Name: 神経、地帯、および蛍光色素で脊髄根の逆行ローディング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶ ポリエチレン吸引ピペットを用いた脊髄根への蛍光・カルシウム感受性色素の逆行ローディング法。低コストで特定のニューロン集団に高濃度の色素を導入し、神経活動の可視化と機能解析を可能にする実験技術です。

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<p class="jove_content"&gt;この作品は、国立衛生研究所の神経疾患や脳卒中の国立研究所の学内プログラムによってサポートされていました。また、メソッドには、図3のデータへの彼の以前の貢献のために博士ジョージMentisに感謝します。</p

蛍光デキストランは、解剖学的ツールとして、イメージング神経活動1-4使用されています。フィールドら 、（2009）4は、モデル系として脊髄を中心とした軸索路にイオンと電位感受性色素を適用するためのプロトコルを公開しました。ここでは、 インビトロ optophysiologicalおよび形態学的研究のためにカット腹根、後根または脊髄のいずれかの神経管に蛍光及び/又はイオン感受性色素を適用するための詳細な手順について説明します。 1。タイプ-IとType-IIピペットテーパーチップとピペットを生成するためにアルコールランプ7の炎の上にポリエチレンチューブの二つの短いセクション（PE90、クレイ·アダムスブランド）を引いて起動します。 Oneピペット（タイプI）がしっかりとターゲットルートまたは管を（;内径0.2〜0.4ミリメートル：0.1〜0.3ミリメートル外径）を保持できる小型チップで（3-7 mm）を短くする必要があります。次に、第二のピペット（タイプを引く-II）より長い（8-12 cm）の薄型化、シャフトと非常に微細なチップ（外径：0.2〜0.3ミリメートル、内径に挿入することができます0.1〜0.2ミリメートル）タイプ-Iは限りピペットその先端。第二シンナーピペットは、Type-Iピペットからそれぞれ人工脳脊髄液（ACSF）と色素溶液を吸引し、導入するために使用されます。 2。タイプ-Iピペットの位置決め解剖と脊髄の8,9を分離し、ロード·プロセスを通して冷やしたACSF（〜16°C）で灌流浴に入れてください。タイプ-Iは、そのバックの開口部が容易にフレキシブルチューブを介してシリンジ（1ミリリットルU-100インスリン注射器、ベクトン·ディッキンソンまたは同等の）に接続することができるように電極ホルダー（H1/12電極ホルダー、ナリシゲ）にピペット（PharMedを置くBPT、コール·パーマー、＃AY242002、10センチ）（図1A-B）。 3。染料のアプリケーション<ol><li>シリンジを使用して、最初の描画ACSFは、Type-Iにピペット（ 図1B、2A）は満たされるように軸索路またはルート（ 図2B）が続いている。フレキシブルチューブは、その後、開口部から削除する必要があります。タイプ-IIピペットは、別の注射器に接続されているとタイプ-Iは軸索路またはルートホールディングピペットに挿入されます。残留ACSFだけで軸索路（; 2C-D図1C）を覆うようにII型ピペット、吸引ACSFに接続された注射器を使用します。その後I型ピペットからタイプ-IIピペットを取り消すことができます。軸索管や神経（ &quot;良い印鑑&quot;のトラブルシューティングのセクション3を参照）で良好なシールを確認するために数分間ACSFレベルを監視します。 </li><li> ACSFの染料または再蒸留水で0.2％トリトンX-100を溶解させ、気泡を含まないように注意を払いながら、タイプ-IIピペットにそれを描画します。 I型ピペットに、残留ACSF溶液（ 図2E）に色素を含有するII型ピペットを挿入します。徐々に放出する穏やかな陽圧（ 図2F）を使用して、ACSFに染料。気泡を導入するか、先端の内側から標的組織の変位を引き起こすことがないように注意してください。染料のに十分な量（染料溶液の3-5μL）がリリースされた後、タイプ-IIピペットを取り消すことができます。 </li></ol> 4。