Name: の分子機構のキャラクタリゼーション UVR誘発性白内障 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: 学ぶ紫外線誘導白内障の分子機構をラットモデルで定量的リアルタイムPCRと免疫組織化学を用いて解析する方法。白内障形成における細胞死メカニズムの理解に役立つ。

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sのOCH Drottning Viktorias Frimurarstiftelse：この作品は、カロリンスカ研究所KID-資金調達、スウェーデン放射線防護機関、カロリンスカ研究所アイ研究財団、ガンOCH BERTIL Stohnes Stiftelse、聖エリックの眼科病院研究財団、Ögonfonden、KonungグスタフVによってサポートされていました。

1。紫外線照射<ol><li>暴露前の15分には、腹腔内注射で90 mg / kgのKetalar（ケタミン）及び10 mg / kg Rompun（キシラジン）の混合物で雌Sprague-Dawleyラットを麻酔。 </li><li>ラットの拘束に動物を置き、トランクスクイズ13を発生させることなく、ラットの固定までベルトを締めます。 </li><li>散瞳を誘導するために、ラットの両眼にMydriacyl（トロピカミド）、10 mg / mlのを植え付ける。 </li><li>片目が半値全幅は10nmと300nmの14でUVRの狭いビームに対して位置決めされるように動物を置き、黒いテープで反対側の眼を遮蔽する。 </li><li> 15分15のための300 nmにおけるサブスレッショルド·用量1 KJ / m 2の UVR-Bに一方的にラットを公開します。 </li></ol> 2。解剖<ol><li>予め決められた露光後インターバル（1、5、24および120時間）の後、炭で6週齢のラット（体重&lt;200グラム）を犠牲にするn個の二酸化窒息と頸椎脱臼。 </li><li>摘出するの目。その後、後方側を、目の角膜を上にして置き。次に、強膜に非常に近いレンズの損傷を防ぐために、強膜に対して接線方向にパンチ27ゲージのカニューレを適用することにより、最小限の穴とプッシュ。その後、強膜の後部をオフに持ち上げることができるまで、ちょうど縁の後ろに周方向に切断するために眼科手術用はさみのペアを使用しています。その後、鈍湾曲したピンセットでレンズを持ち上げます。 </li><li> 5〜10分を超えない平衡塩溶液中でレンズを保持し、顕微鏡下でレンズ赤道から毛様体の残骸を削除。 </li></ol> 3。定量的RT-PCR <ol><li> 350μlのRA1の溶解緩衝液（NucleoSpin RNA IIの全RNA単離キット）および2mlのエッペンドルフチュー​​ブに3.5μLのβ-メルカプトエタノールのミックスにレンズを置きます。 </li><li>室温で30分間の間、このミックスでレンズを保管してください。 </li><li>レンズをホモジナイズレンズの唯一のハード核まで針がレンズ（皮質、レンズのカプセルが溶解バッファー中で溶解されている）から残っている。ミックスから核を取り除きます。 </li><li>ストアサンプル直ちに-70℃ </li><li>サンプルを解凍し、プロトコル &quot;培養細胞や組織からの全RNA精製&quot;（NucleoSpin RNA IIの全RNA単離キット）に従う。 </li><li>ストアRNAサンプル-70℃ </li><li> 2分間、95℃、40サイクルのステップ2：各試料からのDNAの十分な除去を確認するには、以下の条件（ステップ1でPCRを実行し95℃で20秒、55℃20秒、72℃ 20秒のC;ステップ3：7分72℃）、p53のDNA特異的プライマーを用いて、フォワード5&#39;-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 &#39;と逆方向5&#39;-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3&#39;およびTaq DNAポリメラーゼ（dNTPack）、製造によるプロトコル。予想されたPCR産物は、243塩基対である。 </li><li> 243塩基対のDNA特異的なPCR産物を検出するために、1.5％アガロースゲル電気泳動を実行します。準備するにはTBE緩衝液中で1.5％アガロースゲルはアガロースの3.75グラムを取るとTBEバッファー250mlにそれを解決する。臭化エチジウム（0.5 mg / ml）を1.5％アガロースゲル溶液500mlで500μlを添加する。マイクロ波オーウェンに、混合物を加熱してアガロースを解決するためにかき混ぜる。 </li></ol>試料はいずれも1.5％アガロースゲル電気泳動上の任意のDNA特異的なPCR産物を明らかにするために持っていません。 <ol start="9"><li> RNAサンプルの濃度（1μL）および260 nm（RNA）と光度計ND-1000分光光度計で280nmの（タンパク質）におけるサンプルの吸光度比を測定します。 RNAサンプルの吸光度のタンパク質に対する比のRNAが2.0以上である場合、RNAサンプルは純粋です。 RNAサンプルの吸光度比が2.0より低い場合は、RNA精製ステップ3.5をやり直してください。 </li><li>プロトコル第1ストランド cDNA合成キット（RT-PCRのための第1ストランド cDNA合成キット）に続く1μgに相当するRNAサンプルの音量を取ると、cDNAを合成。 </li><li> -20℃でcDNAサンプルを保存（期間1年以上とするため、-70℃で保存）。 </li><li> iCycler MyiQ単色リアルタイムPCR検出システムで、定量的リアルタイムPCRを実行します。負荷は、1μlのcDNA試料は、TaqMan遺伝子発現マスターミックス、カスパーゼ3のためのTaqMan遺伝子発現アッセイを96ウェルプレートに三連の指示を製造する方法。負荷は、1μlのcDNA試料は、TaqMan遺伝子発現マスターミックス、18sのためのTaqMan遺伝子発現アッセイを持つ別の96ウェルプレートにトリプリケート命令（のTaqMan遺伝子発現アッセイプロトコル）を製造する方法。直列3ランダムに選ばれた非露光レンズからのcDNAの一部を希釈します。 96ウェルプレート中のサンプルからのcDNAと共に希釈を実行します。 </li><li>結果の定量化のための標準曲線法を使用します。しきい蛍光におけるサイクル数はMyiQソフトウェアの測定として使用されます。キャリブレータの相対濃度の関数としてしきい値でサイクル数を表現する標準曲線は、esです各プレートで連続希釈用tablished。 3非処理レンズ試料からのcDNAは、キャリブレーションのために使用された。測定されたcDNAサンプルの相対濃度を得るために標準曲線と各サンプルのサイクル数のしきい値を関連付けます。最後に、cDNAの内部統制18Sに対するcDNAターゲットの相対濃度を関連付けることにより、標的遺伝子の発現レベルを取得します。 </li></ol> 4。免疫組織化学的染色<ol><li>固定<ol><li> PBS中目（; pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水）を解剖する。 </li><li> 20分間氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）で満たされたチューブに目を入れた。前日に4％PFAを準備します。 4℃で保存し、使用時まで。 PFAは、約1週間新鮮です。 </li><li>マイクロピペットでPFAを削除します。その後、20分間氷冷PBSで洗浄する。 </li><li> ℃で一晩4でスクロース30％で目を入れた。 </li><li> （10月）最適切削温度で満たさカップに目を入れて、媒体（ティッシュ- Tek社）。セクショニングの適当な位置に目を置いた。 </li><li>ドライアイスの上に、OCT-培地中で凍結する。 </li><li> -70℃で保存し、使用時まで。 </li></ol></li><li>セクショニング<ol><li>適切な平面にクライオセクショニングの目の位置を決めます。 </li><li>各レンズの中央部から35μm厚半ば矢状断面をカットします。異なるセクションの同じ核を染色避けるために順次セクションの間には、少なくとも6つのセクションを破棄します。 </li><li>セクションがカットされたら、そっとその上にスライドを配置します。セクションでは、スライドに固執する必要があります。 </li><li>使用前に空気乾燥にスライドしたままにします。必要になるまでスライドを-20℃で保存することができます。 </li></ol></li><li>蛍光免疫組織化学<ol><li>サンプルは室温（5〜10分）を達成しましょう​​。 </li><li> PAP-ペン（Invitrogen）を用いて試験片の周りにエッジを描画する。 </li><li>しばらく（10分）の境界線に乾かします。 </li><li>顕微鏡スライドラベルを付けます。 </li><li> 1に水分補給×Pを15分間のBS。 </li><li> 30分間の標準ブロック·ソリューションで透過処理。 </li><li>標準ブロック·溶液中で1:3,000に希釈し、一次抗体（セルシグナリングテクノロジー株式会社ウサギポリクローナル、切断カスパーゼ-3抗体Asp175 966​​1）を追加します。 </li><li>一晩4℃で加湿チャンバーに保管してください。 </li><li> （3×5分）、ピペッティングによりまたは大浴場（&gt; 15分、1月2日変更）中に浸漬することにより、PBS中で洗浄します。 </li><li>標準ブロック·溶液中で1:300に希釈した二次抗体（特定の吸収/発光スペクトルを持つ抗ウサギ二次抗体）を追加します。 </li><li> （3×5分）、ピペッティングによりまたは大浴場（&gt; 15分、1月2日変更）中に浸漬することにより、PBS中で洗浄します。 </li><li> PAPペンスメアを拭き取ってください。 </li><li> 3時間室温で加湿チャンバー内で保管してください。光への曝露を避ける。 </li><li> Vectashieldのドロップを追加して、スライドにカバースリップを置く。泡を作ることは避けてください。 </li><li> Vectashield硬化（〜20分）をしましょう​​。 </li><li>セクションI保つ分析するまでダークをn。 </li><li>すべての制御セクションは、一次抗体の非存在下で処理されます。 </li><li>蛍光顕微鏡下で数時間以内に結果を探してください。 </li><li>片側核船首から各レンズの反対側の核弓に上皮細胞の核を数える。青のすべての水晶体上皮核と緑におけるカスパーゼ3陽性核を見て二次抗体の放出に適合する標準フィルタを表示するには、標準の青のフィルタを適用します。 </li><li>すべての水晶体上皮核および陽性核の数を記録します。セクションごとに細胞を三回を数える。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brian, G., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract+blindness%3A+challenge+for+the+21+st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Cataract blindness: challenge for the 21 st century.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).</li>
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<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
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<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+limit+estimation+for+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%22">Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
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<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

