α-テスト：全唾液を用いた迅速な無細胞CD4列挙

資源が限られた地域において、HIV疾患をモニタリングするための手頃な価格のCD4数測定法が急務となっています。このビデオでは、唾液中のプロテアーゼ阻害剤Alpha one PIの存在に基づいてCD4数を判定する、低コストのポイントオブケア・スクリーニング検査を紹介します。この検査を行うために、まず被験者または患者にレモンドロップを口としてもらい、唾液への漿液の滲出を促進させます。

唾液を検体カップに採取し、96ウェルアッセイプレートに移します。次に、飽和量のプロテアーゼである豚膵臓エラスターゼを唾液に添加し、α1-アンチトリプシン（alpha one pi）に結合させて阻害します。続いて、比色法用エラスターゼ基質を添加します。

未結合のまま残ったエラスターゼが基質を切断し、その結果、色は透明から黄色へと変化します。各ウェルにクマシブルーを添加して全タンパク質を染色し、マイクロプレートリーダーを用いて比色測定を行います。最終的に、全タンパク質に対するalpha one PIの比率を算出し、指標値に基づいてCD4数を正確に評価します。

この手法には、既存の方法であるフローサイトメトリーと比較していくつかの利点があります。このアッセイは、侵襲的でコストのかかる採血を行うことなく、高価なモノクローナル抗体を使用せず、専門的な技術教育を必要とせず、さらに冷蔵保存やサンプルの輸送も不要で、現場で実施可能です。この手法はAIDS介入における決定的な障壁を克服し、患者のコストと健康状態、およびHIV伝播の頻度に大きな影響を与えると考えられ、これらすべてが世界経済に重大な影響を及ぼします。

この手法は、AlphaおよびPIが接着と遊走を通じてCD4 T細胞数をどのように調節しているかについての知見を提供しますが、他のタンパク質阻害剤が他の細胞種の接着や細胞遊走をどのように調節しているかなど、他の系にも応用可能です。我々がこの手法を考案したのは、HIV感染患者においてAlpha 1 PIが非常に低く、それが実際には血液中に移行するCD4 T細胞の数を制限していることを発見したときでした。まず、使用する各マイクロプレートに必要な作業溶液を準備することから本プロトコルを開始してください。

pH 7.8の0.05 M Tris緩衝生理食塩水（TBS）を60 mL調製します。また、マイクロプレート1枚につき、ブタ膵臓エラスターゼ type 1（PPE）を6 mL調製します。PPE懸濁液を十分に振盪させた後、TBSで希釈し、濃度を約0.01 units/mLにします。

次に、比色基質SA 3 NAの0.1 molarストック溶液を調製します。DMSOに溶解したこのストック溶液は、すぐに使用するか、後で使用する場合は-20 °Cで保存してください。TBSで100倍に希釈し、マイクロプレート1枚あたり6 mLの調製液を用意します。最後に、10%クマシーブリリアントブルー R 250のストック溶液をTBSで調製し、すぐに使用するか、後で使用する場合は-20 °Cで保存してください。

ストック液をTBSで1000倍に希釈し、マイクロプレート1枚につき6 mLずつ準備します。唾液を扱う際は、被験者または患者を立位にした状態で、手袋や白衣を着用するなど適切な予防策を講じることが重要です。口の中にSGOを配置し、血清滲出を刺激します。

このデモンストレーションにおけるHIV患者の役割は、研究助手によって演じられています。砂糖不使用のレモンドロップは、無歯状態でガムを噛むことができないHIV患者にとって便利です。必要に応じて嚥下し、最初の3分間を過ごした後、次の3分間で全口唾液を検体カップに採取します。これにより、約2 mLの唾液が得られます。

唾液をすぐに使用しない場合は、分注して-80°Cで保存し、検体処理当日に37°Cで解凍してください。解凍後の唾液は、2～4°Cで最大3日間保存可能です。各サンプルおよびコントロールは、アッセイを行うために96ウェル平底プレートに3連（triplicate）で分注し、各サンプルウェルおよびコントロールウェルに130 µLのTBSを加えます。

次に、粘性が高く血清滲出液を含まないムチンを避け、20 µLの唾液を3つのテストウェルおよび3つの陰性対照ウェルのそれぞれに分注します。その後、陽性対照ウェルに20 µLのTBSを加え、ピペッティングにより混合します。

