Name: アレルギー性気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学ぶ肺樹状細胞の成熟と移行の解析法。オバルブミン誘導アレルギー性気道炎症マウスモデルを用い、フローサイトメトリーでリンパ節への細胞動態を評価します。この手法は免疫応答メカニズムの解明に貢献します。

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この作品は、博士ジム胡にCIHRとCFカナダの補助金によっておよびCFカナダラーフルKushwahに授与博士課程の学生の身分によって資金を供給された。

1。オボアルブミンとマウスの作<ol><li> OVA（グレードV;シグマ、MO）の溶液を調製し、1 mg / mlの濃度で滅菌したPBS（溶液は-80℃で保存することができます）。 </li><li> OVA-ミョウバン混合物を調製するためには、チューブにミョウバンを取ると1:1の割合でチューブをボルテックスしながら滴下する方法でOVAソリューションを追加します。 30分間混合物を攪拌して混合した後すぐに使用します。 </li><li> 1 mlのシリンジを使用して、マウス腹腔内に混合物を0.2ミリリットルを注入し、2週間後に再度注入を繰り返します。 </li></ol> 2。 FITC標識アルブミンを持つマウスの鼻腔内チャレンジ<ol><li> 7日OVA-ミョウバンの第二の注入後、マウスはOVA-FITCを鼻腔内に挑戦する準備ができました。 </li><li> -80℃でアリコートでは1 mg / mlと店の濃度で滅菌したPBSを使用して、OVA-FITC溶液（シグマ）℃を準備します。 </li><li> 50mlファルコンチューブの底に、化学hの滅菌ガーゼを置くOODは、ガーゼの上にAerraneの5ミリリットルを追加します。マウスを麻酔するためには、約5〜10秒間チューブに動物を指示します。 </li><li>直立した状態で麻酔した動物を保持し、滅菌したピペットチップを使用して、ドロップダウン賢明な方法でマウスの鼻孔の上にOVA-FITC溶液を100μL添加します。 </li><li>次の二日間OVA-FITCと鼻の挑戦を繰り返します。 </li></ol> 3。肺と所属リンパ節からの単細胞懸濁液の調製<ol><li> Euthanylの腹腔内注射を使用してマウスを生け贄に捧げる。 </li><li> DC解析を複雑にする可能性がマクロファージの汚染を減らすために、肺洗浄​​が行われます。肺を洗浄するには、マウス気管を簡単にカテーテルと注射器を露出し、カニューレを挿入されています。5mMのEDTAを含む氷冷PBSを使用して、下気道が肺胞腔からセルを削除するには、3回洗浄されています。 </li><li> 10 U / mlの肝臓を含むPBS 10mlで肺を灌流心臓の右心室経由で、肺の血管から血液細胞を除去します。肺は血液細胞の大部分の除去を示す、白くなるまでperfusionsを実行します。これは、末梢血からの汚染細胞を除去することが特に重要です。 </li><li>肺を解剖し、縦隔リンパ節（MLN）を取り外し、別の皿のリンパ節を配置します。 （FITC蛍光の消光を防ぐために点灯する組織の露出を最小限に抑えるようにしてください。） </li><li>ペトリ皿に肺を置き、はさみを使用してミンチ。次の37℃で25分間、肺、消化°C、250 U / mlのコラゲナーゼD（Roche）を使用して、コラゲナーゼ活性を停止するには、次の5分間のEDTAを（10mMの最終濃度）を追加します。 </li><li> 100μmのセルストレーナーを通して消化され、肺の断片を渡すと、赤血球を除去するために低張性溶解を実行します。単一の細胞懸濁液は、DCのさらなる分析のために準備ができています。 </li><li> MLNから単一細胞懸濁液を調製するためには、t微細な針を使用してMLNを容易にし、セルストレーナーを通して緊張が続く上記のようにコラゲナーゼで消化する。 </li></ol> 4。成熟/移行を評価するためのDCマーカーの染色<ol><li>肺の樹状細胞を識別するために、染色のCD11cおよびCD11bのために実行されます。さらに、成熟のために評価するために、染色はDCが成熟するようにアップレギュレートされるCD86とCD80に対して実行されています。のCD11c + CD11bを+ OVA-FITC + MLN中の細胞をOVA気道チャレンジに応答して、肺からMLNへの移行肺樹状細胞として識別されます。 </li><li> FACS緩衝液（1％FBSおよび1mMのEDTAを含むPBS）、アリコートFACS染色のための細胞懸濁液/チューブ150μlの10×10 6細胞/ mlの濃度で細胞をサスペンドします。肺樹状細胞の同定については、次の汚れは、必要とされる。染色コントロール（OVA-FITCにさらされていないマウスから肺細胞）、OVA-FITC制御、CD11cは単一の制御、CD11bを単一の制御を、CD11bを+のCD11c +ダブル制御、CD11bを+ OVA-FITC +二重制御は、CD11c + OVA-FITC +ダブル制御、MHC II OVA-FITC +のCD11c + CD11bを+ MHCIIを染色し、単一の制御、CD86、単一の制御、CD80単一のコントロールとサンプル+ 、OVA-FITC +のCD11c + CD11bを+ CD86 +とOVA-FITC +のCD11c + CD11bを+ CD80 +。 </li><li> 、DCの移行を評価するMLNからの単一細胞懸濁液の絶対細胞数を実行し、その後、以下のチューブを準備するには、次のCD11c染色コントロール（OVA-FITCにさらされていないマウスからのMLN細胞）、OVA-FITC制御、+単一のコントロール、CD11bを+二重制御、CD11bを+ OVA-FITC +二重制御は、CD11c + OVA-FITC +ダブルコントロールおよびCD11c + CD11bを+ OVA-FITC +のサンプル。 </li></ol> 5。代表的な結果気道アレルギー性炎症を誘導するために腹腔内感作に必要な時間はポイントが重要であり、 図1に示すように実施すべきである。気道アレルギー性炎症の誘導を確認するために、腹腔内感作と気道のOVAチャレンジ後、いくつかのマウスを屠殺することができ、 図2に示すように、組織学的分析は、肺切片上で行うことができます。炎症性細胞の存在は、ヘマトキシリン·エオシン染色により確認することができる（ 図2A）と粘液産生の存在は、定期的な酸シッフ染色（ 図2B）によって評価することができる。完全にこれは、OVA感作マウス8のOVAチャレンジ後の気道アレルギー性炎症の誘導を確認します。対照的に、生理食塩水処置したマウスからの肺のセクションは任意の粘液産生の有無とともに、任意の炎症の自由になることが期待されている。さらに、以下のOVAチャレンジ、肺樹状細胞unde<html> rgo成熟および所属リンパ節への後続の移行。感作とOVAでチャレンジしたマウスからの縦隔リンパ節（MLN）におけるCD11c +細胞の解析は、生理食塩水で処置したマウス（ 図3A）と比較して、CD11c +細胞の割合が高いを示すことが期待されています。また、OVA感作とチャレンジしたマウスのMLNにおけるのCD11c + CD11bを+ OVA-FITC +細胞の絶対細胞数の解析は、生理食塩水処置したマウスからの対応という有意に高い（数倍高い、すなわち）のカウントを示すことが期待される（ 図3B）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig1.jpg" /> 図1。FITC標識した卵白アルブミン（OVA-FITC）と気道のチャレンジと一緒にマウスにオボアルブミン（OVA）誘発されるアレルギー性気道炎症の誘導のための実験プロトコル。 fig2.jpg &quot;/&gt; OVA気道チャレンジに続いて図2 OVA感作は、（A）に示すように、肺切片のヘマトキシリン·エオシン染色により同定などの気道アレルギー性炎症の誘導につながり、また、肺の過ヨウ素酸シッフ染色によって識別される気道の粘液産生につながる（B）に示すようにセクションを参照してください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4014/4014fig3.jpg" /> 図3。OVA-FITCの課題は、肺からの縦隔リンパ節（MLN）にDCへの移行を誘導する。 （A）フローサイトメトリープロットはコントロールまたはOVA感作マウスのMLNにCD11c +細胞の割合を描いた。 （B）生理食塩水またはOVA感作マウスのMLNでのCD11c + CD11bを+ OVA-FITC +細胞の絶対数。 * P &lt;0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4014/4014fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