<html>本稿では、UVR-B誘発白内障の間に発生する分子事象を研究する有効な方法について説明します。 生体 UVR誘発性白内障で使用可能なほとんどの情報がアルビノSprague-Dawleyラット7、16、17、18、19日の実験から得られたことを、考慮して、現在の研究ではアルビノSprague-Dawleyラットを使用することを決めた。ラットの年齢は6週齢であった。性別は男性とは対照的に、女性が少ないアレルギー尿を持っている、ので、女性に選ばれた。また、UVR誘発白内障20の重症度との関係で男女に違いはありません。 すべての動物は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って保管し、処理した。倫理的な権限はウプサラ動物実験倫理委員会は、プロトコル番号C 29/10から得られた。ラットは、商業ブリーダー（タコニック、デンマーク）から得られる。 テント&quot;&gt;狭UVRソースはUVRスペクトルうまく定義するため...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> Ketalar </td><td>ファイザー</td><td> 150086 </td><td> 50 mg / mlの</td></tr><tr><td> Rompun </td><td>バイエル</td><td> 022545 </td><td> 20 mg / mlの</td></tr><tr><td> Oculentumシンプレックス</td><td> Apoteket、スウェーデン</td><td> 336164 </td><td> 5グラム</td></tr><tr><td> Mydriacyl </td><td>アルコン</td><td> 00352 </td><td> 10 mg / mlの</td></tr><tr><td>平衡塩類溶液</td><td>アルコン</td><td> 0007950055 </td><td></td></tr><tr><td> 3.5 ulのβ-メルカプトエタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA IIの全RNA単離キット</td><td>マシュレ·ナーゲル社＆株式会社、デューレン、ドイツ</td><td> 740955.50 </td><td></td></tr><tr><td> p53のDNA特異的プライマー</td><td> biomers.net社</td><td>カスタムメード</td><td></td></tr><tr><td> Taq DNAポリメラーゼ、dNTPack </td><td>ロッシュ</td><td> 04 728 866 001 </td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド溶液0.5 mg / mlの</td><td>シグマ</td><td> E1385 </td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップND-1000分光</td><td>光度計の製品</td><td></td><td></td></tr><tr><td> RT-PCRのための第1ストランド cDNA合成キット（AMV） </td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス社</td><td> 11 483 188 001 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler MyiQ単色リアルタイムPCR検出システム</td><td>バイオ·ラッドラボラトリーズ</td><td></td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> 96ウェルプレート</td><td>ザルスタット</td><td> 72.1979.202 </td><td></td></tr><tr><td>のTaqMan遺伝子発現のマスターミックス</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> 4369016 </td><td></td></tr><tr><td>カスパーゼ3のためのTaqMan遺伝子発現アッセイ</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> Rn00563902_m1 </td><td></td></tr><tr><td> 18sのためのTaqMan遺伝子発現アッセイ</td><td>アプライドバイオシステムズ</td><td> Hs99999901_s1 </td><td></td></tr><tr><td> MyiQソフトウェア</td><td>バイオ·ラッドラボラトリーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>切断されたカスパーゼ-3（Asp175） </td><td>セルシグナリング技術</td><td> 9661 </td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG抗体</td><td>アブカム</td><td> Ab6798 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 84097 </td><td></td></tR&gt; <tr><td> Vectashield </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサル顕微鏡Axioplan 2イメージング</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 441244 </td><td></td></tr><tr><td> 10×TBEバッファー</td><td>プロメガ</td><td> V4251 </td><td></td></tr></tbody></table>

