神経、地帯、および蛍光色素で脊髄根の逆行ローディング

この手順の全体的な目的は、シンプルで低コストな手法を用いて、ニューロンまたは任意の神経路に高濃度の蛍光色素またはイオン感受性色素を導入することです。これは、まずタイプ1とタイプ2の2種類のピペットを作成することで達成されます。次に、タイプ1のピペットに柔軟なエラストマーチューブを接続し、正圧をかけて目的の神経路をタイプ1のピペット内に吸い込み、良好なシールが形成されていることを確認します。

次に、タイプ2のピペットをタイプ1のピペットに挿入し、タイプ2のピペットを用いて、タイプ1のピペット内の残留A CSFを吸引します。その後、気泡が入らないように染料をタイプ1のピペットに導入します。最後のステップは、ニューロンを暗所内で6〜20時間インキュベートすることです。

最終的に、タイプ1ピペットを除去した後、in vitroでの電気生理学的または形態学的研究に使用可能な準備が整います。バス適用、BOS注入、エレクトロポレーションなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、Dを特定の神経細胞集団に届けることができる点にあります。この方法は、特定の神経細胞の活動、結合性、形態、および分布など、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

一般的に、この手法には習熟が必要です。特に、タイプ1ピペット内で染料が希釈されないようにすること、および気泡が混入しないようにすることに注意してください。まず、アルコールランプの炎でポリエチレンチューブを延伸し、先端がテーパー状になった2本の短いピペットを作成します。最初に、標的となる根または神経路をしっかりと保持できる、先端の小さい短いタイプ1ピペットを作成します。

次に、タイプ1のピペットの先端まで挿入できる、より長く細いシャフトと非常に細いチップを持つタイプ2のピペットを用意します。その後、タイプ2のピペットをECクリップ付きの19ゲージ針に接続します。そして、単離した脊髄をバスに入れます。

充填プロセス全体を通じて、冷却したA CSFで超融合させます。その後、タイプ1ピペットを電極ホルダーに設置し、背面開口部をフレキシブルチューブを介してシリンジに簡単に接続できるようにします。この手順では、まずシリンジを用いてタイプ1ピペットにCSFを吸い込みます。

次に、充填する軸索路または神経根を描画します。その後、背面開口部から柔軟なチューブを取り除きます。続いて、タイプ2ピペットを別のシリンジに取り付けます。

顕微鏡下で軸索束または神経根を保持しているタイプ1ピペットに挿入します。タイプ2ピペットに取り付けたシリンジを用いてA CSFを吸引し、残ったA CSFが軸索束をちょうど覆うようにします。その後、タイプ1ピペットからタイプ2ピペットを抜いてください。

A CSFのレベルを数分間モニタリングし、軸索路または神経のシールが良好であることを確認します。その後、染料をA CSFまたは2重蒸留水で調製した0.2%Triton X 100に溶解させます。気泡が入らないように注意しながら、接続されたシリンジで弱い陰圧をかけ、タイプ2ピペットに染料を吸い込みます。

次に、色素が入ったタイプ2ピペットを、残りのA CSF溶液が入っているタイプ1ピペットに挿入します。シリンジに緩やかな正圧をかけ、タイプ1ピペット内のA CSFに色素をゆっくりと放出させます。この際、気泡を混入させたり、チップ内部で標的組織を移動させたりしないように注意してください。色素の注入中にタイプ1ピペットに気泡が入った場合は、タイプ2ピペットの先端を気泡の近くまで進め、装着したシリンジを用いて緩やかな負圧をかけることで、気泡を吸い出してください。

十分な量の色素が放出されたら、タイプ2ピペットを抜きます。次に、実験の種類に応じて、組織を暗所で6時間から20時間インキュベートします。充填に十分な時間が経過した後、組織から電極をゆっくりと引き抜きます。

これで組織はイメージングまたは組織学的解析に使用可能な状態になります。以下は、3種類の異なるコンジュゲート蛍光色素を、運動ニューロン、感覚求心性ニューロン、および脊髄介在ニューロンに同時に導入した模式図です。運動ニューロンと仙髄感覚求心性ニューロンには、それぞれ腹根および背根を介してCascade blue DextranとTexas red dextranを逆行性に注入しました。また、腹索を介して上行する軸索を持つ脊髄介在ニューロンには、緑色蛍光dextranを導入しました。

ここに、ニューロンを逆行性に標識した仙髄切片の共焦点画像を示します。標識された感覚求心路は主に同側であることに注意してください。少数の対側への投射が見られますが、標識された運動ニューロンは充填された腹根と同側に位置し、一方で標識された介在ニューロンは、矢印で示されているように腹根の対側に位置しています。

本手順に続き、DI領域のニューロンにおける機能的結合、興奮性・抑制性、サイナプス型、分布、および神経伝達物質の産生などの重要な疑問を解消するために、追加の解析を行うことができます。この手法は、脊髄および脳幹神経生理学分野の研究者が、イオン感受性色素を用いて特定のニューロン集団を同定する道を切り拓きました。本ビデオを視聴することで、分離された脊髄のニューロンおよび感覚線維に、蛍光色素またはイオン感受性色素を適用する方法について十分な理解が得られるはずです。