<ol><li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dendritic+cells+in+the+induction+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Role of dendritic cells in the induction of regulatory T cells.</a> Cell Biosci. 20, (2011).</li>
<li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+of+dendritic+cell+subsets+and+their+function+in+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system.</a> Immunology. 133, 409-419 (2011).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+our+breath+away%3A+dendritic+cells+in+the+pathogenesis+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma.</a> Nat Rev Immunol. 3, 994-1003 (2003).</li>
<li>Hammad, H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+epithelial+cells%3A+linking+innate+and+adaptive+immunity+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 193-204 (2008).</li>
<li>Lloyd, C. M., Murdoch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerizing+allergic+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tolerizing allergic responses in the lung.</a> Mucosal. Immunol. 3, 334-344 (2010).</li>
<li>Herz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+murine+animal+models+to+study+the+development+of+allergic+bronchial+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The relevance of murine animal models to study the development of allergic bronchial asthma.</a> Immunol. Cell Biol. 74, 209-217 (1038).</li>
<li>Herz, U., Lumpp, U., Daser, A., Gelfand, E. W., Renz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+animal+models+to+study+the+central+role+of+T+cells+in+immediate-type+hypersensitivity+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Murine animal models to study the central role of T cells in immediate-type hypersensitivity responses.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 409, 25-32 (1996).</li>
<li>Nakae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+can+contribute+to+multiple+features+of+ovalbumin-induced+allergic+inflammation+of+the+airways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 119, 680-686 (2007).</li>
<li>Guth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+environment+determines+unique+phenotype+of+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung environment determines unique phenotype of alveolar macrophages.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 296, L936-L946 (2009).</li>
<li>Kushwah, R., Cao, H., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pulmonary+T+cell+response+to+helper-dependent+adenoviral+vectors+following+intranasal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of pulmonary T cell response to helper-dependent adenoviral vectors following intranasal delivery.</a> J. Immunol. 180, 4098-4108 (2008).</li>
<li>Kushwah, R., Oliver, J. R., Zhang, J., Siminovitch, K. A., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+dendritic+cells+induce+tolerance+in+mice+through+suppression+of+dendritic+cell+maturation+and+induction+of+antigen-specific+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic dendritic cells induce tolerance in mice through suppression of dendritic cell maturation and induction of antigen-specific regulatory T cells.</a> J. Immunol. 183, 7104-7118 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここで紹介する方法は、気道チャレンジOVA-FITCの配信に基づいて、肺樹状細胞を分析するためのフローサイトメトリーベースのアプローチを提供しています。これは、OVA-FITCを取ると、監視されているので、DC集団は、実質的にOVA誘発性アレルギー性​​気道炎症の過程で気道免疫応答に参加しているものである肺樹状細胞の選択的な監視が可能になります。コントロールマウスでは、アレルギー性​​気道炎症の非存在下で、MLNで識別された渡り鳥のDCの番号（OVA-FITC +樹状細胞）が大幅に増加、その結果アレルギー性​​気道炎症に反応して加速DC移行の基礎率の指標であるMLNにおけるOVA-FITC +樹状細胞の絶対数。分析は、より短い時間スパンで行われ、効率性/感度がはるかに大きいことができるので、説明する戦略は、従来の免疫染色/免疫ベースのアプローチ上の利点を提供しています。したがって、eであるの方法で説明したように、適切なコントロールは、フローサイトメトリー分析の際に採用されていることを保証するためにqually重要である。結果に影響を与えることができるもう一つのパラメータには、肺からの単一細胞懸濁液の調製である。したがって、ケアは、細胞の...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>オボアルブミン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A5503 </td></tr><tr><td>ミョウバン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 77161 </td></tr><tr><td> OVA-FITC </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A9771 </td></tr><tr><td>コラゲナーゼD </td><td>ロシュ社</td><td> 11088858001 </td></tr><tr><td>抗体</td><td>電子バイオサイエンス</td><td></td></tr></tbody></table>

