Name: HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 49 s
Description: 学ぶHCV制限要因の探索法。ヘテロカリオン形成を用いて2つの細胞融合技術で、感染性ウイルス産生を阻害する優性制限要因を発見し、HCV複製サイクル完了への影響を解析します。

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我々は、それぞれ、JFH1とJ6CF分離株のTakaji脇田とイェンス·ブフに感謝しています。さらに我々は、チャールズホ-7.5セルのライスと9E10抗体、E2特異的抗体CBH-23のスティーブンFoung、および実験的ウイルス学、有用な提案や議論のためのTwincore学科のすべてのメンバーに感謝します。

<ol><li>Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+hepatitis+C+virus+subgenomes+in+nonhepatic+epithelial+and+mouse+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells.</a> J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).</li>
<li>Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhepatic+cell+lines+HeLa+and+293+support+efficient+replication+of+the+hepatitis+C+virus+genotype+2a+subgenomic+replicon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon.</a> J. Virol. 79, 592-596 (2005).</li>
<li>Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+subgenomic+replicons+in+the+human+embryonic+kidney+293+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line.</a> J. Virol. 78, 491-501 (2004).</li>
<li>Date, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+2a+hepatitis+C+virus+subgenomic+replicon+can+replicate+in+HepG2+and+IMY-N9+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).</li>
<li>Chang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+hepatitis+C+virus+%28HCV%29+RNA+in+mouse+embryonic+fibroblasts%3A+protein+kinase+R+%28PKR%29-dependent+and+PKR-independent+mechanisms+for+controlling+HCV+RNA+replication+and+mediating+interferon+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities.</a> J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).</li>
<li>Zhong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).</li>
<li>Lindenbach, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309, 623-626 (2005).</li>
<li>Wakita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat. Med. 11, 791-796 (2005).</li>
<li>Witteveldt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD81+is+dispensable+for+hepatitis+C+virus+cell-to-cell+transmission+in+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells.</a> J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).</li>
<li>Bitzegeio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+hepatitis+C+virus+to+mouse+CD81+permits+infection+of+mouse+cells+in+the+absence+of+human+entry+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors.</a> PLoS Pathog. 6, e1000978(2010).</li>
<li>Lindemann, D., Goepfert, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+foamy+virus+envelope+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The foamy virus envelope glycoproteins.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).</li>
<li>Brohm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+determinants+important+for+hepatitis+C+virus+p7+function+in+morphogenesis+by+using+trans-complementation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation.</a> J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).</li>
<li>Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+trans-encapsidation+of+hepatitis+C+virus+RNAs+into+infectious+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.</a> J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).</li>
<li>Koutsoudakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+early+steps+of+hepatitis+C+virus+infection+by+using+luciferase+reporter+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses.</a> J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).</li>
<li>Frentzen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completion+of+hepatitis+C+virus+replication+cycle+in+heterokaryons+excludes+dominant+restrictions+in+human+non-liver+and+mouse+liver+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines.</a> PLoS Pathog. 7, e1002029(2011).</li>
<li>Lindemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+particle-associated+glycoprotein+signal+peptide+essential+for+virus+maturation+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity.</a> J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).</li>
<li>Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+permissive+cell+lines+for+subgenomic+and+genomic+hepatitis+C+virus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication.</a> J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).</li>
</ol>

