Name: α-テスト：全唾液を用いた迅速な無細胞CD4列挙 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶ唾液を用いたα-テストによるCD4細胞数の迅速測定法。HIV患者のモニタリングに適した低コストで非侵襲的な現場診断技術を習得できます。

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研究では、ハリーウィンストン研究財団によってサポートされていました。

1。新鮮なワーキング溶液を調製<ol><li> TBS：0.05 MトリスpHは7.8（TBS）、緩衝生理食塩水。 60ミリリットルTBS /マイクロプレートを準備します。 </li><li> PPE：ブタ膵臓エラスターゼ、タイプ1（PPE）は、懸濁液として提供されています。よく振って約0.01 U / mlのTBSでPPEを希釈する。 6ミリリットルワーキング溶液/プレート）を準備します。 </li><li> SA 3 NA：スクシニル-L-Alaの-L-Alaの-L-Alaの-p-ニトロアニリド（SA 3 NA）。ジメチルスルホキシド（DMSO）に0.1 M株式SA 3 NA溶液を調製し、-20℃で直ちに使用するか、または保存する株式SA 3 NA溶液をTBSで1/100に希釈して6ミリリットルワーキングソリューション/マイクロプレートを準備します。 </li><li> クーマシーブルー：TBS 10％クーマシーブリリアントブルーR-250（シーブルー）のストック溶液を調製し、-20℃で直ちにまたはストアを使用しTBSに原液1/1000希釈して6ミリリットル作業溶液を調製します。 </li></ol> 2。唾液を準備します。 <oL&gt; <li> 唾液採取：立った姿勢では、このような口の中でクエン酸またはチューインガムとして唾液分泌促進薬を配置することによって、唾液中に血清滲出を刺激する。無糖レモンドロップは頻繁に歯と歯茎をかむことができないHIV-1患者のために便利です。最初の3分間、必要に応じて飲み込むと、次の3分間に覆われたカップに口全体に唾液を収集します。これにより、唾液の約2ミリリットルを提供します。 -80℃で直ちに使用や保管℃、 </li><li> 唾液処理：37℃で凍結、融解試料℃、氷上に置いた場合。 2月4日で新鮮なまたは融解試料を保存°C 3日間を超えない。渦唾液をないし、血清滲出液が含まれていませんムチンピペッティングは避けてください。唾液取り扱う際には標準予防策を使用して<a href="http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf" target="_blank">http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdfを</a> 。 </li></ol> 3。マイクロプレートのセットアップ<ol><li><strオング&gt; BUFFER：測定は三重で行われます。マイクロタイタープレートの各ウェルに130μLTBSに追加されます。 </li><li> 検体：各テストによく、150μl/ウェルの最終容量20μLの唾液に追加されます。気泡を導入することなく、ピペッティングにより混和する。 </li><li> コントロール：陽性対照PPEが含まれていません、しかし、唾液。ネガティブコントロールは、唾液が含まれていますが、よくないPPE.To陽性対照は20μLTBSが追加されません。ネガティブコントロールによく20μLの唾液に追加されます。 </li><li> PPEのインキュベーション：PPEワーキング溶液をよく振ってください。よくネガティブコントロールのウェルを除く各50μLPPEワーキングソリューションを追加します。ネガティブコントロールのウェルに、50μLのTBSを追加します。 23℃で10分間インキュベートする。 </li><li> 基板のインキュベーション：各ウェルに50μLSA 3 NAワーキングソリューションを追加します。 23℃で45分間インキュベート</li><li> クーマシーブルー：50μLクーマシーブルーワーキングソリューションを追加する&lt;/ LI&gt; <li> 読出し：タンパク質含有量を表してクーマシーブルーを検出するためにアクティブなα1 PIおよび595 nmを表すSA 3 NAの切断を検出するためにマイクロプレートリーダー、405 nmで吸光度を測定します。 </li></ol> 4。 α1 PI指数を計算する<ol><li> 平均 405 nm と 595 nmのを正規化 ：それぞれの三重は、平均を計算します。標本平均値から陰性コントロールの平均値を減算します。プレートからプレートの変動を​​最小限に抑えるために、次のようにポジティブコントロールの平均値によって、各標本の平均値で割って平均値を正規化する。