HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

本手順の目的は、heca形成に依存する2つの手法を用いて、任意の細胞株におけるC型肝炎ウイルス（HCV）複製サイクルの完了に対する制限因子の影響を調査することです。まず、ヒト肝細胞ならびにHeal AおよびHep 56 1Dパッケージング細胞を培養します。次に、エレクトロポレーションによりC型肝炎ウイルスまたはHCV RNAを肝細胞に導入します。その後、2番目の融合法として、ポリエチレングリコールを用いてHCV複製細胞株をそれぞれのパッケージング細胞株に融合させます。最初のステップは、高タイターのHCVストックを調製することです。

その後、異なる細胞株を共培養し、プロトタイプフォーム状ウイルス糖タンパク質をトランスフェクションして細胞融合を誘導します。次に、これらのヘテロカリオンにHCVを感染させます。どちらのヘテロカリオン形成方法においても、蛍光顕微鏡観察により融合を確認し、感染性粒子の産生量を定量します。

この手法の主な利点は、HV特異的なドミナント制限因子の発現について、多くの細胞株および初代細胞のパネルをスクリーニングするのに有用であることです。この方法は、HCVの種特異性とゲノムに関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。ポリエチレングリコールによる細胞融合を誘導する前に、2つの融合システムの基礎となる概念を理解しやすくするためには、この方法を視覚的に実演することが極めて重要です。

HUH 7.5細胞に標準的なプロトコルに従ってHCV RNAをトランスフェクトし、37 °C、5% CO₂条件下で24時間培養します。翌日、サブゲノムレプリコンを保持するトランスフェクト済みHUH 7.5細胞、およびHuhR細胞とHep56.1Dパッキング細胞を回収します。これらのパッキング細胞は、HCVタンパク質のcore、E1、E2、p7、およびNS2を異所性に発現するように構築されています。トリプシン処理後、細胞をDMEM完全培地で再懸濁し、細胞懸濁液を以下の濃度に希釈します。HUH 7.5細胞は5 × 10⁵ cells/mL、HuhRおよびHep56.1D細胞は2 × 10⁵ cells/mLとします。

次に、各ウェルに2〜3枚の滅菌済みガラスカバースリップを入れた6ウェル培養プレートを用意します。融合効率をさらに分析するため、トランスフェクションしたHUH 7.5細胞1 mLとパッケージング細胞1 mLを混合し、6ウェルプレートの1つのウェルに播種して、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で24時間インキュベートします。24時間後、細胞密度を確認してください。

細胞膜が融合するために細胞同士が近接している必要があるため、細胞融合を誘導する前の細胞密度は、共培養において60～80%のコンフルエンシーである必要があります。共培養細胞から培地を吸引し、1 mLのPBSで1回洗浄します。次に、あらかじめ温めておいた40%ポリエチレングリコール（PEG 1,500）を500 µL慎重に加えます。対照群として、別の共培養細胞のウェルに500 µLのPBSを加えます。37 °Cで5分間インキュベートして、ヘテロカリオン形成を誘導します。PEGを吸引し、2 mLのPBSを慎重に加えます。1分後にPBSを吸引し、2 mLの新鮮なPBSを加えます。過剰なPEGを除去するため、1回1分間の洗浄をPBSで3～5回繰り返します。

最後に、各ウェルに2 mLのDMEM完全培地を加え、37 °C、5% CO2で48時間インキュベートします。融合から48時間後、各SNATを回収し、0.45 µmのフィルターでろ過します。細胞培養上清を回収した後、融合効率を免疫蛍光法により決定できます。ガラスカバースリップの入ったウェルを、1 mLのPBSで1分間、1回洗浄します。

PBSで希釈した3%パラアルデヒド 600 µLを用いて、細胞を15分間固定します。PBSで1分間×3回の洗浄を行い、最後の洗浄後に、ピンセットを使用してカバースリップを24ウェルプレートに慎重に移します。PBSで希釈した0.5% Triton X 100 500 µLを用いて、細胞を5分間透過処理します。

