感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Lycoネガティブストランド、RNAウイルス。インフルエンザウイルスのゲノムは、ウイルス肋骨核タンパク質複合体(VR NPS)の形でパッケージ化されており、一本鎖ゲノムが核タンパク質によってカプセル化され、PA PB OneおよびPB 2サブユニットからなるターメリックポリメラーゼ複合体と結合して、感染した哺乳動物細胞から無傷の複合体を精製します。Hela細胞は、組換えストレプトタグ付きインフルエンザウイルスとインキュベートされます。

ウイルスが細胞に入ると、ウイルスRNAは感染後に核内で合成され、細胞は界面活性剤を使用して嘘をつき、遠心分離とアサルトベースのクロマチン画分プロトコルを使用して細胞質核画分とクロマチン画分に分画されます。最後に、硬化したタグ付きVRPは、精製されたVR NPSのタンパク質およびRNA組成の各フラクション分析から銀染色によってアフィニティー精製され、このプロトコルを厳密に使用してもクロマチン結合VRPを単離できることを示しています。全き。したがって、アフィニティー精製インフルエンザウイルス肋骨核タンパク質複合体の標準的な方法と比較した場合、当社のプロトコルの主な利点の1つは、当社の方法を使用することで、インフルエンザウイルスのmRNA合成部位として知られている感染細胞のクロマチンからVR NPSを精製できることです。

したがって、私たちの方法は、たとえば、どのウイルスまたは細胞因子だけでなく、たとえばウイルスmRNA合成またはウイルスゲノムRNA合成にどの翻訳後修飾が必要かなど、ウイルスの複製と転写の制御を取り巻く質問に答えるために使用できます。そのため、この方法に不慣れな研究者は、亜核分画が生化学的条件に非常に敏感であり、細胞株によっても大きく異なる可能性があるため、いくつかの困難に直面する可能性があります。このプロトコルは、インフルエンザウイルス、RWSN PB two strepに感染した細胞を癒すことから始め、これは、3つの感染の多様性でPB 2サブユニットのC末端に遺伝的に融合した連鎖球菌タグを持っています。

細胞を冷たいPBSで一度洗浄してから、12ミリリットルの冷たいPBSを加えて皿から取り出します。ゴムスクレーパーを使用。細胞を50ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離によりペレット

この手順の最も難しい側面は、細胞分画プロトコルです。細胞核は均質化や混合手順に非常に敏感であり、それを誤って実行すると、クロマチン抽出物を簡単に台無しにする可能性があります。そのため、ここで示すように、均質化技術だけでなく、ライセートの一般的な取り扱いも行うことが非常に重要です。

スピン吸引液に続いて、PBSおよびResusは、細胞ペレットを10ミリリットルの冷ショ糖緩衝液に懸濁します。200マイクロリットルのピペットチップを10ミリリットルのプラスチック製血清ピペットに取り付け、細胞を通過させて細胞の塊をバラバラにします。懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。

定期的に細胞を穏やかに反転させて再懸濁します。次に、0.5%の最終濃度に非IET P 40を添加し、高速で15秒間渦巻き、直ちに卓上遠心分離機で摂氏4度でGの3、500倍Gで10分間遠心分離します。スピン後、仰臥位を取り外し、15ミリリットルから円錐形のチューブに移します。

すりおはしゅうを摂氏4度で保存します。これは細胞質画分です。ここに示すように、ペレットは元の細胞ペレットよりも小さく、白くする必要があります。

プロトコールが後で完了する場合は、細胞ペレットを摂氏4度で保存してください。それ以外の場合は、ペレットを5ミリリットルの冷たいショ糖、緩衝液で洗浄し、前と同じように遠心分離します。スピンが完了したら、仰臥位を廃棄し、核を含むペレットを1.5ミリリットルの冷たい核プラズマ抽出バッファーに再懸濁します。

再懸濁したペレットを、ぴったりとフィットする乳棒を備えた冷却した全ガラス製4ミリリットルダンスホモジナイザーに移し、20回のストロークで核を均質化します。泡立ちを避けると、抵抗は約10回のストロークで増加するはずです。効率的な均質化を確認するには、位相差顕微鏡でサンプルを検査します。

原子核はもはや丸くなく、不規則な形をしており、破裂したように見えます。核が均質化されたら、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。ホモジネートを回転ホイール上で摂氏4度で20分間インキュベートします。

次に、マイクロ遠心分離機で 16 、 000 倍の G で 4 °C で 10 分間遠心分離します。スピン後、核プラズマ画分である仰臥位を1.5ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で保存します。次に、リースはペレットを1.5ミリリットルの消化液に懸濁し、摂氏37度に予温した緩衝液を緩衝します。

