アレルギー性​​気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

この手順の目的は、マウスにおいてVal Boominで誘発したアレルギー性気道炎症の経過中に、肺樹状細胞（DC）の成熟および遊走を評価することです。まずVal Boominでマウスを感作させ、続いてfitsy標識Val Boominで気道を刺激することでこれを達成します。次に、肺および縦隔リンパ節を採取します。

最後に、肺およびリンパ節組織から単一細胞懸濁液を調製します。最終的に、FITC-Val Boomin投与後に縦隔リンパ節に見られるプルマンリード樹状細胞の成熟状態および絶対細胞数を、フローサイトメトリー分析によって評価できます。この手法は、樹状細胞が抗原曝露に伴って成熟するかどうか、またそれらが排液リンパ節に遊走するかどうかなど、肺の免疫応答に関する重要な疑問への回答に役立ちます。

そして、もし移行が起こる場合、その移行速度がどの程度であるかを確認します。まず、 freshly prepared Val Boomin溶液を、ボルテックスを用いてチューブ内のalumに1対1の割合で滴下して加えます。混合物を30分間撹拌し、その後、1 mLシリンジに混合物を0.2 mL充填します。

片手の親指と人差し指を使い、頭蓋底に近い首の皮膚を掴んでマウスを固定します。その後、もう一方の手でVal Boomin alum溶液をマウスの腹腔内に注入します。alum中のValの2回目の注入から7日後、alumで感作させ麻酔をかけた動物を直立状態で保持し、滅菌ピペットチップを用いて、調製したばかりのval in fxi溶液100 microlitersをマウスのNASに滴下します。

まず、20ゲージのカテーテルを1 mLのシリンジに取り付けます。次に、マウスの安楽死を確認した後、動物の胸腔を首まで完全に開き、マウスの気管を露出させてカニュレーションを行います。末梢血中に存在する汚染源となる肺胞マクロファージおよび単核球を完全に取り除くため、肺の洗浄および心臓の灌流を行うことが極めて重要です。

続く2つのステップは、慎重に、そしてもちろん、手を震わせないように行ってください。まず、氷冷したEDTA含有PBSをカテーテルから3回投与し、下気道を洗浄して肺胞腔から細胞を除去します。次に、20ゲージの針を装着した10 mLシリンジを用いて、心臓の右心室からヘパリン含有PBS 10 mLを肺に灌流させます。

肺の血管から残存する血球が完全に取り除かれると、肺が白色になります。次に、縦隔リンパ節を摘出し、別のディッシュに移します。組織への光照射を最小限に抑え、蛍光の消光を防いでください。

次に、灌流した肺を解剖してペトリ皿に入れ、ハサミを用いて肺を細切します。続いて、250 units/mLのコラゲナーゼDを用いて、37 °Cで肺組織を消化します。25分間インキュベートした後、混合液にEDTAを加え、5分間静置してコラゲナーゼ活性を停止させます。最後に、消化した肺の断片を100 µmのセルストレイナーに通し、低張緩衝液で赤血球を溶血させます。

細い針を用いて縦隔リンパ節を分離し、肺で行ったのと同様にコラゲナーゼで消化します。その後、腹腔内、感作、および気道への投与後の組織をセルストレーナーでろ過します。炎症細胞の存在は、対照群の代表的な肺切片におけるヘマトキシリン・エオシン染色によって評価できます。

生理食塩水で処置した動物では、上部の画像に示されているように、組織に炎症は見られません。対照的に、感作および処置を行った動物の肺切片では、下部の画像に見られるように、炎症細胞が全体に浸潤しています。また、下部の画像に示されているように、粘液産生を評価するには過ヨウ素酸シフ染色を用いることができます。

感作させたマウスにおけるvalのチャレンジ後の気道アレルギー性炎症の誘導は、粘液の存在によって確認されます。対照的に、上の図に示されているように、生理食塩水で処理したコントロールマウスでは粘液産生が完全に消失しています。valのチャレンジ後、肺のdcsは成熟し、続いて排出リンパ節へと遊走します。

ここにあるマウス縦隔リンパ節の代表的な解析結果から、生理食塩水投与マウスと比較して、Val Boominで感作および攻撃を行った動物では、CD 11 C陽性細胞の割合にわずかではあるが一貫した増加が認められます。さらに、感作および攻撃マウスの縦隔リンパ節におけるCD 11 C陽性、CD 11 B陽性、Val Boomin fits C陽性細胞の絶対細胞数の解析では、攻撃マウスにおいて生理食塩水投与動物よりもDC数が数倍高く増加していることがわかります。このビデオを視聴することで、肺樹状細胞の成熟および遊走を解析するための手法について十分に理解できるはずです。

この手法を十分に習得すれば、他の病原体やその他の実験的要因に対する肺樹状細胞の応答を評価するために、本手法を応用して修正することが可能です。