続いてPBSで3回洗浄し、各ウェルに一次抗体溶液を250 µLずつ添加します。抗NS5a抗体を0.5 µg/mLの濃度で、ヒトモノクローナル抗E2抗体を6.4 ng/mLの濃度で使用してください。室温で45分間インキュベートし、45分後、PBSで3回洗浄します。

次に、各ウェルに250 µLの二次抗体を加えます。二次抗体には、Alexa Fluor 546またはAlexa Fluor 488を標識したgoat anti-mouseまたはgoat anti-human IgG特異的抗体を2 µg/mLの濃度で使用します。室温・暗所で30分間インキュベートします。30分後、PBSで1回洗浄します。

続いて、PBSで1:3000に希釈したDPI 250 µLを用いて細胞核を染色します。室温・暗所にて1分間インキュベートし、PBSで4回、水で1回洗浄します。最後に、顕微鏡スライド上のFlora Mountの一滴の上にカバーガラスを裏返してマウントし、暗所で乾燥させます。

本手順を開始するために、以下の細胞を回収し、単一細胞懸濁液を調製します。内因性CD 81の発現を欠損したLuna NAヒト肝細胞株、HeRパッケージング細胞、およびヒトCD 81を安定的に発現するHep 56 1D細胞。Luna N細胞をHeR細胞と1:1の比率で、またHep 56 1D hCD 81細胞と1:2の比率で共培養し、12ウェルあたりの総細胞密度を1.5 × 10⁵ cellsにします。

翌日、37°C、5% CO₂条件下で24時間インキュベートします。製造元の指示に従い、Lipofectamine 2000を用いて、高度に発現させるPFEエンベロープタンパク質を細胞に一過性 transfection します。PFE糖タンパク質の transfection から30時間後、あらかじめ調製したウイルスストックを MOI 約2.3で350 µL加え、ヘテロカルノンに接種します。

翌朝、37°C、5% carbon dioxideの条件下で12時間インキュベートします。PBSで1回洗浄し、各ウェルにDMEM完全培地を1 mL加え、37°C、5% carbon dioxideで48時間インキュベートします。48時間後、ヘテロカリオン培養液の上清を回収し、0.45 micronフィルターでろ過します。次に、前日に96ウェルプレートに播種したHUH 7.5細胞に、限界希釈法を用いてこの上清を接種します。感染性子粒子産生量を定量する前に、72時間インキュベートします。

融合イベントを可視化する手順は、共培養の6時間前までに完了させる必要があります。接着細胞を5 mLのPBSで1回洗浄し、次に10 cmディッシュあたり4 mLの適切なDI溶液を加えます。細胞を37 °C、5% CO2条件下で45分間インキュベートします。細胞を5 mLのPBSで1分間、1回洗浄し、その後DMEM完全培地を加えます。播種前に37 °C、5% CO2条件下で6時間インキュベートします。12ウェルプレートの各ウェルにカバースリップを加え、その後、前述の方法に従って播種、トランスフェクション、および細胞染色を行います。トランスフェクションの30時間後に、細胞を1 mLのPBSで1分間慎重に洗浄し、次いで250 µLの3%パラホルムアルデヒドを用いて室温で15分間固定します。

細胞を1 mLのPBSで1分間1回洗浄し、その後、PBSと水でそれぞれ1回ずつ洗浄した後、dappyで1分間染色し、カバーガラス、サングラス、スライドをマウントして、HCV複製サイクルの完了に対する制限因子の影響を調査する最初のアプローチを行います。ヘテロカロンにおいて、HUH 7.5細胞にルシフェラーゼ・トランスジーンおよびHCV非構造タンパク質を発現するサブゲノムレプリコンをまず一過性に導入し、次いでHCV構造タンパク質coreおよびアクセサリータンパク質を発現する細胞株と共培養および融合させました。代表的な結果をこの図に示します。細胞は、E2構造タンパク質およびNS5A非構造タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて免疫染色されています。