このステップでは、唾液をピペッティングする際にボルテックスによる気泡の発生を避け、固体粒子や粘液を吸い込まないようにすることが重要です。次に、陽性コントロールの膵エラスターゼ（PPE）作業溶液をよく振って混ぜ合わせます。その後、サンプルウェル、陽性コントロールウェル、および陰性コントロールウェルに50 µLずつ添加します。

TBSを50 µL加えます。加える量が多く、唾液混合物に均一に分散するため、混ぜ合わせる必要はありません。プレートを室温で10分間インキュベートします。

インキュベーション後、各ウェルにエラスターゼ基質SA three NA作動液を50 µLずつ添加します。その後、23 °Cでさらに45分間インキュベートします。45分が経過後、各ウェルにクマシーブルー作動液を50 µL添加します。

次に、マイクロプレートリーダーを用いて、SA3NA切断を検出するための405 nanometersと、全タンパク質含量を示すクマシーブルーを検出するための595 nanometersで吸光度を測定します。α1-PI indexを算出するには、まず以下の式を用い、検体平均と陰性コントロール平均の差を、陽性コントロール平均と陰性コントロール平均の差で除することで、各波長の正規化吸光度を求めます。その後、ここに示すように、405 nanometersにおける正規化吸光度を595 nanometersにおける正規化吸光度で除してα1-PI indexを算出し、このαテストが、リソースの限られた流行地域におけるCD4数モニタリングのためのポイントオブケアスクリーニング検査として適しているかどうかを判定します。

カメルーンのクリニックに定期受診しているHIV陽性女性20名および男性11名から刺激唾液を採取した。ニューヨーク市で採取した唾液を用いてαテストの開発を行った際の予備的観察結果と同様に、α1 PI指数およびカメルーンで採取した唾液は、R²値0.91、P値0.0001未満でCD4数と相関した。この関係は3パラメーターシグモイド曲線によって定義されており、これは用量反応関係と一致している。95%信頼区間および予測区間は、それぞれ青線と赤線で示されている。

先行研究において、HIV-1感染者および遺伝性α1-PI欠乏症（PIZZ型）の被験者において、CD4陽性T細胞が23 ± 3.5日の周期で正弦波状のサイクルを示すことを明らかにしました。ここに示すのは、27日の周期を示す非HIV健康対照群におけるCD4サイクルのコンピュータ生成正弦波曲線分析の代表例です。6名の被験者を対象にCD4陽性T細胞の変化をコンピュータ生成正弦波曲線分析したところ、期待通りにピーク間振幅と振動軸の値が得られました。振動軸は振幅と相関しており、R²値は0.96、p値は0.009でした。

CD4陽性T細胞数が少ない患者では、CD4陽性T細胞数の周期的な変動は小さく、CD4陽性T細胞数が多い患者では周期的な変動が大きくなっていました。これは、ここで示されている回帰線が振動の軸を推定しており、振動の軸が振幅と相関しているためです。回帰線から振幅を算出することで、周期的な変動によりCD4陽性T細胞数が回帰線から上下にどの程度変動すると予想されるかを推定できます。算出された振幅と信頼区間を重ね合わせたところ、緑色の線で示される振幅が、青色の線で示される95%信頼区間内に収まっていることがわかりました。

この手法を習得すれば、唾液の採取から患者へのCD4細胞数の報告までを90分で完了させることができます。本手順は、CD4数をモニタリングするためのスクリーニング検査としての使用を目的としています。患者のCD4数に大幅な変化が見られた場合は、CD4数の測定値が妥当であるかを確認し、治療方針の決定を支援するために、フローサイトメトリーを用いてフォローアップを行う必要があります。

開発の次段階では、マイクロプレートアッセイをディップスティック技術へと発展させ、機器や電力を必要とせずに検査を実施できるようにします。唾液によるHIVの感染はおそらく起こりませんが、HIV患者は結核やC型肝炎などの他の感染症を併発していることが多いため、未知の感染性粒子が含まれている可能性があり、唾液の取り扱いは血液の取り扱いと同様に極めて危険であることに留意してください。本手順を実施する際は、常に手袋やその他の個人用保護具を着用するなど、十分な予防措置を講じてください。