TPはバイオテストから顧問料を受け取った。

我々は、HCVの複製を妨げるドミナントネガティブ制約の分析のために培養細胞におけるヘテロカリオンの形成を誘導する2つのメソッドを紹介します。これらの手順を使用して様々なヒト非肝臓およびマウス肝臓細胞株における支配的な恒常的に発現またはウイルス誘発因子の存在を除外した。制限要因は感染症の子孫のHCVアセンブリと放出を防止する場合、最初のアッセイでは、主に分析しています。このケースではパッケージング細胞はHCVレプリコン細胞に融合されているので、パッケージング細胞で発現可能な制限要因は、すでにウイルスRNAの高い負荷を持っている細胞の細胞質へのアクセスを取得します。したがって、ウイルスRNAの翻訳がなされたもので、多くの生産的なHCV複製複合体は、HCVの翻訳およびRNA複製の可能性の制限を検出するためのチャンスを減らすため、確立されている。実際には、これらの細胞におけるレプリコンRNAの高負荷は、その身分を示す証明を妨げる可能性があり、また、HCVアセンブリおよび/またはウイルス因子によって飽和によるリリースのための制限要因の検出を妨げる可能性があります。この制限を回避するために、我々はHCVの細胞のエントリのみがヘテロカリオンで ​​達...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> 41965-039 </td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> 11140-035 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> PAA、コルベ、ドイツ</td><td> A15151 </td></tr><tr><td> α-E2（CBH23） </td><td>親切にスティーブンFoung 10が提供する</td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td>シグマ、シュタインハイム、ドイツ</td><td> A2833-106 </td></tr><tr><td>グルタチオン</td><td>シグマ、シュタインハイム、ドイツ</td><td&gt; G4251-1G </td></tr><tr><td>ブラストサイジン</td><td> Invivoゲン、サンディエゴ、アメリカ合衆国</td><td> ANT-BL-1 </td></tr><tr><td> G418（ゲネチシン） </td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> 11811-064 </td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール-1500 </td><td>ロシュ、マンハイム、ドイツ</td><td> 10783641001 </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>ロス、カールスルーエ、ドイツ</td><td> 0335.3 </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>ロス、カールスルーエ、ドイツ</td><td> 3051.2 </td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>シグマ、シュタインハイム、ドイツ</td><td> G9023-5mLの</td></tr><tr><td> α-NS5A（9E10） </td><td>親切にチャールズ·ライス7が提供する</td><td></td></tr><tr><td> DAPI（4 &#39;、6&#39;-ジアミジノ-2 - フェニルインドール二塩酸塩） </td><td>インビトロジェン</td><td> D1306 </td></tr><tr><td>アレクサ·弗素546 - ヤギ抗ヒトIgG </td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> A21089 </tD&gt; </tr><tr><td>アレクサ·弗素488 - ヤギ抗マウスIgG </td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> A10680 </td></tr><tr><td>リポフェクタミン2000 </td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> CellTracker CMTMR </td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> C2927 </td></tr><tr><td> CellTracker CMFDA </td><td>インビトロジェン社、カールスルーエ、ドイツ</td><td> C2925 </td></tr><tr><td> Fluoromount </td><td>シグマ、シュタインハイム、ドイツ</td><td> F4680-25ML </td></tr><tr><td>他のすべての化学物質</td><td>ロス、カールスルーエ、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養材料</td><td>ザルスタット、Nümbrecht、ドイツ</td><td></td></tr></tbody></table>

hcvの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

C型肝炎ウイルス（HCV）は、ヒトとチンパンジーに制限宿主域を持つ肝炎ウイルスです。 HCV RNAの複製は、人間の非肝臓およびマウス細胞株で観察されているが、効率が非常に低く、HCVレプリコンを使用して、必要な長期的な選定方法については支配的な抗生物質選択マーカー1-5を発現して構築します。 in vitroでの研究で HCVしたがって、ウイルスのライフサイクルのウイルスのエントリと終了を許容するヒト肝癌細胞株に限定されています。狭い種の指向性をHCVsのため、完全なHCV複製サイクル6-8を維持使用可能な免疫小動物モデルは存在しません。マウス由来の例えば、非ヒト細胞中のHCVの非効率的な複製は、おそらく本質的なホストの依存因子および/または制限因子の発現の遺伝的不和合性の欠如によるものである。 我々はHCVの伝播が支配的な制限FAによって抑制されるかどうかを調べた非肝組織から、またはマウスの肝臓細胞株の由来のヒト細胞株のいずれかでctors。この目的のために、我々は、体細胞融合に頼るつの独立した条件付きのトランス相補方法を開発した。両方のケースでは、ウイルス複製サイクルの完了は、ヘテロカリオンでのみ可能です。その結果、感染性のウイルス子孫の de novoの生産を測定することによって決定される成功したトランス相補性は、支配的な制限がないことを示します。 具体的には、ルシフェラーゼ遺伝子を運ぶサブゲノムHCVレプリコンは非常に寛容なヒト肝癌細胞（ホ-7.5細胞）にトランスフェクトした。その後、これらの細胞は共培養し、HCV構造タンパク質コア、エンベロープ1および2（E1、E2）とアクセサリータンパク質P7とNS2を表現する種々のヒトおよびマウス細胞に融合させた。細胞融合は、ポリエチレングリコール（PEG）で処理することにより開始されている限り、文化は、感染性ウイルスのPAを発表受容体に依存する形でナイーブ細胞に感染rticles。 セルのエントリ、RNAの翻訳、複製およびウイルスのアセンブリを含む完全なウイルスのライフサイクル上の支配的な制限の影響を評価するために、我々は、CD81の内因性発現を欠いているヒト肝細胞株（ホ- 7 Lunet N細胞9）を利用したHCVの本質的な侵入因子。異所的に発現CD81の欠如では、これらの細胞は、HCV感染症の10〜本質的に難治性である。重要なのは、共培養し、少なくとも別の重要な細胞侵入因子（すなわち、SR-BI、CLDN1、OCLN）ヒトCD81が不足して発現する細胞と融合させたときにのみ、結果としてヘテロカリオンは、感染症のために必要なHCVエントリー因子の完全なセットを表示します。したがって、主要な制限因子はHCVの複製サイクルの完了を抑制するかどうかを分析するために、我々は、上記のcritを満たすヒトとマウスの原点からの様々な細胞でLunet N個の細胞を融合ERIA。共培養細胞は、プロトタイプの泡沫状ウイルスの変異性の高い融合ウイルスエンベロープタンパク質（PFV 11）でトランスフェクトし、その後、感染性HCV粒子（HCVcc）でチャレンジしたときに、感染性ウイルスの de novo生産が観察された。これは、HCVが成功し、これらの細胞株における主要な制限因子の発現を除外ヘテロカリオンでのレプリケーションサイクルを完了したことを示します。これらの新しい条件付きトランス相補方法は、HCV特有の主要な制限因子の発現のための細胞株および初代培養細胞の大型パネルをスクリーニングに有用であろう。