アレルギー性​​気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

樹状細胞（DC）が抗原特異的T細胞を活性化することにより適応免疫応答の開始に関与する重要なプレーヤーである。 DCは、定常状態での末梢組織に存在していますが、抗原刺激に応答して、樹状細胞は、抗原を取り上げ、急速にそれらが抗原1,2に対するT細胞応答を開始する所属リンパ節に移行します。さらに、樹状細胞はまた、自己免疫などアレルギー性免疫応答3を開始するのに重要な役割を果たしている。 DCは、肺の環境4の設定に公差の免疫応答と誘導の両方の開始に重要な役割を果たしています。肺の環境では、環境抗原5の広大な配列への暴露により主に寛容です。ただし、一部の個体でアレルギーや喘息の誘発につながる耐性の休憩がある。本研究では、気道DCの成熟とMIGを監視するために使用することができます戦略を記述感作に用いた抗原に応答して配給。気道DCの成熟と移行の測定は、気道アレルギー性​​炎症時に免疫応答の動態の評価を可能にし、また根本的なメカニズムとともに、その後の免疫応答の大きさを理解する上で役立ちます。 我々の戦略は、増感剤としてオボアルブミンの使用に基づいています。オボアルブミン誘発性アレルギー性喘息は、気道好酸球増加、肺の炎症、喘息6,7中に見つかった上昇IgE値を再現するために広く使われているモデルです。感作後、マウスを取り込みオボアルブミン気道樹状細胞の特異的な標識を可能にFITC標識アルブミンの鼻腔内送達によって、求められています。次に、いくつかのDC特異的なマーカーを使用して、我々はこれらの樹状細胞の成熟を評価することができ、また、フローサイトメトリーを用いることにより、所属リンパ節への移行を評価することができます。

我々は、オボアルブミン誘発アレルギー性​​気道炎症の設定でオボアルブミンに反応して肺樹​​状細胞の成熟と移行を監視するための戦略について説明します。この戦略は、感染の設定で肺樹状細胞の遊走を評価するために変更することができます。