インキュベーション実験の種類に応じて6〜20時間の間に暗闇の中で組織をインキュベートします。一度十分な時間が穏やかにイメージングまたは組織の準備ができて組織を残して組織から電極を引き離し、充填に許可されています。 トラブルシューティング<ol><li>標的組織は、Type-Iピペットの先端に簡単に入力するか、一度内部に緩んでいない場合は、先端径サイズが間違っています。この問題が発生した場合、引き出して、別のピペットを使用しています。 </li><li> I型ピペットにACSFに染料を追加する前に、十分なACSFは、それがで到達できるように残っていることを確認してくださいタイプ-IIピペットチップ（ 図2D）。染料が追加されると、それ以外の場合は、エアギャップが存在します。この問題が発生した場合は、染料を追加し、ピペットから軸索路を削除して、Type-IIにピペットで到達するのに十分なACSFでそれを戻って描画されません。 </li><li>タイプ-Iピペット増加ACSFのレベルは、それがタイプIIピペットで吸引した後なら、それは組織のシールが良好でないことを意味します。異なる電極を使用して、それ以外の色素が標識手順の中で希釈されます。 </li><li>染料を注入しながら気泡がType-Iピペットに導入されている場合は、バブルにType-IIピペットチップの近くを進めるゆっくりと付属のシリンジを用いて弱い負圧を印加することによって気泡を排出します。 </li></ol> 5。代表的な結果法の適用を説明するために、我々は同時にロード運動ニューロン、感覚求心性、3つの異なるDEXTと脊髄介在蛍光色素（ 図3A）結合を実行しました。 図2に示すように。ニューロンの3B、3つのクラスは、ラベルされています。感覚求心性（赤）、腹索（緑）と運動ニューロン（青）に突出介在。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" /> 図1。ピペットタイプ-IとType-IIアセンブリを示す模式図 。 （A）タイプ-Iピペット（ライトブルー）は（C）は背面の開口部が容易に柔軟なエラストマーチューブ（B）に接続することができていると先のType-IIにピペットを挿入することができるように電極ホルダーに配置されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" /> 図2。蛍光色素とニューロンのロード·プロセスを示す模式図 。 （A）タイプ-Iピペットを充填する前根の近くに配置されています。 （B）吸引は、ルートに続いてピペットにACSFを描画するためのピペットに適用されます。 （C-D）タイプ-Iピペットのバックエンドからの柔軟なエラストマーチューブを外し、タイプ-IIピペットに吸引を適用することにより、ACSFの量を減らすことができます。 （E）タイプ-Iピペット内の残りのACSFに溶解した染料を格納しているType-IIピペットの先端を挿入します。 （EF）を徐々に染料でI型ピペットを記入して、Type-IIにピペットを削除します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" /> 図3。孤立したマウスの脊髄への充填手順の適用 。私はタイプの異なる脊髄神経のクラスを塗りつぶすために使用されるピペット（A）の回路図は、3を示す。運動ニューロン（青、カスケードブルーデキストラン）と仙骨感覚求心性（赤、テキサスレッドデキストラン）をそれぞれ、腹側と背側根を通して埋めた。フルオレセインデキストランは、その軸索は腹索（VF）を介して登る脊髄介在（緑）をロードするために使用された。各デキストラン染料の1ミリグラム（10,000 MW、Molecular Probes社）トリトンX-100（B）0.2％を含む6μLの蒸留水に溶解した。標識された感覚の求心性はいくつかの反対側の突起を有する主に同側であることをAに説明したようにニューロンが戻って標識された脊髄の仙髄からセクションの共焦点画像は、注意してください。標識された介在は、塗りの側（矢印頭部）に反対であるのに対し、ラベルの付いた運動ニューロンは、充填前根と同側である。キャリブレーションバーは200μm。