我々は、条件は、次の2つの方法について説明します。<em&gt;トランス</em&gt;-相補性C型肝炎ウイルス（HCV）は、アセンブリとヘテロカリオンの形成に依存している完全なウイルスのライフサイクルの完了。これらの技術は、感染性HCV子孫の生産を妨げる主要な制限因子を発現する細胞系の画面に適しています。

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

C型肝炎ウイルス（HCV）は、宿主範囲がヒトおよびチンパンジーに限定された肝親和性ウイルスである。HCV RNAの複製は……で観察されているが、

本手順の目的は、heca形成に依存する2つの手法を用いて、任意の細胞株におけるC型肝炎ウイルス（HCV）複製サイクルの完了に対する制限因子の影響を調査することです。まず、ヒト肝細胞ならびにHeal AおよびHep 56 1Dパッケージング細胞を培養します。次に、エレクトロポレーションによりC型肝炎ウイルスまたはHCV RNAを肝細胞に導入します。その後、2番目の融合法として、ポリエチレングリコールを用いてHCV複製細胞株をそれぞれのパッケージング細胞株に融合させます。最初のステップは、高タイターのHCVストックを調製することです。その後、異なる細胞株を共培養し、プロトタイプフォーム状ウイルス糖タンパク質をトランスフェクションして細胞融合を誘導します。次に、これらのヘテロカリオンにHCVを感染させます。どちらのヘテロカリオン形成方法においても、蛍光顕微鏡観察により融合を確認し、感染性粒子の産生量を定量します。この手法の主な利点は、HV特異的なドミナント制限因子の発現について、多くの細胞株および初代細胞のパネルをスクリーニングするのに有用であることです。この方法は、HCVの種特異性とゲノムに関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。ポリエチレングリコールによる細胞融合を誘導する前に、2つの融合システムの基礎となる概念を理解しやすくするためには、この方法を視覚的に実演することが極めて重要です。HUH 7.5細胞に標準的なプロトコルに従ってHCV RNAをトランスフェクトし、37 °C、5% CO₂条件下で24時間培養します。翌日、サブゲノムレプリコンを保持するトランスフェクト済みHUH 7.5細胞、およびHuhR細胞とHep56.1Dパッキング細胞を回収します。これらのパッキング細胞は、HCVタンパク質のcore、E1、E2、p7、およびNS2を異所性に発現するように構築されています。トリプシン処理後、細胞をDMEM完全培地で再懸濁し、細胞懸濁液を以下の濃度に希釈します。HUH 7.5細胞は5 × 10⁵ cells/mL、HuhRおよびHep56.1D細胞は2 × 10⁵ cells/mLとします。次に、各ウェルに2〜3枚の滅菌済みガラスカバースリップを入れた6ウェル培養プレートを用意します。融合効率をさらに分析するため、トランスフェクションしたHUH 7.5細胞1 mLとパッケージング細胞1 mLを混合し、6ウェルプレートの1つのウェルに播種して、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で24時間インキュベートします。24時間後、細胞密度を確認してください。細胞膜が融合するために細胞同士が近接している必要があるため、細胞融合を誘導する前の細胞密度は、共培養において60～80%のコンフルエンシーである必要があります。共培養細胞から培地を吸引し、1 mLのPBSで1回洗浄します。次に、あらかじめ温めておいた40%ポリエチレングリコール（PEG 1,500）を500 µL慎重に加えます。対照群として、別の共培養細胞のウェルに500 µLのPBSを加えます。37 °Cで5分間インキュベートして、ヘテロカリオン形成を誘導します。PEGを吸引し、2 mLのPBSを慎重に加えます。1分後にPBSを吸引し、2 mLの新鮮なPBSを加えます。過剰なPEGを除去するため、1回1分間の洗浄をPBSで3～5回繰り返します。最後に、各ウェルに2 mLのDMEM完全培地を加え、37 °C、5% CO2で48時間インキュベートします。融合から48時間後、各SNATを回収し、0.45 µmのフィルターでろ過します。細胞培養上清を回収した後、融合効率を免疫蛍光法により決定できます。