肝微小循環における血流と酸素消費量の可視化と分析：急性肝炎モデルへの応用

蛍光標識赤血球を用いて肝微小循環を可視化し、レーザー誘起リン酸化イメージングを用いて微小血管内の酸素分圧を測定するための光学系が開発されました。この手法により、微小血管の構造、直径、血流速度、および酸素分圧を分析することで、生理学的および病理学的なメカニズムを調査することが可能です。肝微小循環では、血液は門脈 sinusoidal から中心静脈 sinusoidal へと流れ、その二つの間に酸素勾配が形成されます。

肝臓内の酸素濃度は酵素発現と病理の両方に影響を与えるため、血流解析と酸素測定は重要な研究テーマとなっています。本実験手法では、蛍光ラベル化した赤血球を静脈内投与します。

酸素分圧測定のための蛍光を用いた微小循環の可視化を行うため、パラジウムポルフィリンを静脈投与します。これは、レーザーで励起されると、周囲の酸素濃度に依存した強度で血流中で燐光を発します。このプロセスにより酸素の定量分析が可能となり、肝微小循環の酸素分圧を測定したところ、門脈および中心静脈の酸素分圧はそれぞれ 59.8 mmHg および 38.9 mmHg であり、酸素濃度の効果的な測定が実証されました。次に、この手法を肝炎モデルに適用しました。

門脈側および中心静脈側の洞様血管において酸素分圧の上昇が認められた一方で、門脈側と中心静脈側の間の圧力差は減少していました。これは、肝細胞の壊死により中心静脈領域での酸素消費量が減少したためと考えられます。これらの結果は、光学システムを用いて肝血行動態および酸素消費量を測定するという我々の手法が、肝微小循環におけるさまざまな肝疾患のメカニズムを解明できることを示しています。

酸素勾配は、門脈周囲領域および中心静脈周囲領域における酵素の発現や、微小分布に関連するさまざまな肝疾患に関わる重要なパラメータであるため、血流と酸素消費量を定量化することが重要です。そのメカニズムを明らかにする上で、本手法の利点は、非接触かつ連続的な光学測定により、肝微小循環における血流、血管径、および酸素勾配を定量化できることです。ドナーマウスから全血を採取し、赤血球をPBSで2回洗浄し、400 Gで5分間遠心分離しました。

次に、2 mgのFITCを1 mLの100 mM DIリン酸水素ナトリウムに溶解し、0.2 µmの孔径を持つメンブレンでろ過します。次に、1 mLのFITC溶液を試験管に入れ、そこに0.15 mLの3 mMデキストラン溶液、0.25 mLの180 mM DIリン酸水素ナトリウム、および1.5 mLの100 mM DIリン酸水素ナトリウムを加え、軽く叩いて混ぜ合わせます。これを室温で2時間保持した後、染色したRBCをPBSで2回洗浄します。

次に、少量のRBC懸濁液をガラススライド上に滴下し、正常なRBCの外観と十分な蛍光を確認します。0.1 milliliterのRBCを0.9 milliliterのPBSに懸濁させ、使用時まで4 °Cで保存します。次に、500 milligramsのBSAを10 millilitersのPBSに溶解させます。その後、30 milligramsのパラジウムポルフィリンを加え、一晩撹拌します。溶液を遠心分離して未溶解のパラジウムポルフィリンを取り除き、上清を0.2 micronのPOメンブレンでろ過します。ろ液を1 milliliterずつ試験管に分注し、-20 °Cで保存します。その際、凍結融解の繰り返しを避けるように注意してください。

微小循環を顕微鏡で観察するために、プラスチックプレートに直径20 millimeterの穴を開け、その穴を1辺30 millimeterの正方形カバーガラスで覆います。尾静脈をカニューレした後、肝臓の主葉をプラスチックプレート上に腹臥位で広げます。次に、3 millimeter × 8 millimeterのプラスチック製食品ラップを複数枚使用して、呼吸による動きや乾燥を防ぐため、肝葉の周囲を覆います。

透過顕微鏡を用いて肝血流を可視化し、視野内で少なくとも15分間、血流の停滞がないことを確認します。血流を観察するために、蛍光標識したRBCsを0.2 mL緩徐に注入します。

酸素分圧を測定するには、0.2 millilitersのパラジウムポルフィリン溶液を注入します。FITC標識赤血球は、可視領域で循環している全赤血球の50分の1となるようにします。450 to 490 nanometerのバンドパスフィルターを通過させた水銀ランプで照射してFITCを励起させ、CCDカメラで蛍光を記録します。パラジウムポルフィリンの燐光は比較的弱いため、高感度検出器と暗室が必要です。

パラジウムポルフィリンの吸収ピークは約410および532ナノメートルであり、532ナノメートルの第2高調波波長が推奨されます。この波長はネオジウムYAGパルスレーザーによって生成されます。レーザービームを倒立顕微鏡に接続し、ビームが焦点面の中央を照射するように調整します。レーザーの空間分解能はスポット径に依存し、これはビームをピンホールに通すことで調整可能です。

また、リン光を検出するために、ロングパスフィルターと光電子増倍管（PMT）を顕微鏡に取り付けます。PMTは、特に700 nm付近の赤色波長に感度を持つものである必要があります。リン光信号をサンプリングし、指数関数を適用して減衰時定数を算出します。

本実験では、200 kHzで500点のサンプリングを行いました。校正のため、酸素分圧がそれぞれ150 mmHgと0 mmHgのパラジウムポルフィリン溶液を2種類調製します。0 mmHgの溶液については、校正中に酸素が存在しない状態にするため、サンプルに1%のジヒドロゲン（dihi sodium）を添加してください。

サンプルのpHを7.4、温度を37 °Cに維持します。マウスを顕微鏡ステージ上に配置し、肝微小循環を可視化したい微小血管をレーザースポットの位置に合わせます。マウスに一晩、水を自由飲用させた後、アセトアミノフェンを200 mg/kgで腹腔内投与します。投与から24時間後、マウスを麻酔し、正中切開により肝臓を露出させます。肝炎がある場合、傍中心領域の壊死を通じて肉眼で容易に確認できます。

マウスの肝微小血管における酸素分圧を測定した結果、門脈、類洞、および中心静脈の平均酸素分圧はそれぞれ 59.8、48.2、38.9 mmHg でした。言い換えれば、門脈から中心静脈にかけての酸素勾配は、赤血球が類洞を通過する際に十分な酸素放出が行われていることを示しています。肝微小血管を測定するため、アセトアミノフェン誘発性肝炎マウスを準備しました。

病理モデルの例として、アセトアミノフェン投与群では、正常マウスと比較して門脈、類洞および中心静脈における酸素分圧が高いことが分かりました。門脈と中心静脈の間の酸素分圧差は、正常マウスで 20.9 mmHg、肝炎モデルマウスで 16.9 mmHg でした。門脈と中心静脈の間の酸素分圧差は、正常マウスで 20.9 mmHg、肝炎モデルマウスで 16.9 mmHg でした。

肝臓の微小循環における酸素勾配は、主に門脈からの酸素供給と肝細胞による酸素消費によって生じます。アセトアミノフェンによって中心静脈領域で肝細胞壊死が起こると、酸素消費量と下流の微小循環が減少し、その結果、血行動態に関連する問題が生じます。酸素供給と酸素消費は、多くの形態の肝疾患に関与しています。私たちは急性肝炎モデルを作製し、微小血管における酸素分圧の上昇を見出しました。

当社の光学システムは、微小血管構造、血流分布、および酸素消費量を分析することで、生理学的および病理学的メカニズムを調査するために使用できます。