リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離 in vitroで mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

この手順の全体的な目的は、無細胞翻訳系で翻訳されるmRNAにおける主要な翻訳停止部位を特定し、その位置を明確にすることです。これは、まず目的の遺伝子をT7転写プロモーターの制御下にクローニングし、続いてmRNAを転写および精製することによって達成されます。

次に、mRNAと放射性アミノ酸の存在下でin vitro翻訳を行い、合成されたタンパク質と新生ポリペプチドを標識します。最後に、沈降速度遠心法を用いてポリソームを単離し、単離した新生鎖をゲル電気泳動で分離します。最終的に、Tristine SDS pageおよびオートラジオグラフィーによって、異なる長さの新生ポリペプチドを示す結果が得られ、これにより目的のmRNA上のポーズサイトの存在が示されます。

マイクロコカル核保護アッセイのような既存の手法と比較した本手法の主な利点は、極めてシンプルで迅速かつ効率的であることであり、特定の細胞系における任意のmRNAに沿った主要な翻訳後部位の決定および同定を可能にすることです。本手法は、コドン使用頻度、tRNA量、あるいはmRNA二次構造などの要因が翻訳速度にどのように影響するかといった、翻訳および翻訳共伴タンパク質折りたたみ分野における重要な疑問のいくつかに答えるのに役立ちます。さらに、本手法は翻訳速度と共翻訳タンパク質折りたたみ経路における重要なステップとの関係についての理解を深める一助となると考えられます。

本手法の意義は、in vivoにおけるタンパク質折り畳みのプロセスの理解へと広がります。タンパク質の折り畳みは、主にリボソーム上での翻訳中に共翻訳的に起こると信じられていますが、本研究では市販の細胞抽出液を用いたgamma bicrystallineの無細胞翻訳を用いています。また、この手法は、あらゆる細胞源から調製された翻訳能を有する抽出液を用いることで、実質的にあらゆるタンパク質の翻訳後修飾部位（translational IDE）の特定に適用可能です。一般的に、本手法を初めて行う方は、プロトコルの2つの重要なステップで苦労することが予想されます。

一つ目は、翻訳反応に要する全時間を設定することであり、これにより新生ポリペプチドの大部分がリボソームに結合した状態に留まるようにします。二つ目は、新生ポリペプチドの大部分を分離するための適切な調整システムを見つけることであり、調整システムの選択は研究対象となるタンパク質のサイズに依存します。私たちは、80年代半ばに、グロビン分子の共翻訳折り畳みの提案モデルに関連して、グロビン分子の翻訳キネティクスを検討することにした際に、初めてこの手法を考案しました。

グロビンの翻訳の不均一性は、1974年にPROとMauriceがグロビンNASおよび鎖のサイズ排除CLOクロマトグラフィーを用いた際に初めて注目されました。しかし、彼らの分析では望ましい精度が得られず、Proとmoreはグロビンの翻訳中に4つの主要な翻訳ポーズサイトが観察されることを見出しました。その後、我々の分析によって約10箇所の追加のポーズサイトが明らかになり、グロビンの翻訳に伴う折り畳みの詳細なモデルを構築することができました。ここで述べる手法にはポリソームの単離およびTris-SDS PAGEゲルを用いた新生ポリペプチドの分析が含まれるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。

これらのステップは、高品質で再現性のある結果を得るために極めて重要です。デモンストレーションを行うのは、Myelo研究室の大学院生であるSujataです。メッセンジャーRNAのin vitro転写について説明します。まず、適切な制限酵素を用いてT7および/またはSP6プロモーターの下流にクローニングされた目的遺伝子を用意し、ストップコドンおよび/またはmRNA 3'末端の下流でDNAテンプレートを線状化します。

DNAが完全に直鎖状になっていることを確認するため、制限酵素消化した試料をアガロースゲル電気泳動に供します。最適なDNAテンプレート濃度を決定した後、製造元の指示に従い、転写キットを用いてメッセンジャーRNAをin vitro転写します。次に、塩化リチウム沈殿法を用いてmRNAを精製します。