ガラスカバースリップの入ったウェルを、1 mLのPBSで1分間、1回洗浄します。PBSで希釈した3%パラアルデヒド 600 µLを用いて、細胞を15分間固定します。PBSで1分間×3回の洗浄を行い、最後の洗浄後に、ピンセットを使用してカバースリップを24ウェルプレートに慎重に移します。PBSで希釈した0.5% Triton X 100 500 µLを用いて、細胞を5分間透過処理します。続いてPBSで3回洗浄し、各ウェルに一次抗体溶液を250 µLずつ添加します。抗NS5a抗体を0.5 µg/mLの濃度で、ヒトモノクローナル抗E2抗体を6.4 ng/mLの濃度で使用してください。室温で45分間インキュベートし、45分後、PBSで3回洗浄します。次に、各ウェルに250 µLの二次抗体を加えます。二次抗体には、Alexa Fluor 546またはAlexa Fluor 488を標識したgoat anti-mouseまたはgoat anti-human IgG特異的抗体を2 µg/mLの濃度で使用します。室温・暗所で30分間インキュベートします。30分後、PBSで1回洗浄します。続いて、PBSで1:3000に希釈したDPI 250 µLを用いて細胞核を染色します。室温・暗所にて1分間インキュベートし、PBSで4回、水で1回洗浄します。最後に、顕微鏡スライド上のFlora Mountの一滴の上にカバーガラスを裏返してマウントし、暗所で乾燥させます。本手順を開始するために、以下の細胞を回収し、単一細胞懸濁液を調製します。内因性CD 81の発現を欠損したLuna NAヒト肝細胞株、HeRパッケージング細胞、およびヒトCD 81を安定的に発現するHep 56 1D細胞。Luna N細胞をHeR細胞と1:1の比率で、またHep 56 1D hCD 81細胞と1:2の比率で共培養し、12ウェルあたりの総細胞密度を1.5 × 10⁵ cellsにします。翌日、37°C、5% CO₂条件下で24時間インキュベートします。製造元の指示に従い、Lipofectamine 2000を用いて、高度に発現させるPFEエンベロープタンパク質を細胞に一過性 transfection します。PFE糖タンパク質の transfection から30時間後、あらかじめ調製したウイルスストックを MOI 約2.3で350 µL加え、ヘテロカルノンに接種します。翌朝、37°C、5% carbon dioxideの条件下で12時間インキュベートします。PBSで1回洗浄し、各ウェルにDMEM完全培地を1 mL加え、37°C、5% carbon dioxideで48時間インキュベートします。48時間後、ヘテロカリオン培養液の上清を回収し、0.45 micronフィルターでろ過します。次に、前日に96ウェルプレートに播種したHUH 7.5細胞に、限界希釈法を用いてこの上清を接種します。感染性子粒子産生量を定量する前に、72時間インキュベートします。融合イベントを可視化する手順は、共培養の6時間前までに完了させる必要があります。接着細胞を5 mLのPBSで1回洗浄し、次に10 cmディッシュあたり4 mLの適切なDI溶液を加えます。細胞を37 °C、5% CO2条件下で45分間インキュベートします。細胞を5 mLのPBSで1分間、1回洗浄し、その後DMEM完全培地を加えます。播種前に37 °C、5% CO2条件下で6時間インキュベートします。12ウェルプレートの各ウェルにカバースリップを加え、その後、前述の方法に従って播種、トランスフェクション、および細胞染色を行います。トランスフェクションの30時間後に、細胞を1 mLのPBSで1分間慎重に洗浄し、次いで250 µLの3%パラホルムアルデヒドを用いて室温で15分間固定します。細胞を1 mLのPBSで1分間1回洗浄し、その後、PBSと水でそれぞれ1回ずつ洗浄した後、dappyで1分間染色し、カバーガラス、サングラス、スライドをマウントして、HCV複製サイクルの完了に対する制限因子の影響を調査する最初のアプローチを行います。ヘテロカロンにおいて、HUH 7.5細胞にルシフェラーゼ・トランスジーンおよびHCV非構造タンパク質を発現するサブゲノムレプリコンをまず一過性に導入し、次いでHCV構造タンパク質coreおよびアクセサリータンパク質を発現する細胞株と共培養および融合させました。代表的な結果をこの図に示します。