の分子機構のキャラクタリゼーション<emインビボ&gt;</em&gt; uvr誘発性白内障

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

白内障は、世界1の失明の主要な原因である。世界保健機関（WHO）は、光の伝達を妨げ、眼のレンズの混濁として白内障が定義されています。白内障は、糖尿病、喫煙、紫外線照射（UVR）、アルコール、電離放射線、ステロイドや高血圧に関連付けられている多因子疾患である。強い実験2-4および疫学的証拠は、UVR 5,6は白内障引き起こすことがあります。我々は麻酔7及び非麻酔動物8の両方でB UVR誘発白内障のための動物モデルを開発しました。 白内障のための唯一の治療法は手術ですが、この治療法はすべてにアクセスすることはできません。それは10年間の白内障の発症の遅延が50％9で白内障手術の必要性を減らすことができると推定されている。白内障の発症を遅延させるには、それは白内障形成のメカニズムを理解し、効果的な予防戦略を見つけるために必要とされるegies。白内障開発のためのメカニズムの中で、アポトーシスは、ヒトおよび動物10の白内障の開始に重要な役割を果たしている。我々の焦点は、最近白内障開発8,11,12するためのメカニズムとしてレンズのアポトーシスとなっています。これはアポトーシス経路上のUVRの効果の理解は白内障防ぐための新たな医薬品の発見の可能性を提供することが予想されます。 本稿では、実験的にUVR-Bへのin vivoでの暴露にによって誘導することができる方法白内障について説明します。さらにRT-PCR法と免疫組織化学は、UVR-B誘発白内障の分子メカニズムを研究するためのツールと​​して提示されます。

測定値の変動のさまざまな源は分散分析を用いて推定された、それは動物ごとに3つの測定値を考慮すると測定のための分散は動物のそれの15％のオーダーであることがわかった。したがって、レンズ全体の分析を考慮すれば、精度を向上させることはできません。直交テストは120時間の待ち時間の間隔対短い待ち時間間隔のカスパーゼ-3メッセージの統計学的に有意なコントラストを明らかにした。 生体 UVR曝露におけるカスパーゼ3の発現を誘導する。 <img alt="図1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4016/4016fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4016/4016fig1.jpg" /> 図1紫外線照射の流れの模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_uploa...

白内障は世界の失明の主要な原因である。太陽紫外線（UVR）は白内障開発のための主要な危険因子である。遠くUVR-B誘発白内障の動物モデルが開発されました。 UVR、定量的RT-PCR法と免疫組織化学への暴露：この記事では、白内障の調査のための方法を説明します。

の分子機構のキャラクタリゼーション<emインビボ&gt;</em&gt; UVR誘発性白内障

白内障は世界における失明の主要な原因です1。世界保健機関（WHO）は、白内障を眼の水晶体の濁りと定義しており、これにより...

