Name: 肝微小循環における血流と酸素消費量の可視化と分析：急性肝炎モデルへの応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶ 肝微小循環の可視化と酸素分圧測定法。蛍光標識赤血球とレーザー燐光法を用いて血流速度と酸素勾配を解析し、急性肝炎モデルでの病態生理メカニズムを解明する手法です。

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著者は、技術援助と支援の実験のためにさんりさ大塚に感謝します。この研究は部分的に教育、科学、スポーツ文化省によってサポートされていました、若手研究（B）、2010、22700476、及びKTのためにスズケン記念財団2010年、この研究費補助金は、研究開発によってサポートされていましたリビング物質の次世代統合シミュレーション、文部科学省次世代スーパーコンピュータ·プロジェクトの開発と利用の一部であり、JST ERATO末松ガス生物学プロジェクトによって一部インチ

1。フルオレセインイソチオシアネート異性体I（FITC）で標識赤血球我々が使用するすべての実験的なプロトコルは、慶應義塾大学医学部の動物ケア委員会によって承認された。 <ol><li>ドナーマウスを麻酔し、行った後、腹腔切開術は、ヘパリンの少量を含む1mlのシリンジで下大静脈から全血を取り消すことができます。マウスはすぐにペントバルビタールナトリウム注射（100 mg / kgのIP）によって安楽死させた。 </li><li>スイングバケットローターで400 グラムで5分間遠心分離によってPBS（pH7.4）で二回全血を洗う。 </li><li>の100mM Na 2 HPO 4、5 mlのFITCの10mgを溶解し、0.22μmの細孔を有する膜でそれをフィルタリングします。 </li><li>試験管に180 mMの0.25ミリリットルのNaH 2 PO 4、及び100mMのNa 2 HPO 4 1.5 mlの、3 mMのグルコースの0.15ミリリットルとFITC溶液1mlを混ぜます。 Rの0.2ミリリットルを追加します。BCペレットと混合するためのチューブをタップします。 </li><li> 4°Cで2時間チューブを保持し、PBSで2回ステンド赤血球を洗浄する。 </li><li>スライドの芝生の上でRBC懸濁液の少量を入れて、赤血球は健康に見えるかどうか（すなわち、その形状や大きさが正常であること）と蛍光強度が十分であること。 </li><li> pH7.4のPBS 0.9 mlの赤血球の0.1 mlを中断し、4℃で懸濁液を保つ°Cを注入するまで。 </li></ol> 2。酸素感受性色素の調製<ol><li> pH7.4のPBSの10mlのBSA 500 mgを溶解する。 </li><li> BSA溶液にパラジウム（II） - メソ - テトラ（4 - カルボキシフェニル）ポルフィン（PD-TCPP）の30 mgを追加し、一晩攪拌する。 </li><li> （省略可能）フリーのPd-TCPPからそれを分離する重力流クロマトグラフィーまたはスピンカラムを用いてBSAに結合したパラジウムTCPPを抽出します。 </li><li>パラジウムTCPP溶解除去し、0.22μmの細孔を有するメンブランフィルターで上清をフィルタリングするためのソリューションを遠心分離します。 &lt;/ LI&gt; <li> -20℃でチューブ内の店舗1mlのアリコート凍結融解の繰り返しを避けることができます。 </li></ol> 3。動物の準備<ol><li>微小循環の顕微鏡観察用の穴に比べて30 mm角の正方形のカバーガラス孔20の直径mmとし、テープでプラスチック板を準備します。 </li><li>マウスを麻酔し、肌に毛皮を削除し、準備。ヘパリン化PBSで満たされた10cmのポリエチレン（PE 10）カテーテルに接続されている30 G針を使用して、薬剤注入のための無駄な尾部にカテーテルを挿入します。 </li><li>正中切開した後、プラスチックプレート上に肝臓の主な小葉を拡張し、伏臥でマウスを置きます。 </li><li>呼吸と肝臓の移動と乾燥からそれを維持抑制するために肝葉の縁の周りにキッチンラップ（3ミリメートル×8 mm）とタイル一緒に小さなスリップを準備します。 </li><li>顕微鏡下での肝微小循環を（透過光で）観察すると、bていることを確認lood·フローは、少なくとも15分間の視野内にうっ滞がありません。 </li><li>徐々に血流の観察またはpO 2は測定用のPd-TCPP溶液0.2mlのために蛍光標識した赤血球の0.2ミリリットルを注入します。 FITC標識赤血球のこの量は、可視化領域内の循環内のすべての赤血球の1/50を占めることになる。 </li></ol> 4。血液の流れの可視化<ol><li>バンドパスフィルタ（450から490 nm）の1を通過した水銀灯の光でそれを照射することにより、FITCを励起する。 </li><li> CCDカメラによる蛍光像を記録します。 </li></ol> 5。はpO 2測定 PD-TCPP燐光は比較的弱く、高感度の検出器で検出する必要があります。