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3999/3999eq1.jpg" /> <ol start="2"><li> α1 PI INEXを計算します。正規化された595 nmの正規化405 nmで割ります 。 </li></ol> 5。代表的な結果風土病、資源の限られた地域でのCD4数を監視するためのポイントオブケアのスクリーニングテストとしてα-テストでは、使用に適している可能性があるかどうかを決定するために、刺激唾液は、20の女性から採取されたと11男性のHIV-1の被験者参加診療所のためにカメルーンのルーチンケア。ニューヨーク市で収集した唾液を用いたα-テストの開発時には予備的観察と一致し、唾液中のα1 PI指数は、CD4数（R 2 = 0.91、P &lt;0.0001、N = 31）と相関してカメルーンで収集された。関係は、用量反応関係（図2A）と一致している3パラメータシグモイド曲線によって定義されています。 95％の信頼区間と予測区間は、それぞれ青と赤の線（図2B）に描かれています。 で以前の研究で、我々は、CD4 + T細胞は周期23の正弦波サイクリング±HIV-1患者におけるα1 PIの欠乏（PIZZ 3）の継承したバージョンの被験者で3.5日を示すことが判明しました。描かれた本書は、27日周期（図3A）を示す非HIV-1健康なコントロールでサイクリングCD4のコンピュータで生成された正弦曲線分析の代表例である。 CD4 + 6科目のT細胞の変化をコンピュータで生成された正弦曲線の分析は、ピーク·ツー·ピーク振幅と振動の3軸の値が得られた。期待されるように、振動の軸は振幅と相関した（r 2 = 0.96、P = 0.009、n = 6）は（ 図3B）。患者のする低CD4 T +細胞数は、CD4 T細胞数の周期的変化は小さかった、高いCD4 + T細胞数の患者では、周期的な変化が大きかった。 から図2に示した回帰直線は、振動と振動の軸の軸は振幅がために変化することにより、回帰直線のCD4 + T細胞が予想されるどのくらいの上下に推定する回帰直線を計算することができ、振幅と相関していると推定サイクリング（ 図3C）。図3C及び図2Bに計算された信頼区間で計算された振幅重ね合わせ、その振幅は（緑線）95％以内であることが判明した信頼区間（青線）（ 図3D）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3999/3999fig1.jpg" /> 図1。手順の概要：口の中に置き、クエン酸と唾液を収集します。三重のマイクロプレートのウェルに希釈した唾液を追加します。各ウェルにPPEを追加し、23℃で15分間インキュベート各ウェルにPPE基板を追加し、23℃で45分間インキュベート。クマシーブルーを追加して、PPEのアクティビティを検出し、595 nmでタンパク質を検出するために405nmで読み取る。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3999/3999fig2.jpg" /> 図2。標準的なCD4列挙法によるα-テストの比較。 A）α-テスト刺激全体の口の唾液中にα1 PI指数を定量することにより行った。 CD4数は、標準的なフローサイトメトリーを用いて独立した医療研究室で行った。フローサイトメトリーと唾液の血液は、同じ診療所の訪問で集めた。 B）95％信頼区間と予測区間は、青と赤で描かれているα1 PI指数とCD4数が3パラメータシグモイド曲線（R 2 = 0.91、P &lt;0.0001、N = 31）で定義されています。との関係それぞれの行、。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3999/3999fig3.jpg" /> 図3。計算CD4の精度は、Cα1PIIndex.Aを使用してounts）は、CD4 + T細胞は、非HIV-1健常対照の27日周期の正弦波サイクリングを示した。振動の軸が描かれている（赤い点線）。B）T細胞の循環が4 HIV-1の被験者において振動のピーク·ツー·ピーク振幅と軸を計算するために使用されたCD4、1非感染のコンピュータ生成された正弦波の解析-1 PIzzの件名、および部品AにCD4との関係を示した非HIV-1健常対照T +細胞の振幅と振動の軸は3つのパラメータシグモイド曲線（R 2 = 0.96、P = 0.009、nで定義されています= 6）。C）パートB）で得られた振動の振幅と軸の間にS字型の関係は図2の回帰直線（黒線）に沿った点の予想される振幅（緑線）を計算するために使用されていました。D）予想される振幅間隔（緑線）は95％信頼区間（から有意に異なっていたとしてマンホイットニー順位和検定と振幅線と回帰直線（37セル間の中央値の差（95％信頼区間と回帰直線（63個/μLの間の中央値の差の比較に基づく）によって決定された青線） /μl）を、P = 0.001）。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