<ol><li>Nance, D. M., Burns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextrans+as+sensitive+anterograde+neuroanatomical+tracers%3A+applications+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls.</a> Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).</li>
<li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextran-amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li>
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<li>Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+reduced+sensorimotor+connections+form+with+normal+specificity+despite+abnormal+muscle+spindle+development%3A+the+role+of+spindle-derived+neurotrophin+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3.</a> J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).</li>
<li>Mentis, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+impairment+of+sensory-motor+connectivity+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neuron. 69, 453-467 (2011).</li>
<li>Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+sacral+neurons+involved+in+activation+of+the+lumbar+central+pattern+generator+for+locomotion+in+the+neonatal+rodent+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Neurosci.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord.</a> Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+spatiotemporal+organization+of+neural+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord.</a> Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).</li>
<li>Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+patterns+of+vestibular-mediated+synaptic+inputs+to+axial+and+limb+motoneurons+in+the+neonatal+mouse+assessed+by+optical+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording.</a> J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).</li>
<li>Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt;私たちは、開示することは何もありません。</p

<p class="jove_content"&gt;ここでは神経細胞、神経や脊髄路に色素を導入するための簡単​​かつ費用対効果の高いプロトコルを記述します。このメソッドは、ロードプロセスの間、高濃度の色素溶液に識別解剖学的経路を公開することが含まれます。 microinjections、バス·アプリケーションおよびエレクトロポレーション法に比べて少し背景を持つターゲット·サイトの逆行性標識法で、この結果。しかし、この方法は、軸索の管を単離することができる神経系のサイトに制限されています。色素は細胞体に到達する軸索に沿って拡散するように見えるので、さらに、読み込み時間は、神経細胞体に色素を適用部位からの距離に依存します。少なくとも下<em&gt; in vitroで</em&gt;条件は、この軸索路の長さは数mmにメソッドを制限します。</p&gt;<p class="jove_content"染料ローディングのこのタイプの&gt;アプリケーションは、運動ニューロンの逆行性ラベリングと正常および変異マウスの感覚求心性の順行性標識を含む<sup&gt; 10,11</sup&gt;。さらに、それは感覚の求心性は、脊髄の中継介在そのプロジェクト腰椎セグメントの上に直接接触することを示すた...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td colspan="2"<strong&gt;材料名</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;<td<strong&gt;コメント</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="2"&gt;チューブ</td&gt;<td&gt; PE90（IDxOD：0.034 &quot;x0.050&quot;;壁Thikness：0.008 &quot;）</td&gt;<td&gt;クレイ·アダムスブランドIntermedic</td&gt;<td&gt; 427421</td&gt;<td&gt;タイプIとタイプIIピペット用</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NSF-51（IDxOD：1/16x1/8、壁Thikness：1/32）</td&gt;<td&gt; PharMed BPT、コール·パーマー</td&gt;<td&gt; AY242002</td&gt;<td&gt;フレキシブルチューブ用</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;シリンジ</td&gt;<td&gt; 1ミリリットルのインスリンシリンジU-100</td&gt;<td&gt;ベクトン·ディッキンソン</td&gt;<td&gt; 329650</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ニードル</td&gt;<td&gt; 19G X1-1/2 &quot;メタルハブニードル</td&gt;<td&gt; MONOJECT</td&gt;<td&gt; 200136</td&gt;<td&gt;シリンジにタイプIIのピペットを接続する</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;アルコールランプ</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;コック</td&gt;<td男性ルアースリップアダプタを搭載した&gt;三方活栓</td&gt;<td&gt;バクスターヘルスケア（株）</td&gt;<td&gt; 2C6241</td&gt;<td&gt;注射器を使用します。</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="3"&gt;ホルダー</td&gt;<td&gt; H-1電極ホルダー</td&gt;<td&gt;ナリシゲ</td&gt;<td&gt; H-1/12</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;マグネットスタンド</td&gt;<td&gt;ナリシゲ</td&gt;<td&gt; GJ-8</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;マニピュレーター</td&gt;<td&gt;ナリシゲ</td&gt;<td&gt; M-3333</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ピンセット</td&gt;<td&gt; S＆Tデュモンスイス00632から11</td&gt;<td&gt;デュモン</td&gt;<td&gt; JF-5 TC</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"&gt; *これらの提案した材料である。互換性のある任意の製品に置き換えることができます</p

神経、地帯、および蛍光色素で脊髄根の逆行ローディング

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

ニューロンの逆行性標識はまた、ニューロンの3月6日に、カルシウムや電位感受性色素をロードするために使用されている標準的な解剖学的方法1,2です。一般的に、色素が固体結晶として、あるいはガラスピペットを使用してローカルの圧力注入により適用されます。しかし、これはいくつかの時間が染料拡散するために必要な場合は特に、染料と還元の標識強度の希釈になる可能性があります。ここでは、色素溶液を充填したポリエチレン吸引ピペットを用いて神経細胞に蛍光灯やイオン感受性色素を導入するためのシンプルで低コストの手法を示しています。このメソッドは、ロード処理全体の軸索と接触している染料の高濃度を維持するための信頼できる方法を提供しています。

我々は、ニューロンまたはポリエチレン吸引ピペットを使用して、任意の神経管に蛍光カルシウム感受性色素を高濃度に導入するための簡単​​かつ低コストの手法を説明します。