すべての実験は暗い部屋で実行する必要があります。 <ol><li>パラジウムTCPPの吸収ピークは410 nmと532 nmであるので、第二高調波の波長532 nmの励起をお勧めします。 YAGパルスレーザー2：この波長はNdによって生成することができます。 </li><li>倒立顕微鏡上の適切なポートにYAGレーザーと、焦点面の中央の位置にビームスポットを調整する：NDからのビームを供給します。空間分解能はピンホールを介してビームを渡すことによって変更されるレーザーのスポットサイズに依存します。 </li><li>燐光を検出するために、顕微鏡の他のポートへのロングパスフィルター（&gt; 620 nm）と光電子増倍管（PMT）を添付してください。 PMTは、特に700 nm付近に、赤の波長に敏感でなければなりません。 </li><li>燐光信号（200 kHzでサンプリングされた500点）をサンプリングし、崩壊の指数関数をフィッティングすることにより、減衰の時定数を計算します。 </li><li>キャリブレーション用のPO 2 150 mmHgで、0 mmHgでのPd-TCPPソリューションのサンプルの2セットを準備します。酸素の有無を生成するためにサンプリングするために亜ジチオン酸ナトリウムの体積の1％を追加します。 7.4でサンプルのpHと温度を保つ校正時37℃トゥーレ。 </li><li>スターン-ボルマー定数k qと無酸素の発光減衰時間式のτ0（1）3を修正します 。 37°Cと7.4のpHでのPd-TCPPソリューションと我々のケースでは、K Qは 374 mmHgで-1 s -1であり、τ0は 0.74ミリ秒です。これらの測定パラメータは、機器（すなわち、レーザー、検出器、その他の光学機器）、および信号処理方法によって異なりますので、キャリブレーションは、各測定システム4で必要とされる。 τ0 /τ= 1 + K Q•τ0•pO 2は （1） </li><li>顕微鏡ステージ上にプレートの上にマウスを設定し、肝微小循環を観察し、レーザスポットの点にターゲット微小血管の位置を調整します。 </li></ol> 6。肝炎モデル<ol><li>一晩水に自由にアクセスの高速マウス。 </li><li>準備するDMSO中のアセトアミノフェンmlの溶液（APAP）あたり20 mgである。 </li><li> 1 ml/100グラム体重（すなわち、200 mg / kg体重）で腹腔内に注入します。注入後、マウスが食料と水5への無料アクセスを与えることができます。 </li><li>注射後24時間は、マウスを麻酔し、正中切開を行うことによって肝臓を公開します。肝炎が達成されている場合は、中心周辺の地域の壊死が肉眼で容易に見えるようになります。 </li></ol> 7。代表的な結果肝微小循環のサンプル画像は、（a）透過光像であり、（b）の蛍光画像である図1に示されています。個々のFITC標識赤血球をビデオムービーで観察され、ポータル静脈、正弦波、中央静脈の血流の方向で認識されます。 図2に示すように、X100の対物レンズを介して中央静脈を照射するレーザスポットはapproximでした直径ately10μmである。肝微小循環における血管内のpO 2は、雄C57BL / 6マウス、および図3（a）で測定したpO 2は 、ポータルと中央静脈の血管径との関係を示しています。正弦波を通過しながら、ポータルからの中央静脈にpO 2は勾配が効率的にその赤血球リリース酸素を示しています。 図3（b）に示すように、平均pO 2は、ポータル船舶、正弦波では48.2 mmHgで、中央静脈で38.9 mmHgで59.8 mmHgであった。 我々はAPAP腹腔内に注入することにより急性肝炎を生成する場合は、血管内のpO 2は有意に肝微小循環の各部分で上昇していた：P正弦波と中心静脈（図3（c））における門脈およびp &lt;0.01 &lt;0.05。 <img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig1.jpg" alt="図1" /> 図1低倍率I魔道士は、（a）透過光および（b）蛍光と肝微小循環を示している。 <img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig2.jpg" alt="図2" /> 図2はpO 2測定の対象となる中心的な静脈を照射するレーザスポットのイメージ。 <img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig3.jpg" alt="図3" /> 健康な対照マウスのアセトアミノフェン誘発肝傷害マウスの肝微小循環の図3。pO 2は勾配。 （1）PO 2対ポータル静脈（PV）と中央静脈（CV）の血管径を示し、（b）は正弦波（S）を介してPVからCVへの酸素勾配を示しています。 PVとCVの間にはpO 2の違いは、肝細胞または他の実質細胞の酸素消費量を反映しています。 （C）APAP投与により誘導される肝炎の状態で、PO 2が大幅にPV、S、およびCVとはpO 2で上昇したことを示しています勾配は、肝酸素消費量が危険にさらされたことを示す、減少した。