細胞は、E2構造タンパク質およびNS5A非構造タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて免疫染色されています。上段のパネルの画像は、PEGで処理するとMS five AとD twoの両方のシグナルが同一の細胞質内で同時に検出されたことを示しており、自己融合が起きたことを示唆しています。対照的に、下段のパネルでは、共培養細胞をPBSで処理した場合には融合が誘導されなかったことを示しています。したがって、シグナルの共局在は見られませんでした。ヘテロカリオンから産生されたウイルスの感染力を定量化するため、融合誘導から48時間後に共培養物から上清を回収し、その後のルシフェラーゼアッセイのために未感染のHUH 7.5細胞に接種しました。このグラフには、3回の独立した実験の平均値が表示されています。灰色の水平バーは、非感染のHUH 7.5細胞で測定された相対発光単位（RLU）のバックグラウンドを示しています。注目すべき点として、HUH 7.5複製細胞を未感作細胞株と融合させた場合、またはコントロールとしてPBSで処理した場合、培養液中に感染性は検出されませんでした。しかしながら、PEGによってHUH 7.5レプリコン細胞とパッケージング細胞との間で細胞融合を誘導したところ、感染性ウイルス粒子が培養液中に放出されました。これは、ウイルスの産生に細胞融合とパッケージング細胞におけるウイルス蛋白質の発現が必要であることを示しています。驚くべきことに、HUH 7.5ヒト肝細胞がん細胞のヘテロカロンだけでなく、ヒト非肝細胞およびマウス肝細胞とのヘテロカロンにおいてもウイルスの放出が認められたため、アセンブリと放出は、これらの細胞種における潜在的な制限因子によって支配的に抑制されているわけではないことが示唆されました。別の手法として、細胞の培養後に原子的糖蛋白質の発現により体細胞融合を誘導しました。共培養および遺伝子導入の前に、個別の細胞株をセルトラッカー色素で染色することでヘテロカリオンを可視化しました。遺伝子導入の30時間後に細胞を固定しDPIで染色し、その代表的な結果を本図に示しています。2種類の細胞の融合は、ここで示されているように、細胞質内に色素が均一に分布したヘテロカリオンによって示されます。対照的に、下段の画像では、二重染色された細胞質を持つ細胞が存在せず、細胞融合が起きていないことが示されています。この最後のグラフは、すべてのHCV侵入因子が、ヒトCD 81を発現するhela細胞またはHep 56 1D細胞とともにLuna N細胞を持つヘテロキャリアにおいてのみ発現していることを示しています。ここでは、培養液に感染性HCV粒子を接種しました。48時間後に培養液を回収し、未感作のHUH 7.5標的細胞を用いた限界希釈法により、ヘテロキャロンからのde novo粒子放出を測定しました。3回の独立した実験の平均値を表示しており、灰色の水平バーは本アッセイの検出限界を示しています。コントロールとして、lunar N細胞同士を融合させたところ、感染性HCVのレベルは検出限界に近い極めて低い値となりました。lunar N細胞をnaive HEP 56 1D細胞と融合させた場合にも、同様の結果が得られました。どちらの場合も、ヒトCD 81が欠損していたため、HCVはヘテロカリオンに効率的に感染することができませんでした。対照的に、lunar 10細胞およびhuman CD 81を発現するHEP 56 1D細胞と融合させたlunar hand細胞では、アッセイのバックグラウンドを約10倍上回る感染性ウイルス子粒子のde novo産生が観察されました。これは、HCVがRetroCars内で複製サイクルを正常に完了したことを示しており、これらの細胞株においてドミナントな制限因子の発現がないことを証明しています。習得すれば、適切に実施することで全実験工程を1週間で完了させることが可能です。このビデオを視聴することで、考えられるHCV制限因子の特定に向けたヘテロキャリオンの作製方法について十分な理解を得ることができます。C型肝炎ウイルス（HCV）を取り扱うことは極めて危険であるため、この手順を実行する際は、高度なバイオセーフティなどの予防策を常に考慮することを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