原液血清は、中央値36μMを含むα1 PIおよび3.6μMα2マクログロブリン（α2 M）の10倍の差が8。両方のタンパク質は、PPEへの結合について競合します。これら二つの特性、濃度、PPE親和性は、特にM 8α2、競合の存在下で正常な血清中のα1 PIを測定することができる方法を開発するために利用されています。このメソッドは、0.3％の血清中ではわずか50 nMのμ1 PIを検出することができます。 2.5％の血清希釈で、PPEへのα2 Mの結合は検出されなくなり、この希釈は、約900nmのα1 PIと90 nmのα2 Mを含まれています α2 Mより10倍以上のα1 PIで構成されている血清とは対照的に、全体の口の唾液は、20倍の差が9を含んでいます。我々は、刺激唾液、原液...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>唾液分泌促進薬、0.05Mクエン酸</td><td> EDAのSugarfreeキャンディーズ、4900リアN.20thストリート、フィラデルフィア、PA 19144 </td><td>シュガーフリーレモンドロップ</td></tr><tr><td>ブタ膵臓エラスターゼ、1型（EC 3.4.21.36） </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO 63103 </td><td> E1250 </td></tr><tr><td>スクシニル-L-Alaの-L-Alaの-L-Alaの-p-ニトロアニリド</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S4760 </td></tr><tr><td>クマシーブリリアントブルーR-250 </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> B7920 </td></tr><tr><td>組織培養処理し、96ウェルマイクロプレート</td><td>ベクトン·ディッキンソン、フランクリンレイクス、NJ 07417-1886 </td><td> 35から3072 </td></tr><tr><td> 405 nmと595 nmのフィルター付きマイクロプレートリーダー</td><td> MTXラボシステム、8456コネクタ、道路、ブイlding D、ウィーン、バージニア州22182 </td><td>ダイネックスP97277 </td></tr></tbody></table>