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

組織に酸素を提供することは微小循環の重要な役割であり、論文の多くは、微小血管の解剖学とレオロジー6に関連する疾患について説明します。肝血流量は動脈と静脈血の組み合わせです。肝臓への血流の約30％が門脈によって提供された肝動脈と他の70％で提供されるだけでなく酸素化血液は、脾臓、消化管7からの不十分な酸素血静脈流出である。そのような脂肪肝、衝撃、または腫瘍の変化などの肝疾患の肝微小循環の血流。組織の酸素化を決定するためには、微小循環における血流と酸素濃度の両方を測定する必要があります。肝微小循環に、これらの測定を行うための市販の機器の欠如は、それが難しいこの分野での生理学的データを得るために行われています。 動物の準備段階で重要なポイントは、固定です。プラスチック板上での肝臓。肝臓の動きに緩い固定の結果は、顕微鏡観察を妨害すると解析が困難になり呼吸と同期。タイトな固定は、しかし、血流うっ滞を引き起こします。血流の条件は手術手順の実行中に、低消費電力顕微鏡かかわらず、観察されるべきである。ハイパワーレーザーは容易に血管を傷つけ、照射の頻度を最...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>パラジウム（II）メソ - テトラ（4 - カルボキシフェニル）ポルフィン</td><td>フロンティアサイエンティフィック株式会社</td><td> PdT790 </td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート異性体I </td><td>シグマアルドリッチ（株） </td><td> F7250 </td></tr><tr><td>アセトアミノフェン</td><td>シグマアルドリッチ（株） </td><td> A7085 </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>光電子増倍管</td><td>浜松ホトニクス</td><td> H10722-20 </td></tr></tbody></table>