このビデオでは、紫外線照射を用いてラットに白内障を誘発させる方法を実演します。その後、定量リアルタイムPCRおよび免疫細胞化学を用いて、白内障の発症に関与する分子メカニズムを解析します。まず、ラットの眼に紫外線を照射し、白内障の形成を誘導します。もう一方の眼をコントロールとして使用します。次に、レンズを解剖し、定量リアルタイムPCRによってCAS Bの発現レベルを評価するためにRNAを抽出します。また、活性型タンパク質の発現と局在を評価するために、切断型カスパーゼに対する抗体を用いて染色を行います。最終的に、これらのアッセイの結果から、UVRへの曝露後に水晶体細胞の核においてcaspase three mRNAの増加および活性型タンパク質の発現が確認されました。既存の手法に対する本プロトコルの主な利点は、独自の狭帯域UVR光源と汎用ラット固定具を使用していることであり、これにより、明確に定義されたUVスペクトルと線量を用いて、動物に安全かつ精密に曝露させることが可能になります。さらに、定量R-T-P-C-Rおよび免疫組織化学という現代的な生物学的手法を水晶体の apoptosis の研究に適用したことで、本手法は紫外線誘発白内障の分子メカニズムに関する情報を提供することができます。また、紫外線や放射線誘発性の皮膚がん、ラットの行動神経科学、およびアポトーシスに焦点を当てた実験的な眼研究などの他の実験モデルにも適用可能です。まず、麻酔をかけた雌のSprague Dawleyラットをラット用拘束器に配置し、体幹を締め付けすぎないように注意しながら、ラットが固定されるまでベルトを締めて、本プロトコルを開始します。瞳孔散瞳を誘導するために、10 mg/mLのtropicamide溶液を各眼に1〜2滴点眼します。その後、非照射眼に軟膏を塗布し、黒いテープで遮蔽してUVを遮断します。次に、高圧水銀ランプから発生する半値幅10 nm、波長300 nmの狭い紫外線ビームが、露出した眼に当たるように動物を拘束器に配置します。ラットの片眼を、UVRBの閾値下線量である1 kJ/m²で15分間照射します。非曝露眼からテープを取り除き、両眼に軟膏を塗布します。動物をケージに戻し、保温のために柔らかい紙で覆います。動物が胸腹臥位を維持できるまで十分な意識を回復するまで、観察を続けてください。その後、回復したラットを他の個体と一緒にケージに戻します。曝露後1、5、24、および120時間で観察を行います。安楽死させたラットから摘出した眼球を、角膜を下に、後方を上にして柔らかいペーパータオルの上に置きます。次に、解剖顕微鏡下で操作を行います。27ゲージのカニューレを使用し、強膜に接するように接線方向に押し込み、最小限の穴を開けます。この際、強膜に非常に近い水晶体を損傷しないように注意してください。次に、眼科手術用鋏を用いて、強膜後方を持ち上げることができるまで、角膜輪の両端に沿って円周状に切開します。その後、鈍端の曲型鉗子を用いて水晶体を持ち上げ、BSS（平衡塩溶液）に入れ、水晶体から毛様体 remnants を除去します。水晶体をBSSに浸しておく時間は10分以内にしてください。解剖後、350 µLのra、NucleoSpin RNA Two Total RNA Isolation Kitのライシスバッファー1および3.5 µLのBeamer keto ethanolを含む2 mLマイクロ遠心チューブに水晶体を入れます。室温で30分間インキュベートしてください。インキュベート後、針を用いて、硬い核だけが残るまで水晶体を機械的にホモジナイズします。水晶体の皮質と水晶体 capsule はライシスバッファーによって溶解されます。混合物から核を取り除き、廃棄します。サンプルは直ちに-70°Cで保存してください。準備が整うまで、サンプルは最大1年間保存可能です。キットの「培養細胞および組織からの全RNA精製」プロトコルに従って、サンプルを採取しRNAを精製します。RNAサンプルは-70°Cで保存してください。各サンプルからDNAが十分に除去されているかを確認するため、以下の条件でp53 DNA特異的プライマーを用いてDNAを増幅させます。ステップ1：95 °Cで2分間。ステップ2：以下を40サイクル繰り返す。95 °Cで20秒間。55 °Cで20秒間。72 °Cで20秒間。ステップ3：72 °Cで7分間。ランが完了したら、産物を1.5% AROSゲルで電気泳動します。243 base pairsのDNA特異的PCR産物を検出するため、必ずポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのサンプルを含めてください。DNAが正常に除去されていれば、PCR産物は検出されません。NanoDrop分光光度計を用いてRNAサンプルの濃度を測定し、RNAとタンパク質の比率を決定する場合、バンドはポジティブコントロールのレーンにのみ現れるはずです。RNAサンプルの吸光度のRNA/タンパク質比（260/280比）が2.0以上であれば、そのRNAサンプルは純粋であるとみなされます。次に、1 µgのRNAを用い、RT-PCR用一次鎖cDNA合成キットを使用してcDNAを合成し、cDNAサンプルを-20 °Cで保存します。続いて、定量的リアルタイムPCRを行うため、サンプルを96ウェルプレートに3連（triplicate）で分注します。