ニューロンの逆行性標識は標準的な解剖学的手法であり1,2、カルシウム感受性色素および電位感受性色素をニューロンに導入するためにも用いられてきた3-6。

本手順の総合的な目的は、シンプルで低コストな手法を用いて、ニューロンまたは任意の神経路に高濃度の蛍光染料またはイオン感受性染料を導入することです。これは、まずタイプ1とタイプ2の2種類のピペットを作製することで達成されます。次に、タイプ1のピペットに柔軟なエラストマーチューブを接続し、正圧をかけて標的となる神経路をタイプ1のピペット内に吸い込み、良好なシールが形成されていることを確認します。次に、タイプ1ピペットの中にタイプ2ピペットを挿入し、タイプ2ピペットを用いてタイプ1ピペット内の残ったA CSFを吸引します。その後、気泡が入らないように注意しながら、染料をタイプ1ピペットに導入します。最後のステップとして、ニューロンを暗所で6〜20時間インキュベートします。最終的に、タイプ1ピペットを取り除いた後、調製物はin vitro、電気生理学的、または形態学的研究に使用可能な状態となります。バスアプリケーション、BOS注入、エレクトロポレーションなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、Dを特定のニューロン集団に送達できる点にあります。この手法は、特定のニューロンの活動、接続性、形態、および分布といった、神経科学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。一般的に、この手法には習熟が必要です。特に、タイプ1ピペット内で染料が希釈されないようにすることと、内部に気泡が入らないようにすることに注意してください。まず、アルコールランプの炎でポリエチレンチューブを加熱・延伸し、先端が細くなった2本の短いピペットを作成します。最初に、標的となる根や道管をしっかりと保持できる、先端の小さい短いタイプ1ピペットを作成してください。次に、タイプ1のピペットの先端まで挿入できる、より細長くシャフトが細いタイプ2のピペットを準備します。その後、タイプ2のピペットを19ゲージのECクリップ針に接続します。そして、単離した脊髄をバスに入れます。ローディングプロセス全体を通して、冷却したA CSFで超融合させます。その後、タイプ1ピペットを電極ホルダーに設置し、背面開口部がフレキシブルチューブを介してシリンジに容易に接続できるようにします。この手順では、まずシリンジを用いてタイプ1ピペットにCSFを吸い込みます。次に、充填する軸索路または根を描きます。その後、背面開口部からフレキシブルチューブを取り除きます。続いて、タイプ2ピペットを別のシリンジに取り付けます。それをタイプ1ピペットに挿入します。このピペットは、顕微鏡下で軸索路または神経根を保持しています。タイプ2ピペットに取り付けたシリンジを使用してA CSFを吸引し、残ったA CSFが軸索路をちょうど覆うようにします。その後、タイプ1ピペットからタイプ2ピペットを抜き取ります。軸索路または神経のシールが良好であることを確認するため、A CSFレベルを数分間モニタリングします。その後、色素をA CSFまたは二回蒸留水で調製した0.2%Triton X 100に溶解させます。気泡が混入しないように注意しながら、接続されたシリンジで弱い陰圧をかけて、タイプ2ピペットに色素を吸い込みます。次に、色素の入ったタイプ2ピペットを、タイプ1ピペット内に残っているA CSF溶液に挿入します。シリンジに緩やかな正圧をかけながら、色素をA CSF中にゆっくりと放出させます。この際、気泡を混入させたり、チップ内部の標的組織を移動させたりしないように注意してください。色素の注入中にタイプ1ピペット内に気泡が混入した場合は、タイプ2ピペットの先端を気泡の近くまで進め、付属のシリンジを用いて緩やかな負圧をかけることで気泡を吸い出します。十分な量の色素が放出された後、タイプ2ピペットを回収します。次に、実験の種類に応じて、組織を暗所で6〜20時間インキュベートします。充填に十分な時間をかけた後、組織から電極をゆっくりと引き抜きます。これで、組織はイメージングまたは組織学的解析に使用できる状態になります。ここでは、3種類の異なるコンジュゲート蛍光色素を、運動ニューロン、感覚求心性ニューロン、および脊髄介在ニューロンに同時に注入する方法を示す概略図を示します。運動ニューロンと仙髄感覚求心性ニューロンには、それぞれ腹根および背根を通じて Cascade blue Dextran と Texas red dextran を逆行性に注入しました。また、腹側索を介して上行する軸索を持つ脊髄介在ニューロンには、緑色蛍光dextranを注入しました。ここでは、ニューロンを逆行性に標識した仙髄切片の共焦点画像を示します。標識された感覚求心路は、主に同側に存在することに注目してください。少数の対側投射があるものの、標識された運動ニューロンは充填された腹根と同側にあり、一方で標識されたインターニューロンは、矢印で示されているように腹根と対側にあります。この手順に従い、DI領域のニューロンにおける機能的結合性、興奮性・抑制性、洞型、分布、および神経伝達物質の産生といった重要な疑問に答えるために、追加の手法を実施することができます。この技術は、脊髄および脳幹の神経生理学分野の研究者が、イオン感受性色素を用いて特定のニューロン集団を抽出することを可能にしました。このビデオを視聴することで、単離脊髄のニューロンおよび感覚繊維に蛍光色素またはイオン感受性色素を適用する方法について、十分に理解できるはずです。

retrograde-loading-nerves-tracts-spinal-roots-with-fluorescent

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神経科学

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出典:Wang, J., 他.Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing. J. Vis. Exp. (2021).

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親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。...

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

光活性化可能なニューロフィラメントタンパク質を発現するトランスジェニックマウス由来の末梢神経の単一ミリン化軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析する蛍光光活性化法について説明する。...

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

学ぶ ポリエチレン吸引ピペットを用いた脊髄根への蛍光・カルシウム感受性色素の逆行ローディング法。低コストで特定のニューロン集団に高濃度の色素を導入し、神経活動の可視化と機能解析を可能にする実験技術です。

神経、地帯、および蛍光色素で脊髄根の逆行ローディング

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