肝微小循環における血流と酸素消費量の可視化と分析：急性肝炎モデルへの応用

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

肝酸素消費量が比較的高いですが、肝臓の血液供給の約70％が胃腸管および脾臓由来の門脈血を酸素化されているため、肝臓の酸素需要と供給の間にかなりの食い違いがあります。酸素は、正弦波を介して中央静脈に門脈終末枝から流れる血液によって肝臓に配信され、これは肝小葉内の酸素勾配になります。酸素勾配は、肝微小循環におけるアップストリームおよびダウンストリームの酵素の発現を伴う重要な物理パラメータであるが、肝微小循環の酸素消費量を測定するための技術の欠如は、肝臓での酸素代謝に関わるメカニズムの解明を遅らせました。そこで我々は肝微小循環を可視化するためにFITC標識赤血球を使用し、そこに血管中の酸素分圧を測定​​するためにレーザーアシストりんを使用していました。 NoncontaCTと連続的な光学的測定は、血流速度、血管径、肝臓での酸素消費量に関連した酸素勾配を定量化することができます。急性肝炎モデルでは、我々は中心周辺のゾーン内の肝細胞壊死が酸素分圧をシフトアップと酵素の発現に影響を​​与える可能性があることを示し、我々はポータルと中央静脈の両方で増加した酸素分圧が正弦波で減少した酸素勾配を観察したマウスにアセトアミノフェンを投与することにより行われ門脈ゾーンインチ結論として、測定の肝血行動態および酸素消費のために私たちの光学的方法では、肝疾患に関連するメカニズムを明らかにすることができます。

光学系は、FITC標識赤血球と肝微小循環を可視化するために、レーザーアシストりんと血管中の酸素分圧を測定​​するために開発されました。このメソッドは、微小血管の構造、直径、血流速度、および酸素分圧を分析することにより、生理学的および病理学的メカニズムを調べるために使用することができます。

肝臓における酸素の供給量と需要量の間にはかなりの乖離があります。これは、肝臓の酸素消費量が比較的高い一方で、その約70%が...