各ウェルに、caspase 3用TACman遺伝子発現アッセイ用のマスターミックスと、1 µLのcDNAサンプルを混合して分注します（別のプレートを使用してください）。同様のサンプルを用いて、18s用TACman遺伝子発現アッセイを行います。次に、解析用の標準曲線を作成するため、ランダムに選択した非曝露水晶体から採取したcDNA 1 µLを段階希釈します。サンプルのcDNAとともに連続希釈系列を調製します。各プレートの96ウェルプレートにて行います。プレートを遠心し、その後iCycler iQシングルカラーリアルタイムPCR検出システムで解析します。走行後、IQソフトウェアを使用して、各プレートの連続希釈系列について、閾値におけるサイクル数をキャリブレーターの相対濃度の関数として表す標準曲線を作成します。この標準曲線を用いて、各サンプルの閾値サイクル数から測定されたサンプルcDNAの相対濃度を決定します。最後に、標的cDNAの相対濃度を内部標準の18 s cDNAに関連付けることで、標的遺伝子の発現レベルを決定します。免疫組織化学染色を行うには、眼球を摘出してPBSに入れ、その後解剖します。眼球を4%パラホルムアルデヒドを満たしたチューブに移し、氷上で20分間インキュベートします。マイクロピペットを使用して、パラホルムアルデヒドを除去します。次に、眼を1 mLの氷冷PBSが入った2 mLのエプンドールチューブに移し、氷上で20分間インキュベートします。その後、眼を30% sucroseが入ったエプンドールチューブに移します。4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、ピンセットを用いて眼球をOCT（最適切断温度）コンパウンドを満たしたカップに移します。切片作成のために、眼球をまっすぐな状態で固定します。その後、カップをドライアイス上に置き、蛍光顕微鏡による解析のための眼球切片作成まで-70 °Cで凍結保存します。まず、凍結切片作成のため、OCTに包埋した眼球をクライオスタットのチャック上に配置します。眼球のレンズの最も平らな面がナイフの刃先と平行になるように調整してください。各水晶体の中心部から、厚さ5 µmの中矢状切片を3枚作成します。異なる切片で同じ核を染色することを避けるため、連続切片の間には少なくとも6枚の切片を破棄してください。切片を作成したら、その上にそっとスライドガラスを置いてください。これで切片がスライドに固定されます。使用前にスライドを風乾させてください。スライドは、染色が必要になるまで-70 °Cで保存可能です。スライドを室温に戻します。その後、付属文書に記載されている方法で、切断型CAS phase threeを同定するための抗体染色を行い、数時間以内に蛍光顕微鏡下でスライドを観察します。すべての水晶体上皮細胞の核をカウントしてください。DAPI染色の細胞数をカウントしてすべての水晶体上皮核の数を記録し、活性型caspase-3陽性細胞をカウントしてcaspase-3陽性核の数を記録します。各切片につき、細胞のカウントを3回繰り返します。カスパーゼ3は、アポトーシスの実行段階における主要なプロテアーゼです。透過電子顕微鏡法。研究により、UVRが水晶体においてアポトーシスを誘発することが支持されています。アポトーシスに関する実験的研究により、caspase 3がアポトーシスの信頼性の高いマーカーであることが確認されています。in vivoでのUVR曝露がcaspase 3の発現を誘導するかを判断するため、300 nmのUVRを1 kJ/m²照射し、曝露後1、5、24、120時間における水晶体でのcaspase 3 mRNAの発現量をQPCRで測定しました。その後、曝露した水晶体と対側非曝露水晶体との間のCASP3 mRNAと18 S rRNAの平均比を、各時間点についてプロットしました。この図は、 caspase three mRNA の経時的な発現を示し、アポトーシスの転写を証明しています。遠紫外線（far UVR）の直交試験に曝露した後の水晶体における caspase three マーカーの in vivo 解析の結果、潜伏期間が 120 時間の場合と、それより短い潜伏期間の場合との間で、 caspase three mRNA シグナルに統計的に有意な差が認められました。また、曝露した水晶体と非曝露の水晶体における caspase three の発現が免疫蛍光顕微鏡法によって比較され、これらの画像に示すように、曝露 24 時間後に核が標識されており、活性型 caspase three の存在が示されています。この免疫染色法は、水晶体においてアポトーシスマーカーであるcaspase threeで標識された上皮細胞の空間分布に関する貴重な情報を提供します。このビデオを視聴することで、実験的にUVR白内障を誘導する方法、および定量的なRT-PCRと免疫組織化学を用いてUVR誘導白内障の分子メカニズムを研究する方法について、十分に理解することができます。

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学ぶ紫外線誘導白内障の分子機構をラットモデルで定量的リアルタイムPCRと免疫組織化学を用いて解析する方法。白内障形成における細胞死メカニズムの理解に役立つ。

の分子機構のキャラクタリゼーション

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