱が0ミリメートルの2つのパラジウムポルフィリン溶液を調製します。水銀溶液が0ミリメートルの場合、サンプルに1%のジヒナトリウムを加えて、キャリブレーション中に酸素が存在しない状態を作り出します。
サンプルのpHを7.4、温度を摂氏37度に保ちます。マウスを顕微鏡ステージに配置し、肝臓の微小循環を視覚化する微小血管をレーザースポット高速マウスのポイントに調整します 一晩中水に自由にアクセスできる、注射から24時間後にアセトアミノフェンをキログラムあたり200ミリグラムで腹腔内に注射し、マウスに麻酔をかけ、中央切開で肝臓を露出させます。肝炎がある場合、それは傍中心領域の壊死を通じて肉眼で簡単に見えます。
マウスの部分酸素圧と肝臓微小血管の測定では、ポータルes、洞性土壌、および中央veesの平均酸素圧は、それぞれ59.8、48.2、および38.9ミリメートルの水銀柱を示しました。言い換えれば、門脈から中央ESへの酸素勾配は、RBCが正弦波を通過するときにRBCから酸素が十分に放出されることを示しています。肝臓の微小血管を測定するために、アセトアミノフェン誘導肝炎マウスを作製しました。
病理モデルの例として、門脈V型、正弦波、および中枢型Esの酸素分圧が、正常なマウスと比較してアセトアミノフェン群で高いことがわかりました。門脈と中央V字体との間の酸素分圧差は、正常マウスで20.9mm水銀、肝炎モデルマウスで16.9mm水銀であった。門脈と中央V字体との間の酸素分圧差は、正常マウスで20.9mm水銀、肝炎モデルマウスで16.9mm水銀であった。
肝臓の微小循環における酸素勾配は、主に肝細胞によって消費される門脈からの酸素の供給によって発生し、アセトアミノフェンによって引き起こされる中央静脈領域の肝細胞壊死は、酸素消費量の減少、下流の微小循環、したがって血行動態に関連する問題を引き起こします。酸素供給と酸素消費は、多くの形態の肝疾患に関与しています。急性肝炎モデルを作成し、微小血管内の酸素圧の増加を発見した。
私たちの光学系は、微小血管の構造、むしろ流れの分布や酸素消費量を分析することにより、生理学的および病理学的メカニズムを調査するために使用できます。
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概要
蛍光標識された赤血球を使用して肝臓の微小循環を可視化し、レーザー支援リン光測定法を通じて微小血管の酸素分圧を測定するための光学システムが開発されました。この革新的な方法により、微小血管の構造、直径、血流速度、酸素張力を分析することで、生理学的および病理学的メカニズムの調査が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 微小循環
- 酸素測定
背景
- 肝臓の微小循環には門脈から中央静脈への血流が含まれます。
- これら2つの領域の間には酸素勾配が存在します。
- 肝臓の酸素濃度は酵素発現と病理に影響を与えます。
- 血流と酸素レベルの理解は研究にとって重要です。
研究の目的
- 肝臓の微小循環を可視化する。
- 微小血管の酸素分圧を測定する。
- 血流と酸素張力の関係を分析する。
使用された方法
- 蛍光標識された赤血球の静脈内投与。
- 光学システムを使用した微小循環の可視化。
- レーザー支援技術による酸素レベルの測定。
- 微小血管構造と血流速度の分析。
主要な結果
- 肝臓の微小循環の成功した可視化。
- 微小血管の酸素分圧の正確な測定。
- 生理学的および病理学的メカニズムへの洞察。
- 肝臓機能に関する将来の研究のための方法の確立。
結論
- 開発された光学システムは肝臓の微小循環を研究するのに効果的です。
- この方法は肝臓の病理の理解を深めることができます。
- 将来の研究では、このアプローチをさまざまな生理学的調査に利用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This optical method enables direct visualization and quantification of hepatic microcirculation and oxygen gradients, providing mechanistic insights into liver disease pathophysiology. By linking hemodynamic changes to enzyme expression patterns and zonation-specific injury, it supports target validation in hepatotoxicity and metabolic disease models. The approach offers a translational bridge from discovery to preclinical evaluation by revealing early functional alterations in liver microcirculation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating oxygen gradient alterations with zonated enzyme expression and pathology.
- Operational Value: Enables functional target validation through real-time, label-based hemodynamic readouts in disease models.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by identifying early shifts in oxygen consumption that precede structural damage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with quantifiable oxygen and flow parameters for compound screening.
- Reproducibility: Delivers continuous, non-contact measurements that standardize hemodynamic assessments across studies.
- Platform Utility: Generates scalable outputs (vessel diameter, flow velocity, pO2) suitable for high-content analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models acute hepatitis by demonstrating how pericentral necrosis alters oxygen gradients and downstream metabolic signaling.
- Translational Continuity: Connects microvascular dysfunction to enzyme expression shifts, supporting biomarker-aligned pathway analysis.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables early detection of hemodynamic changes that inform go/no-go progression in preclinical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by providing functional hemodynamic data that informs target engagement and pathway modulation studies prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking portal-to-central oxygen gradients to metabolic zonation and enzyme activity.
- Screening: Delivers quantitative outputs (flow velocity, vessel diameter, pO2) that enable compound effect stratification in liver models.
- Analytics: Provides decay-time-based oxygen measurements and flow metrics that facilitate comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects hemodynamic shifts to zonated pathology, supporting biomarker alignment in preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable optical platform for longitudinal monitoring of liver microcirculation across disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly measuring oxygen gradients that drive hepatic zonation and enzyme expression.
- Operational Value: Ensures standardization through non-contact, continuous optical measurement independent of probe loading variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early hemodynamic biomarkers of liver injury before histologic endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by revealing oxygen consumption changes predictive of zonated toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital microscopy, fluorescent labeling, and phosphorescence lifetime imaging.
- Depends on laser systems with specific wavelength excitation (e.g., 532 nm second harmonic) and sensitive red-shifted detection (PMT ~700 nm).
- Necessitates cross-team standardization for consistent calibration using defined pO2 references (0 and 150 mmHg) under controlled pH and temperature.
- Involves adaptation considerations when extending to other microvascular beds due to differences in flow dynamics and oxygen solubility.
- Includes practical limitations such as signal attenuation in deeply embedded vessels and the need for surgical access to hepatic tissue.