蛍光標識赤血球を用いて肝微小循環を可視化し、レーザー誘起リン酸化イメージングを用いて微小血管内の酸素分圧を測定するための光学系が開発されました。この手法により、微小血管の構造、直径、血流速度、および酸素分圧を分析することで、生理学的および病理学的なメカニズムを調査することが可能です。肝微小循環では、血液は門脈 sinusoidal から中心静脈 sinusoidal へと流れ、その二つの間に酸素勾配が形成されます。肝臓内の酸素濃度は酵素発現と病理の両方に影響を与えるため、血流解析と酸素測定は重要な研究テーマとなっています。本実験手法では、蛍光ラベル化した赤血球を静脈内投与します。酸素分圧測定のための蛍光を用いた微小循環の可視化を行うため、パラジウムポルフィリンを静脈投与します。これは、レーザーで励起されると、周囲の酸素濃度に依存した強度で血流中で燐光を発します。このプロセスにより酸素の定量分析が可能となり、肝微小循環の酸素分圧を測定したところ、門脈および中心静脈の酸素分圧はそれぞれ 59.8 mmHg および 38.9 mmHg であり、酸素濃度の効果的な測定が実証されました。次に、この手法を肝炎モデルに適用しました。門脈側および中心静脈側の洞様血管において酸素分圧の上昇が認められた一方で、門脈側と中心静脈側の間の圧力差は減少していました。これは、肝細胞の壊死により中心静脈領域での酸素消費量が減少したためと考えられます。これらの結果は、光学システムを用いて肝血行動態および酸素消費量を測定するという我々の手法が、肝微小循環におけるさまざまな肝疾患のメカニズムを解明できることを示しています。酸素勾配は、門脈周囲領域および中心静脈周囲領域における酵素の発現や、微小分布に関連するさまざまな肝疾患に関わる重要なパラメータであるため、血流と酸素消費量を定量化することが重要です。そのメカニズムを明らかにする上で、本手法の利点は、非接触かつ連続的な光学測定により、肝微小循環における血流、血管径、および酸素勾配を定量化できることです。ドナーマウスから全血を採取し、赤血球をPBSで2回洗浄し、400 Gで5分間遠心分離しました。次に、2 mgのFITCを1 mLの100 mM DIリン酸水素ナトリウムに溶解し、0.2 µmの孔径を持つメンブレンでろ過します。次に、1 mLのFITC溶液を試験管に入れ、そこに0.15 mLの3 mMデキストラン溶液、0.25 mLの180 mM DIリン酸水素ナトリウム、および1.5 mLの100 mM DIリン酸水素ナトリウムを加え、軽く叩いて混ぜ合わせます。これを室温で2時間保持した後、染色したRBCをPBSで2回洗浄します。次に、少量のRBC懸濁液をガラススライド上に滴下し、正常なRBCの外観と十分な蛍光を確認します。0.1 milliliterのRBCを0.9 milliliterのPBSに懸濁させ、使用時まで4 °Cで保存します。次に、500 milligramsのBSAを10 millilitersのPBSに溶解させます。その後、30 milligramsのパラジウムポルフィリンを加え、一晩撹拌します。溶液を遠心分離して未溶解のパラジウムポルフィリンを取り除き、上清を0.2 micronのPOメンブレンでろ過します。ろ液を1 milliliterずつ試験管に分注し、-20 °Cで保存します。その際、凍結融解の繰り返しを避けるように注意してください。微小循環を顕微鏡で観察するために、プラスチックプレートに直径20 millimeterの穴を開け、その穴を1辺30 millimeterの正方形カバーガラスで覆います。尾静脈をカニューレした後、肝臓の主葉をプラスチックプレート上に腹臥位で広げます。次に、3 millimeter × 8 millimeterのプラスチック製食品ラップを複数枚使用して、呼吸による動きや乾燥を防ぐため、肝葉の周囲を覆います。透過顕微鏡を用いて肝血流を可視化し、視野内で少なくとも15分間、血流の停滞がないことを確認します。血流を観察するために、蛍光標識したRBCsを0.2 mL緩徐に注入します。酸素分圧を測定するには、0.2 millilitersのパラジウムポルフィリン溶液を注入します。FITC標識赤血球は、可視領域で循環している全赤血球の50分の1となるようにします。450 to 490 nanometerのバンドパスフィルターを通過させた水銀ランプで照射してFITCを励起させ、CCDカメラで蛍光を記録します。パラジウムポルフィリンの燐光は比較的弱いため、高感度検出器と暗室が必要です。パラジウムポルフィリンの吸収ピークは約410および532ナノメートルであり、532ナノメートルの第2高調波波長が推奨されます。この波長はネオジウムYAGパルスレーザーによって生成されます。レーザービームを倒立顕微鏡に接続し、ビームが焦点面の中央を照射するように調整します。レーザーの空間分解能はスポット径に依存し、これはビームをピンホールに通すことで調整可能です。また、リン光を検出するために、ロングパスフィルターと光電子増倍管（PMT）を顕微鏡に取り付けます。PMTは、特に700 nm付近の赤色波長に感度を持つものである必要があります。リン光信号をサンプリングし、指数関数を適用して減衰時定数を算出します。本実験では、200 kHzで500点のサンプリングを行いました。校正のため、酸素分圧がそれぞれ150 mmHgと0 mmHgのパラジウムポルフィリン溶液を2種類調製します。0 mmHgの溶液については、校正中に酸素が存在しない状態にするため、サンプルに1%のジヒドロゲン（dihi sodium）を添加してください。サンプルのpHを7.4、温度を37 °Cに維持します。マウスを顕微鏡ステージ上に配置し、肝微小循環を可視化したい微小血管をレーザースポットの位置に合わせます。マウスに一晩、水を自由飲用させた後、アセトアミノフェンを200 mg/kgで腹腔内投与します。投与から24時間後、マウスを麻酔し、正中切開により肝臓を露出させます。肝炎がある場合、傍中心領域の壊死を通じて肉眼で容易に確認できます。マウスの肝微小血管における酸素分圧を測定した結果、門脈、類洞、および中心静脈の平均酸素分圧はそれぞれ 59.8、48.2、38.9 mmHg でした。言い換えれば、門脈から中心静脈にかけての酸素勾配は、赤血球が類洞を通過する際に十分な酸素放出が行われていることを示しています。肝微小血管を測定するため、アセトアミノフェン誘発性肝炎マウスを準備しました。病理モデルの例として、アセトアミノフェン投与群では、正常マウスと比較して門脈、類洞および中心静脈における酸素分圧が高いことが分かりました。門脈と中心静脈の間の酸素分圧差は、正常マウスで 20.9 mmHg、肝炎モデルマウスで 16.9 mmHg でした。門脈と中心静脈の間の酸素分圧差は、正常マウスで 20.9 mmHg、肝炎モデルマウスで 16.9 mmHg でした。肝臓の微小循環における酸素勾配は、主に門脈からの酸素供給と肝細胞による酸素消費によって生じます。アセトアミノフェンによって中心静脈領域で肝細胞壊死が起こると、酸素消費量と下流の微小循環が減少し、その結果、血行動態に関連する問題が生じます。酸素供給と酸素消費は、多くの形態の肝疾患に関与しています。私たちは急性肝炎モデルを作製し、微小血管における酸素分圧の上昇を見出しました。当社の光学システムは、微小血管構造、血流分布、および酸素消費量を分析することで、生理学的および病理学的メカニズムを調査するために使用できます。