次に、アクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動を用いて純度を確認します。ヌクレアーゼフリー水を用いて、1 mM アミノ酸混合物（メチオニンを除く）、10 units の RNA インヒビター、20 µCi の放射性 35 S メチオニン、およびウサギ網状赤血球ライセートを添加し、100 µL のインビトロ翻訳反応液を調製します。続いて、反応液を 30 °C で 5 分間インキュベートして予熱します。

次に、2 µgのmRNAを加え、30 °Cで5分間インキュベートして反応を停止させた後、氷上に置いてリボソームに結合した新生ポリペプチドを単離します。翻訳反応液を、KClおよびMgCl₂を含む30% glycerol Tris-HCl（pH 7.6） 4.5 mLの上に重層し、TLA 110ローターを備えた遠心機を用い、4 °Cで100,000 ×g、1時間遠心分離します。続いて、上清を慎重に取り除き、新生ポリペプチドを含むポリソームペレットを、0.5 mg/mLのリボヌクレアーゼAを含む1 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.6）の少量で再懸濁し、37 °Cで30分間インキュベートします。

ペプチドの加水分解およびtRNAエステル結合の切断を促進するため、反応液に最終濃度10 millimolarとなるように水酸化ナトリウムを添加し、さらに30分間インキュベートします。生成したポリペプチドをtris-tris SDS-PAGEで分離し、ゲルを固定して乾燥させます。その後、ゲルをオートラジオグラフィーにかけ、続いてホスホイメージングを用いて生成したポリペプチドを検出します。

tRNAプールの変化によって誘発されるリボソーム移動の変調は、翻訳中に蓄積する新生ポリペプチドのサイズ分布、およびここでの一時停止時間を反映する相対強度に変化をもたらすはずです。γ-クリスタリンBタンパク質の新生ポリペプチドを単離し、Tristine SDS-PAGEによって分離しました。RRL系とE. coli系におけるポリペプチドの長さと強度が一致しないことは、これら2つの系におけるmRNA上のリボソーム移動が、異なる翻訳キネティクスに従っていることを示しています。

例えば、ウサギ網赤血球溶解系には存在せず、e coli 溶解液にのみ見られる顕著な 17.7 kilodalton のバンドに注目してください。Gamma B crystalline には、哺乳類システムでは頻繁に見られるものの、e coli では極めてまれであり翻訳速度が遅いことが知られているアルギニンのタンデムコドンが存在します。このことは、ここに示されているように、これらのタンデム希コドンにおけるリボソームの停止がこのバンドの原因であることを示唆しています。

mRNAが存在しない場合にはバンドは観察されず、ピューロマイシン処理によってポリソームから新生鎖の大部分が除去されます。さらに、ピューロマイシンによる長時間の処理ですべての新生鎖が除去されることから、観察されたポリペプチド産物は、ポリソームと共に共沈降したMRPではなく、リボソーム結合新生鎖であることが確認されます。この手法を習得すれば、1〜2日で完了させることができます。手順に要する時間は、主に遠心分離ステップと新生ペプチドのゲル電気泳動ステップの時間に依存します。

この手順を行う際は、インキュベーション時間終了後、直ちに翻訳反応を停止させることが重要です。リボソームからの新生ポリペプチドの遊離を防ぐため、いかなる段階においてもRNAの混入を避けることが極めて重要です。RNAが混入すると、抽出液の翻訳効率に影響を及ぼし、本手順に従った後のリボソームからの新生ポリペプチドの遊離を招く可能性があります。

例えば、特定のメッセージにおけるリボソーム移動の効率に対するmRNA結合タンパク質の影響など、他の目的についても、本手法の開発後に検証することが可能です。この技術は、タンパク質折り畳みの分野の研究者が、翻訳における希少コドンの存在に起因する翻訳ポーズ（一時停止）の役割を探索する道を切り拓きました。また、本手法は以前に、メッセージ上のリボソーム移動および翻訳タンパク質折り畳みにおけるコドン置換の役割を検証するために用いられました。

このビデオを視聴することで、リボソームに結合した新生ポリペプチドを単離することにより、提示されたmRNAの翻訳能部位を特定する方法について十分に理解できるはずです。放射性同位体や、例えば [35S]メチオニンのような標識アミノ酸を取り扱う際は特別な予防措置が必要であり、本手順を実施する際には常に留意してください。