α-テスト：全唾液を用いた迅速な無細胞cd4列挙

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

HIV疾患をモニタリングするためには、安価なCD4数測定法の確立が急務となっています。現在唯一認められている手法である、血中細胞上のCD4を測定するためのモノクローナル抗体をはじめとする試薬のコスト、技術的な専門性、そして時間および温度の制限があるため、資源が限られた地域ではCD4数測定の実施は困難です。コストと時間を削減するための一般的な実験室戦略として、特定の血液値を直接測定するのではなく、計算によって算出する方法があります。例えば、LDLレベルは、総コレステロール、HDL、およびトリグリセリドの測定値を用いて算出されます1。したがって、CD4+ T細胞数を直接的に調節する細胞外の相関因子を特定できれば、その生理学的な関連性に基づき、CD4数を正確に算出する手法を提供できる可能性があります。
血液中に進入し、循環CD4+ T細胞となる幹細胞の数は、細胞の移動能に影響を与えるケモカインCXCL12とその受容体CXCR4によって決定される2。血液中への幹細胞の移動プロセスは、さらに細胞表面ヒト白血球エラスターゼ（HLECS）およびHLECS反応性活性α1プロテイナーゼインヒビター（α1PI、α1アンチトリプシン、SerpinA1）によって調節される3。HIV-1感染症では、疾患プロセスによりα1PIが不活性化される 4。HIV-1感染症の初期無症状群では、未治療のHIV-1患者の100%において活性α1PIが正常値以下であり（中央値=12 μM）、有症状群で正常レベルに達することが判明している4, 5。このパターンは、合成不全や蛋白分解による不活性化、あるいは酸化ではなく、免疫不活性化に起因すると考えられている。CD4細胞数が &gt;220 cells/μlであるHIV-1感染被験者において、CD4数と活性α1PIの血清レベル（r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26）および不活性α1PIの血清レベル（r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26）に相関があることが観察された 5。HIV-1感染者および非感染者へのα1PI投与により、CD4数が劇的に増加したことから、α1PIが血液中のCD4+ T細胞数の調節に関与していることが示唆された 3。
刺激を加えることで、全唾液中には十分な漿液性滲出液（血管壁を通過して唾液中に流入するタンパク質を含む血漿）が含まれるため、活性型α1PIの測定が可能となり、この測定値との相関は、CD4数を算出するための正確な手法であるという根拠となります。簡潔に述べると、チューインガムやクエン酸などの唾液分泌促進剤が、全口唾液への血清の滲出を刺激します。血清の滲出を刺激した後、唾液中の血清α1PIの活性を、エラスターゼ活性を阻害する能力によって測定します。豚膵臓エラスターゼ（PPE）は、容易に入手可能な安価なエラスターゼ源です。PPEはα1PIと結合して1対1の複合体を形成し、これによりPPEが特定の基質を切断することを妨げます。その基質の一つが、比色ペプチドであるサクシニル-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-ニトロアニリド（SA3NA）です。唾液を飽和濃度のPPEと共に室温で10分間インキュベートすることで、唾液中のすべての活性型α1PIにPPEが結合します。活性型α1PIによるPPEの阻害結果は、PPE基質であるSA3NAを添加することで測定できます(Figure 1)。CD4数は血液量（CD4 cells/μl）として測定されますが、唾液量は一日中、また個人間で大きく変動するため、唾液中のα1PI濃度は唾液量ではなく、唾液中の血清濃度に関連しています6。しかし、唾液中のタンパク質のほぼすべては血清成分によるものであり、唾液のタンパク質含有量は測定可能です7。したがって、唾液中の活性型α1PIは、唾液タンパク質含有量に対する比率として算出され、これをα1PI指数と呼びます。ここに提示する結果は、α1PI指数がCD4数を算出するための正確で精密な生理学的手法であることを示しています。

CD4列挙法、α-テストは、迅速かつ正確なCD4 + Tリンパ球数を提供するために唾液を使用していますが記載されている。 α-テストコストのペニーと技術トレーニングなど、モノクローナル抗体、計測機器、冷凍、サンプルの輸送と同様に、血液の収集と処理などの高価な試薬の必要がなくなります。

α-テスト：全唾液を用いた迅速な無細胞CD4列挙

HIV疾患をモニタリングするための、低コストなCD4数測定法に対する急務なニーズが存在します。資源が限られた地域では、時間の制約により、CD4数測定は実施不可能な状況にあります。