上段のパネルの画像は、PEGで処理するとMS five AとD twoの両方のシグナルが同一の細胞質内で同時に検出されたことを示しており、自己融合が起きたことを示唆しています。対照的に、下段のパネルでは、共培養細胞をPBSで処理した場合には融合が誘導されなかったことを示しています。したがって、シグナルの共局在は見られませんでした。ヘテロカリオンから産生されたウイルスの感染力を定量化するため、融合誘導から48時間後に共培養物から上清を回収し、その後のルシフェラーゼアッセイのために未感染のHUH 7.5細胞に接種しました。

このグラフには、3回の独立した実験の平均値が表示されています。灰色の水平バーは、非感染のHUH 7.5細胞で測定された相対発光単位（RLU）のバックグラウンドを示しています。注目すべき点として、HUH 7.5複製細胞を未感作細胞株と融合させた場合、またはコントロールとしてPBSで処理した場合、培養液中に感染性は検出されませんでした。

しかしながら、PEGによってHUH 7.5レプリコン細胞とパッケージング細胞との間で細胞融合を誘導したところ、感染性ウイルス粒子が培養液中に放出されました。これは、ウイルスの産生に細胞融合とパッケージング細胞におけるウイルス蛋白質の発現が必要であることを示しています。驚くべきことに、HUH 7.5ヒト肝細胞がん細胞のヘテロカロンだけでなく、ヒト非肝細胞およびマウス肝細胞とのヘテロカロンにおいてもウイルスの放出が認められたため、アセンブリと放出は、これらの細胞種における潜在的な制限因子によって支配的に抑制されているわけではないことが示唆されました。別の手法として、細胞の培養後に原子的糖蛋白質の発現により体細胞融合を誘導しました。

共培養および遺伝子導入の前に、個別の細胞株をセルトラッカー色素で染色することでヘテロカリオンを可視化しました。遺伝子導入の30時間後に細胞を固定しDPIで染色し、その代表的な結果を本図に示しています。2種類の細胞の融合は、ここで示されているように、細胞質内に色素が均一に分布したヘテロカリオンによって示されます。対照的に、下段の画像では、二重染色された細胞質を持つ細胞が存在せず、細胞融合が起きていないことが示されています。

この最後のグラフは、すべてのHCV侵入因子が、ヒトCD 81を発現するhela細胞またはHep 56 1D細胞とともにLuna N細胞を持つヘテロキャリアにおいてのみ発現していることを示しています。ここでは、培養液に感染性HCV粒子を接種しました。48時間後に培養液を回収し、未感作のHUH 7.5標的細胞を用いた限界希釈法により、ヘテロキャロンからのde novo粒子放出を測定しました。3回の独立した実験の平均値を表示しており、灰色の水平バーは本アッセイの検出限界を示しています。

コントロールとして、lunar N細胞同士を融合させたところ、感染性HCVのレベルは検出限界に近い極めて低い値となりました。lunar N細胞をnaive HEP 56 1D細胞と融合させた場合にも、同様の結果が得られました。どちらの場合も、ヒトCD 81が欠損していたため、HCVはヘテロカリオンに効率的に感染することができませんでした。

対照的に、lunar 10細胞およびhuman CD 81を発現するHEP 56 1D細胞と融合させたlunar hand細胞では、アッセイのバックグラウンドを約10倍上回る感染性ウイルス子粒子のde novo産生が観察されました。これは、HCVがRetroCars内で複製サイクルを正常に完了したことを示しており、これらの細胞株においてドミナントな制限因子の発現がないことを証明しています。習得すれば、適切に実施することで全実験工程を1週間で完了させることが可能です。

このビデオを視聴することで、考えられるHCV制限因子の特定に向けたヘテロキャリオンの作製方法について十分な理解を得ることができます。C型肝炎ウイルス（HCV）を取り扱うことは極めて危険であるため、この手順を実行する際は、高度なバイオセーフティなどの予防策を常に考慮することを忘れないでください。