として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成

本手順の全体的な目的は、均質化された不死化脳血管内皮細胞培養株を得ることであります。まず、新生子マウスから脳を単離し、単一細胞懸濁液を調製します。次に、ポリオーマ中間T抗原を用いて細胞を不死化させます。

次に、均一な内皮細胞単層が形成されるまで、細胞を約4週間培養します。最終ステップとして、免疫染色、ウェスタンブロット、およびQ-Q-P-C-Rなどの手法を用いて、新しい細胞株の特性評価を行います。この技術は、前臨床的な治療評価や病態生理学的知見を得られるため、神経炎症性または虚血性脳疾患の治療への応用が期待されます。

手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室のポストドクターであるElaine Salvador博士です。バッファーAを含むペトリ皿に移された生後3〜5日の新生マウスから脳を取り出します。ラミナーフローフード内で作業を行い、1回の調製につき5〜10匹分の脳を用意します。各脳から小脳、脳幹、髄膜、および毛細血管の断片を取り除きます。

次に、大脳をバッファーAを含む2枚目のペトリ皿に移します。滅菌済みメスを使用して大脳を細かく切り刻み、10 mLピペットで組織とバッファーを吸引・排出して、塊がなくなるまで均質化します。この時点で、脳組織を室温で250 ×gで5分間遠心分離した後、懸濁液を50 mL遠心チューブに移します。上清を捨て、ペレットを4.5 mLのバッファーAと1.5 mLの0.75% w/vに溶解させます。

コラゲナーゼを添加します。組織とコラゲナーゼ溶液を37 °Cのウォーターバスで、時々撹拌しながら45分間インキュベートします。その間に、12ウェルプレートの4つのウェルに0.1 mg/mLの滅菌溶液をコーティングし、組織培養プレートを準備します。

コラーゲンと 50 millimolar 酢酸を用いて、室温で1時間、コラーゲンをウェルに付着させます。45分間のインキュベーション時間が経過したら、15 milliliters の緩衝液Aを加えて脳組織の消化を停止させ、ペレットをこの溶液中で十分に再懸濁します。その後、250 times G で10分間遠心分離し、上清を捨てます。

次に、調製物からミエリンを除去するため、組織に10 mLの滅菌済み25% w/v B, s, A, およびPBSを加え、4°Cで1000 ×gで20分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に廃棄し、ペレットを15 mLのバッファーAに溶解して新しい50 mL遠心チューブに移し、室温で250 ×gで5分間再遠心分離します。その間に、コラーゲンIVコーティングプレートをPBSで2回洗浄します。

2回目の洗浄後、2つのウェルを空のままにし、残りの2つのウェルに2 mLの増殖培地を加えます。上清を廃棄した後、主に血管内皮細胞で構成される細胞ペレットを、4 µg/mLのピューロマイシンを含む4 mLの増殖培地で再懸濁し、その細胞懸濁液を2 mLずつ、空のコラーゲンコートウェル2つに播種します。急速に接着する非内皮細胞を死滅させるため、37 °Cで45分間インキュベートします。次に、細胞が入っていない2つのウェルから増殖培地を吸引して廃棄します。

次に、内皮細胞画分を含む、非接着細胞を含む培地をこれら2つのウェルに転送します。前のウェルに2 mLの新鮮な培地を補充します。これらのウェルには線維芽細胞やアストロサイトなどの他の細胞種が含まれており、並行して培養して形態の比較に使用できます。

翌日、細胞を組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。新鮮な培地と交換し、ポリオーマ middle T オンコジーンを含む複製不能ウイルスを分泌する GPE neo 線維芽細胞を、ゼラチンコートした GPE neo 培地入りフラスコで培養します。Polyoma medial T oncogene のトランスフェクションにより、非内皮細胞よりも内皮細胞に増殖上の優位性が生じ、内皮細胞の形態を持つ均一な単層細胞が得られます。4〜6週間の培養後、GPE neo 細胞は市販されていませんが、共有の公的材料として入手可能です。

GPE Neo Fiberblastを24時間培養した後、培地を10 milliliters除去し、最終濃度が8 micrograms/milliliterになるように滅菌済みのpoly brain solutionを添加します。上清混合液を0.45 micronフィルターに通し、細胞断片を除去します。次に、血管内皮細胞培養物から培地を吸引し、ウェルに上清poly brain混合液を2 milliliters添加して、一晩インキュベートします。

翌日に、新鮮な上清ポリ脳混合物のアリコートを用いて、この手順を繰り返します。上清ポリ脳混合物を取り除きます。細胞をPBSで2回洗浄し、その後、新鮮な増殖培地を添加します。

細胞がコンフルエントになるまで3日ごとに培地交換を継続し、コラーゲンIVコートプレートに1〜2回継代します。安定した脳血管内皮細胞株は、通常4〜5週間の継続培養後に得られます。

均一な血管内皮細胞の単層がウェル全体を覆った状態にします。安定した細胞株が得られたら、コラーゲンIVをコーティングした組織培養フラスコに移行させ、3 mLのトリプシンEDTAを用いて37 °Cで5〜15分間、細胞層が分散するまでインキュベートし、トリプシン処理による継代は週に1回までにとどめてください。5 mLの培地を添加した後、新しいフラスコに播種し、分割比が1:4を超えないようにしてください。

T 75フラスコがコンフルエントになるまで十分な細胞が得られたら、後で使用するために細胞の凍結保存ストックを調製します。そのために、前述と同様にトリプシンで細胞を回収し、細胞懸濁液を250 ×gで5分間遠心分離します。室温で、細胞ペレットを6 mLの凍結培地で再懸濁し、細胞懸濁液1.5 mLを4本のクライオバイアルに分注します。

クライオバイアルをイソプロパノールを満たしたNalgene凍結容器に入れ、-80 °Cで1日間保持します。最終的に、クライオバイアルを液体窒素下で保存します。細胞のクライオクアッドをウォーターバスで融解し、10 mLの増殖培地を含む15 mL遠心チューブに移します。

培地を37°Cに予熱し、チューブを室温で250×gにて5分間遠心分離します。培地を吸引した後、ペレットを適切な量の増殖培地で再懸濁します。細胞懸濁液を、予熱した増殖培地と共にコラーゲンIVでコーティングしたT25細胞培養フラスコに移します。

播種時の細胞密度は、少なくとも1×10⁴ cells/mLである必要があります。翌日に培地を交換し、これまでと同様に継代を続けてください。約5日後に細胞がコンフルエントに達し、準備が整ったら、以降の実験で必要となる所定の密度で細胞を播種します。C end細胞は、内皮マーカーおよび血液脳関門マーカーの免疫染色によって特性評価が行われました。

この画像は、clain 5で免疫染色したC and細胞の形態を示しています。C and細胞は、増殖抑制を示す密に詰まった細長い細胞の単層を形成しており、脳ECSの初代培養と同様の形態をしています。完全なコンフルエンスに達した状態で、細胞は検出可能なレベルのclainを発現していました。

ここでは、C CN細胞をオクルディンに対する抗体で免疫染色しています。また、免疫蛍光染色により示されているように、細胞間接合部に局在するVEカドヘリンタンパク質の発現が確認できます。経内皮電気抵抗は、電流通過電極と電圧測定電極を含むアセンブリを用いて測定しました。

この図から、C end細胞の経内皮電気抵抗は、分化後の培養時間とともに増加することがわかります。この技術により、神経科学分野の研究者がマウスモデルを用いて脳血管障害を探索する道が開かれました。