資源が限られた地域において、HIV疾患をモニタリングするための手頃な価格のCD4数測定法が急務となっています。このビデオでは、唾液中のプロテアーゼ阻害剤Alpha one PIの存在に基づいてCD4数を判定する、低コストのポイントオブケア・スクリーニング検査を紹介します。この検査を行うために、まず被験者または患者にレモンドロップを口としてもらい、唾液への漿液の滲出を促進させます。唾液を検体カップに採取し、96ウェルアッセイプレートに移します。次に、飽和量のプロテアーゼである豚膵臓エラスターゼを唾液に添加し、α1-アンチトリプシン（alpha one pi）に結合させて阻害します。続いて、比色法用エラスターゼ基質を添加します。未結合のまま残ったエラスターゼが基質を切断し、その結果、色は透明から黄色へと変化します。各ウェルにクマシブルーを添加して全タンパク質を染色し、マイクロプレートリーダーを用いて比色測定を行います。最終的に、全タンパク質に対するalpha one PIの比率を算出し、指標値に基づいてCD4数を正確に評価します。この手法には、既存の方法であるフローサイトメトリーと比較していくつかの利点があります。このアッセイは、侵襲的でコストのかかる採血を行うことなく、高価なモノクローナル抗体を使用せず、専門的な技術教育を必要とせず、さらに冷蔵保存やサンプルの輸送も不要で、現場で実施可能です。この手法はAIDS介入における決定的な障壁を克服し、患者のコストと健康状態、およびHIV伝播の頻度に大きな影響を与えると考えられ、これらすべてが世界経済に重大な影響を及ぼします。この手法は、AlphaおよびPIが接着と遊走を通じてCD4 T細胞数をどのように調節しているかについての知見を提供しますが、他のタンパク質阻害剤が他の細胞種の接着や細胞遊走をどのように調節しているかなど、他の系にも応用可能です。我々がこの手法を考案したのは、HIV感染患者においてAlpha 1 PIが非常に低く、それが実際には血液中に移行するCD4 T細胞の数を制限していることを発見したときでした。まず、使用する各マイクロプレートに必要な作業溶液を準備することから本プロトコルを開始してください。pH 7.8の0.05 M Tris緩衝生理食塩水（TBS）を60 mL調製します。また、マイクロプレート1枚につき、ブタ膵臓エラスターゼ type 1（PPE）を6 mL調製します。PPE懸濁液を十分に振盪させた後、TBSで希釈し、濃度を約0.01 units/mLにします。次に、比色基質SA 3 NAの0.1 molarストック溶液を調製します。DMSOに溶解したこのストック溶液は、すぐに使用するか、後で使用する場合は-20 °Cで保存してください。TBSで100倍に希釈し、マイクロプレート1枚あたり6 mLの調製液を用意します。最後に、10%クマシーブリリアントブルー R 250のストック溶液をTBSで調製し、すぐに使用するか、後で使用する場合は-20 °Cで保存してください。ストック液をTBSで1000倍に希釈し、マイクロプレート1枚につき6 mLずつ準備します。唾液を扱う際は、被験者または患者を立位にした状態で、手袋や白衣を着用するなど適切な予防策を講じることが重要です。口の中にSGOを配置し、血清滲出を刺激します。このデモンストレーションにおけるHIV患者の役割は、研究助手によって演じられています。砂糖不使用のレモンドロップは、無歯状態でガムを噛むことができないHIV患者にとって便利です。必要に応じて嚥下し、最初の3分間を過ごした後、次の3分間で全口唾液を検体カップに採取します。これにより、約2 mLの唾液が得られます。唾液をすぐに使用しない場合は、分注して-80°Cで保存し、検体処理当日に37°Cで解凍してください。解凍後の唾液は、2～4°Cで最大3日間保存可能です。各サンプルおよびコントロールは、アッセイを行うために96ウェル平底プレートに3連（triplicate）で分注し、各サンプルウェルおよびコントロールウェルに130 µLのTBSを加えます。次に、粘性が高く血清滲出液を含まないムチンを避け、20 µLの唾液を3つのテストウェルおよび3つの陰性対照ウェルのそれぞれに分注します。その後、陽性対照ウェルに20 µLのTBSを加え、ピペッティングにより混合します。このステップでは、唾液をピペッティングする際にボルテックスによる気泡の発生を避け、固体粒子や粘液を吸い込まないようにすることが重要です。