細胞タイプ特異的タンパク質の局在化の特性評価と核細胞質間輸送のための柔軟かつ効率的な方法が記載されている。このヘテロカリオンのアプローチは、細胞融合後の画像の蛋白質のローカリゼーションへの蛍光標識融合タンパク質を使用しています。プロトコルは、定常状態の局在やライブセルイメージングに基づいて、より動的な決定に適している。...

細胞種特異的局在の解析のためのヘテロカリオンのテクニック

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

C型肝炎ウイルス(HCV)は、肝硬変や癌を含む肝障害を引き起こす主要なヒト病原体です。HCV感染性細胞培養システムは、HCV複製の分子メカニズムを理解し、新しい治療法を開発するために不可欠です。ここでは、HCV複製サイクルのさまざまな段階を調査するためのプロトコルについて説明します。...

C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

HIV-1の病因は、ウイルスの特性と宿主の遺伝的要因の両方によって定義されます。ここでは、gag遺伝子配列の変異がウイルスのin...

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

ここでは、HBVのライフサイクルの初期段階をモニターするために新たに開発されたB型肝炎ウイルス（HBV）レポーター系を記載します。 インビトロ系簡略化これは、高スループットの戦略を用いて、抗HBV薬のスクリーニングに役立ちます。...

複製サイクルの初期段階を監視するためにB型肝炎ウイルスのレポーターシステムの開発

脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。...

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

我々 はここで B 型肝炎ウイルス感染システムを介して HBV DNA の体外生成を記述して、逆行列を用いて、(1-2 コピー) 統合の高感度検出に PCR...

低コピーの検出数は B 型肝炎感染培養によって形成された統合ウイルス DNA

ここでは、スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いてHBx-DDB1相互作用を阻害する抗肝炎ウイルス剤をスクリーニングする方法を提示する。このシステムはタンパク質間相互作用の容易な検出を可能にし、そのような相互作用の阻害剤を同定するのに適している。...

スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いたHBx-DDB1相互作用の同定阻害剤

本稿では、新たに設計された293T細胞(293T-NE-3RS、ヒトNTCP、HNF4α、RXRαおよびPPARα)および伝統的な肝細胞(HepG2-NE、ヒトNTCPを発現する)におけるB型肝炎ウイルス(HBV)感染の詳細なプロトコルについて説明する。...

非肝細胞293T-NE-3NRs細胞におけるB型肝炎ウイルス感染のモデル化

プロトコルは間違いが傾向があるPCRおよび逆の遺伝学を使用して完全長の突然変異体のRNAの統合の結合によって肝炎のウイルスのゲノムの制御可能な遺伝の多様性をもたらすための方法を記述する。この方法は、表現型選択のモデルを提供し、長さ10...

ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

等温滴定熱量測定を使用して、ウイルス侵入前後のライフサイクル段階を標的とする抗B型肝炎ウイルス(HBV)化合物をスクリーニングするためのプロトコルを提示し、宿主タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドとの結合親和性(KD)を測定します。抗ウイルス効果は、ウイルスライフサイクルマーカー(cccDNA形成、転写、およびウイルス集合)の抑制によって決定されました。...

治療標的としてのタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを介したB型肝炎ウイルス侵入を調べるコンピテント肝細胞モデル

学ぶHCV制限要因の探索法。ヘテロカリオン形成を用いて2つの細胞融合技術で、感染性ウイルス産生を阻害する優性制限要因を発見し、HCV複製サイクル完了への影響を解析します。

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

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