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血管再生を視覚化するために使用されるツールは、血管の樹木を対比するための方法を必要とします。このフィルムは、血管樹の最適なコントラストを達成し、μCTおよび組織学的シリアル切片を使用して得られた標本の詳細な分析から生じる潜在的な利点を示すために使用される繊細な注入技術を示しています。...

正常マウスで70％肝切除後の血管と実質再生の可視化

ここでラットのポータル高血圧症候群を特徴付けるために門脈圧、内臓の血流、血行などの循環パラメーターの侵襲的な測定のための詳しいプロトコルについて述べる。...

肝硬変ラットにおけるポータル高血圧症侵襲血行動態評価

実験的肝組織体内のプラズマ凝固法を評価するためにプロトコルをご紹介します。ブタのモデル レーザードップラー微小循環を検討、組織凝固深度を測定、凝固サイト赤外線放射温度計とサーモグラフィ...

プラズマ凝固体内大動物モデルの肝臓組織の評価

このプロトコルは、門脈灌流による代謝研究のために無傷のマウス肝臓を切除する簡単な方法を記載している。...

エクスビボ マウスの門脈を通る肝臓灌流

ここでは、肝臓の構造を乱すことなく、肝外因子がない場合に、肝代謝の急性および直接的な調節を研究するためのマウス肝臓の in situ...

灌流マウス肝臓モデルを用いた肝臓のグルコース産生、尿素生成、脂肪分解の定量化

高い空間分解能(100μm)と感度を備えた超高速ドップラー超音波(UFUS)は、肝臓血管系の包括的な定性的概要を得るための適切な非侵襲的イメージングモダリティを表しています。UFUSはまた、微小血管系の定量的測定を容易にし、血管疾患のメカニズムの理解を深めることを目的としています。...

超高速ドップラー超音波を用いたマウスの肝血管系のイメージングと定量化

このプロトコルは、生マウスの生命体内顕微鏡検査(IVM)用に最先端の再利用可能な肝画像診断ツール(RHIT)を導入し、迅速かつ急性期の実験において組織の安定性を高めます。RHITの3Dプリント設計はコスト効率の高い生産、拡張性、多用途性を提供し、さまざまなサイズのマウスにおける代謝過程の長期観察を可能にします。...

再利用可能な肝臓画像診断ツール:肝生命内顕微鏡検査用の再利用可能な3Dプリントツール

ここでは、既存のプラットフォームの高コストと限られた柔軟性を克服するように設計された、オープンソースで変更可能な常温 ex vivo...

研究者向けに設計されたオープンソースのノーマザミック灌流システム

学ぶ 肝微小循環の可視化と酸素分圧測定法。蛍光標識赤血球とレーザー燐光法を用いて血流速度と酸素勾配を解析し、急性肝炎モデルでの病態生理メカニズムを解明する手法です。

肝微小循環における血流と酸素消費量の可視化と分析：急性肝炎モデルへの応用

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