次に、陽性コントロールの膵エラスターゼ（PPE）作業溶液をよく振って混ぜ合わせます。その後、サンプルウェル、陽性コントロールウェル、および陰性コントロールウェルに50 µLずつ添加します。TBSを50 µL加えます。加える量が多く、唾液混合物に均一に分散するため、混ぜ合わせる必要はありません。プレートを室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルにエラスターゼ基質SA three NA作動液を50 µLずつ添加します。その後、23 °Cでさらに45分間インキュベートします。45分が経過後、各ウェルにクマシーブルー作動液を50 µL添加します。次に、マイクロプレートリーダーを用いて、SA3NA切断を検出するための405 nanometersと、全タンパク質含量を示すクマシーブルーを検出するための595 nanometersで吸光度を測定します。α1-PI indexを算出するには、まず以下の式を用い、検体平均と陰性コントロール平均の差を、陽性コントロール平均と陰性コントロール平均の差で除することで、各波長の正規化吸光度を求めます。その後、ここに示すように、405 nanometersにおける正規化吸光度を595 nanometersにおける正規化吸光度で除してα1-PI indexを算出し、このαテストが、リソースの限られた流行地域におけるCD4数モニタリングのためのポイントオブケアスクリーニング検査として適しているかどうかを判定します。カメルーンのクリニックに定期受診しているHIV陽性女性20名および男性11名から刺激唾液を採取した。ニューヨーク市で採取した唾液を用いてαテストの開発を行った際の予備的観察結果と同様に、α1 PI指数およびカメルーンで採取した唾液は、R²値0.91、P値0.0001未満でCD4数と相関した。この関係は3パラメーターシグモイド曲線によって定義されており、これは用量反応関係と一致している。95%信頼区間および予測区間は、それぞれ青線と赤線で示されている。先行研究において、HIV-1感染者および遺伝性α1-PI欠乏症（PIZZ型）の被験者において、CD4陽性T細胞が23 ± 3.5日の周期で正弦波状のサイクルを示すことを明らかにしました。ここに示すのは、27日の周期を示す非HIV健康対照群におけるCD4サイクルのコンピュータ生成正弦波曲線分析の代表例です。6名の被験者を対象にCD4陽性T細胞の変化をコンピュータ生成正弦波曲線分析したところ、期待通りにピーク間振幅と振動軸の値が得られました。振動軸は振幅と相関しており、R²値は0.96、p値は0.009でした。CD4陽性T細胞数が少ない患者では、CD4陽性T細胞数の周期的な変動は小さく、CD4陽性T細胞数が多い患者では周期的な変動が大きくなっていました。これは、ここで示されている回帰線が振動の軸を推定しており、振動の軸が振幅と相関しているためです。回帰線から振幅を算出することで、周期的な変動によりCD4陽性T細胞数が回帰線から上下にどの程度変動すると予想されるかを推定できます。算出された振幅と信頼区間を重ね合わせたところ、緑色の線で示される振幅が、青色の線で示される95%信頼区間内に収まっていることがわかりました。この手法を習得すれば、唾液の採取から患者へのCD4細胞数の報告までを90分で完了させることができます。本手順は、CD4数をモニタリングするためのスクリーニング検査としての使用を目的としています。患者のCD4数に大幅な変化が見られた場合は、CD4数の測定値が妥当であるかを確認し、治療方針の決定を支援するために、フローサイトメトリーを用いてフォローアップを行う必要があります。開発の次段階では、マイクロプレートアッセイをディップスティック技術へと発展させ、機器や電力を必要とせずに検査を実施できるようにします。唾液によるHIVの感染はおそらく起こりませんが、HIV患者は結核やC型肝炎などの他の感染症を併発していることが多いため、未知の感染性粒子が含まれている可能性があり、唾液の取り扱いは血液の取り扱いと同様に極めて危険であることに留意してください。本手順を実施する際は、常に手袋やその他の個人用保護具を着用するなど、十分な予防措置を講じてください。

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