樹状細胞（DC）は、抗原特異的T細胞を活性化させることで適応免疫応答の開始に関与する主要な細胞である。DCは、...に存在している。

この手順の目的は、マウスにおいてVal Boominで誘発したアレルギー性気道炎症の経過中に、肺樹状細胞（DC）の成熟および遊走を評価することです。まずVal Boominでマウスを感作させ、続いてfitsy標識Val Boominで気道を刺激することでこれを達成します。次に、肺および縦隔リンパ節を採取します。最後に、肺およびリンパ節組織から単一細胞懸濁液を調製します。最終的に、FITC-Val Boomin投与後に縦隔リンパ節に見られるプルマンリード樹状細胞の成熟状態および絶対細胞数を、フローサイトメトリー分析によって評価できます。この手法は、樹状細胞が抗原曝露に伴って成熟するかどうか、またそれらが排液リンパ節に遊走するかどうかなど、肺の免疫応答に関する重要な疑問への回答に役立ちます。そして、もし移行が起こる場合、その移行速度がどの程度であるかを確認します。まず、 freshly prepared Val Boomin溶液を、ボルテックスを用いてチューブ内のalumに1対1の割合で滴下して加えます。混合物を30分間撹拌し、その後、1 mLシリンジに混合物を0.2 mL充填します。片手の親指と人差し指を使い、頭蓋底に近い首の皮膚を掴んでマウスを固定します。その後、もう一方の手でVal Boomin alum溶液をマウスの腹腔内に注入します。alum中のValの2回目の注入から7日後、alumで感作させ麻酔をかけた動物を直立状態で保持し、滅菌ピペットチップを用いて、調製したばかりのval in fxi溶液100 microlitersをマウスのNASに滴下します。まず、20ゲージのカテーテルを1 mLのシリンジに取り付けます。次に、マウスの安楽死を確認した後、動物の胸腔を首まで完全に開き、マウスの気管を露出させてカニュレーションを行います。末梢血中に存在する汚染源となる肺胞マクロファージおよび単核球を完全に取り除くため、肺の洗浄および心臓の灌流を行うことが極めて重要です。続く2つのステップは、慎重に、そしてもちろん、手を震わせないように行ってください。まず、氷冷したEDTA含有PBSをカテーテルから3回投与し、下気道を洗浄して肺胞腔から細胞を除去します。次に、20ゲージの針を装着した10 mLシリンジを用いて、心臓の右心室からヘパリン含有PBS 10 mLを肺に灌流させます。肺の血管から残存する血球が完全に取り除かれると、肺が白色になります。次に、縦隔リンパ節を摘出し、別のディッシュに移します。組織への光照射を最小限に抑え、蛍光の消光を防いでください。次に、灌流した肺を解剖してペトリ皿に入れ、ハサミを用いて肺を細切します。続いて、250 units/mLのコラゲナーゼDを用いて、37 °Cで肺組織を消化します。25分間インキュベートした後、混合液にEDTAを加え、5分間静置してコラゲナーゼ活性を停止させます。最後に、消化した肺の断片を100 µmのセルストレイナーに通し、低張緩衝液で赤血球を溶血させます。細い針を用いて縦隔リンパ節を分離し、肺で行ったのと同様にコラゲナーゼで消化します。その後、腹腔内、感作、および気道への投与後の組織をセルストレーナーでろ過します。炎症細胞の存在は、対照群の代表的な肺切片におけるヘマトキシリン・エオシン染色によって評価できます。生理食塩水で処置した動物では、上部の画像に示されているように、組織に炎症は見られません。対照的に、感作および処置を行った動物の肺切片では、下部の画像に見られるように、炎症細胞が全体に浸潤しています。また、下部の画像に示されているように、粘液産生を評価するには過ヨウ素酸シフ染色を用いることができます。感作させたマウスにおけるvalのチャレンジ後の気道アレルギー性炎症の誘導は、粘液の存在によって確認されます。対照的に、上の図に示されているように、生理食塩水で処理したコントロールマウスでは粘液産生が完全に消失しています。valのチャレンジ後、肺のdcsは成熟し、続いて排出リンパ節へと遊走します。ここにあるマウス縦隔リンパ節の代表的な解析結果から、生理食塩水投与マウスと比較して、Val Boominで感作および攻撃を行った動物では、CD 11 C陽性細胞の割合にわずかではあるが一貫した増加が認められます。さらに、感作および攻撃マウスの縦隔リンパ節におけるCD 11 C陽性、CD 11 B陽性、Val Boomin fits C陽性細胞の絶対細胞数の解析では、攻撃マウスにおいて生理食塩水投与動物よりもDC数が数倍高く増加していることがわかります。このビデオを視聴することで、肺樹状細胞の成熟および遊走を解析するための手法について十分に理解できるはずです。この手法を十分に習得すれば、他の病原体やその他の実験的要因に対する肺樹状細胞の応答を評価するために、本手法を応用して修正することが可能です。

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アレルギー性​​気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

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