次に、フラクションを摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、42マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムを加えて、塩化ナトリウムの最終濃度を150ミリモルにし、氷上で20分間インキュベートします。摂氏 4 度のマイクロ遠心分離機で 16 、 000 回、G で 10 分間遠心分離します。

紡糸後、スーピネートを取り出し、摂氏4度で保管します。これがCHの50分数です。リースは、ペレットを1.5ミリリットルの冷たい高塩緩衝液で曲げ、氷上で20分間インキュベートします。

16, 000回、Gを摂氏4度のマイクロ遠心分離機で10分間遠心分離します。スピン後、サップナタントを取り出し、摂氏4度で保管します。これはCH500の分数です。

分画プロトコル中に保存されたフラクションを取り出し、氷の上に置きます。次に、細胞質画分に、300マイクロリットルの5モル塩化ナトリウムを加えます。次に、100マイクロリットルのSpheroビーズに詰められた連鎖球菌Tをフラクションあたり15ミリリットルのコニカルチューブに移します。

10容量の連鎖球菌洗浄バッファーをビーズに加えます。チューブを反転させて混合し、1000回で5分間遠心分離します。G卓上遠心分離機で、スナを捨てます。

緩衝液の洗浄を2回繰り返し、次にリースは等量の連鎖球菌洗浄緩衝液でペレットを曲げ、各画分にビーズスラリー中の洗浄された連鎖球菌法の200マイクロリットルを追加します。チューブを摂氏4度で1時間回転させます。次に、チューブを摂氏4度のGの1000倍で1分間遠心分離し、仰臥位を廃棄します。

次に、15ミリリットルのチューブ内で細胞質画分とインキュベートしたビーズのビーズに1ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。洗浄バッファーを添加し、ビーズを1.5ミリリットルのチューブに移します。ビーズを1分間洗浄し、その後、チューブをGの1000倍、摂氏4度で1分間遠心分離します。

最後の洗浄ステップの後に2回繰り返します。平らなピペットチップを使用して、洗浄バッファーの痕跡をすべて取り除きます。次に、100マイクロリットルのelucianバッファーを追加し、チューブを穏やかに混合して氷の上に15分間置きます。

インキュベーション中は、チューブの底を軽くたたいてビーズを時々混ぜます。15分後、遠心分離機は摂氏4度でGの1000倍で1分間選択するために通過しました。溶出された連鎖球菌タグ付きVRPを含むSennaを回収します。

彼、私たちの細胞をインフルエンザウイルス株、WSNに9時間感染させ、分画されたライセートをここに示すようにウエスタンブロッサムによって分析しました。穏やかな核分離により、チューブリンなどの細胞質タンパク質を効率的に抽出し、豊富な核タンパク質の放出を回避します。低塩で抽出されたクロマチン画分には、転写に重要なタンパク質が豊富に含まれていることに注意してください。

高塩分画は、溶出された細胞質画分のタンパク質組成を決定するために主にヌクレオソームを含有するが、タグなしウイルス、RWSN、またはRWSN PBに9時間感染したR細胞からのV NPSを、細胞質溶出液について示されるように銀染色により分析した。ここでは、NPとPA PB 1、PB 2の比率が高く、55キロダルトンを超えるメジャーバンドが95キロダルトンから100キロダルトンまでのバンドと比較して証明されており、ほとんどの連鎖球菌PB2が完全に形成されたVRNPの一部として精製されていること、言い換えれば、相対収率を比較するためにほとんど可溶性ポリメラーゼが捕捉されないことを示唆しています。この銀染色ゲルvRMPに示されているように、RWSN、PB、2つの連鎖球菌、またはRWSN、または銀で染色されてから9時間後に精製されたVR NPSは、感染の9時間後に4つの細胞画分すべてから精製できます。

v RMPの最高濃度は核質に見られますが、かなりの部分も細胞質とクロマチンから精製できます。このビデオを見れば、感染細胞の核から無傷のインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体を高収量で精製する方法を十分に理解できるはずです。この手順を実行する際には、クリーンなバッファーを使用し、サンプルを不必要に室温にさらさないようにすることが重要です。これにより、RNAとタンパク質の両方の分解を回避し、タンパク質複合体の分解を回避できるからです。

また、感染性インフルエンザウイルスを扱うことは危険な場合があることも忘れてはいけません。すべてのステップは、NP 40がライセートに追加されるまで、バイオセーフティレベル2のワークベンチの下で実行する必要があります。