ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに

本実験では、外来遺伝子の発現が中脳の発達およびドーパミン作動性ニューロンの分化に及ぼす影響を調べるため、ニワトリ中脳へのin ovoエレクトロポレーション法について実演します。まず、ハンバーガー・ハミルトン（HH）ステージ11のニワトリ胚の中脳に、目的のプラスミドDNAを注入し、発達中の中脳胞に外来DNAを特異的に導入します。次に、特製の小型電極を用いて中脳胞にエレクトロポレーションを行い、中脳の神経前駆細胞に特異的に外来DNAを導入します。

次に、中脳で良好なM cherry発現が見られるステージ23の胚を回収し、最適な中脳横断切片を作成します。最終的に、チロシン水酸化酵素などのドーパミン作動性ニューロンマーカーを用いた免疫染色解析を行うことで、目的遺伝子の発現によって誘発された神経前駆細胞から成熟ドーパミン作動性ニューロンへの分化を確認できます。既存の他のin ovoエレクトロポレーション法に対する本手法の主な利点は、このプロトコルによって膜特異的なエレクトロポレーションが可能となり、中脳ドーパミン作動性ニューロンの分化を研究できる点にあります。

この手法は中脳の発達に関する知見を得るのに有用ですが、神経系の他の部位における運命地図解析や、遺伝子発現の調節に関する研究にも適用可能です。ハンバーガー・ハミルトン（Hamburger-Hamilton）ステージ11の胚を得るために、各受精卵を横向きに配置し、上部に鉛筆で印を付けます。その後、トレイをあらかじめ加温した加湿インキュベーター内のロッカーステアラーに設置します。

受精後41時間から24時間ごとに、湿度と水位を確認します。卵をインキュベーターから取り出し、室温で保存します。各卵の表面を70% ethanolで洗浄し、拭き取ります。

次に、4 cmのセロハンテープ2本を卵の上に並べて貼り、鉛筆の印の上に大きな長方形を作ります。テープを卵に密着させ、10 mLシリンジに18ゲージの針を取り付けてウィンドウを固定します。卵黄を乱したり胚を損傷させたりしないよう、針を卵黄から遠ざける角度で卵殻に刺します。

卵からアルブミンを5 mL分採取します。針を70% ethanolで洗浄してください。次の卵を穿刺する前に、針を乾燥させます。

フレイミングブラウン式マイクロピペットプラーの設定を入力します。次に、P 10ピペットを用いて、薄壁キャピラリーチューブをインジェクションニードルに引き伸ばします。ロングチップキャピラリーピペットチップに、5～10 µLのプラスミド溶液を吸い取ります。

次に、気泡が入らないよう、ガラス針にゆっくりと連続的な液柱を充填します。充填した針を、マイクロマニピュレーターとマイクロインジェクターに取り付けられたニードルホルダーにセットします。その後、解剖顕微鏡下で、針をより視認しやすくするために暗い背景を用い、緑色の液体が止まっている箇所でスプリングシザーを用いて針をカットします。

前の針穴から直径2～2.5cmの窓を開けます。これは白身を抽出するためです。卵を片手で回転させながら切断してください。

卵の操作の間には、70% ethanolを浸したキムワイプでハサミを拭き取ってください。解剖顕微鏡で雛胚を観察します。必要に応じて、雛胚の下にPBSで希釈した0.22 micrometerフィルター滅菌済みの20% India inkを注入し、胚を可視化します。針の進行方向と胚を平行にし、頭部が針から遠くなるように配置してください。

中脳後脳境界部において、神経管に45度の角度でゆっくりと刺入します。ピコスピリッツァー・マイクロインジェクターを用いて注入を開始し、持続時間を25 millisecondsに設定します。針の形状に応じて時間を調整し、Fast Green染料を含むプラスミドDNAを中脳に相当する神経胞にのみ充填してください。

注入針を回収した後、ペンストレップ溶液を3滴、胚の上に滴下します。効率的な電極導入を行うため、B-T-X-E-M-C eight 30 electroporの設定を確認してください。腹側中脳の位置において、特製の小型L字型白金電極を神経管の底部と同じ水平レベルに配置し、胚の中脳が2つの電極の中央に位置するようにします。

BTXフットスイッチを1回押し、電極の周囲に気泡が発生することを確認します。エレクトロポレーションが成功するたびに、電極を卵から慎重に取り出し、電極を拭き取ります。70% ethanolを浸したChemwipeを用いて、胚の上にペニシリン・ストレプトマイシン溶液をさらに3滴滴下します。

次に、5 cm × 5 cmの透明な梱包用テープで窓を覆います。卵の内容物に触れないようにして卵をしっかり密封し、回転機能をオフにしたインキュベーターに卵を戻します。目的のステージに達したら、条件ごとにPBSを満たした共通のペトリ皿に生存胚を回収します。

次に、蛍光解剖顕微鏡を使用します。回収した胚をスクリーニングしてm cherryの発現を確認し、陽性胚を24ウェルプレートの各ウェルに1つずつ移します。各ウェルに、調製したばかりの2%パラホルムアルデヒドを1 mL加え、4 °Cで3時間インキュベートします。

固定した胚をPBSで3回洗浄し、平衡化されるまで15% sucroseに浸します。同様の平衡化を30% sucroseで繰り返し、その後、各胚をOCTに包埋します。その後の解析に最適な中脳横断切片を作成できるよう、胚を適切に方向付けしてください。

胚鶏のin ovoエレクトロポレーションアッセイにおいて、後続の解析を行うため、肥大した中脳の18 micron厚のクライオスタット切片を作製します。ステージ11の鶏胚に、m cherry蛍光マーカー、目的遺伝子を含むプラスミドカクテル、および注入過程を追跡するためのfast green染色のトラッカーを注入します。中脳へのエレクトロポレーション後、胚をさらにインキュベートし、m cherry陽性の胚を回収して固定および包埋を行います。

次に、中脳の凍結切片を作成します。注入および電気穿孔が成功したニワトリ胚において、チロシン水酸化酵素などの中脳マーカーを用いた免疫染色によりサンプルを解析します。m cherryの発現を注入マーカーとして使用することで、さらなる発生後、通常は中脳領域にm cherryの発現が認められます。

m cherryが適切に発現している胚を固定、包埋し、中脳の凍結切片を作成するために方向を調整します。ここでは、m cherryおよびflagタグ付き遺伝子と、ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるチロシン水酸化酵素との共局在により、エレクトロポレーションを施した神経前駆細胞におけるドーパミン作動性運命の決定を検討します。このビデオを視聴することで、中脳領域への特異的なDNA構築物の注入方法や、小型の特製電極を用いたエレクトロポレーションのピンポイントな実施方法を含め、胚の中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞に遺伝子発現を局所的に制限する方法について十分に理解できるはずです。

RNI介在性ロックダウンや、レポーター遺伝子に連結したエンハンサーの発現などの他の手法を用いることで、神経系の特定の領域や細胞タイプにおける遺伝子機能および遺伝子調節を研究することが可能です。