フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

本手順の全体的な目的は、高品質なヒト血管内皮細胞を単離し、それらを用いて、アンダーフロー条件下における好中球の経内皮遊走を調節するメカニズムを検討することです。まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞を単離して播種し、次にそれらの細胞をIBDチャンバーに分割して導入することでこれを達成します。

次に、新鮮に単離したヒト好中球を活性化内皮細胞上に播種し、好中球のローリング、強固な接着、および経内皮移動を誘導します。最終ステップとして、ビデオ顕微鏡を用いて経内皮移動を定量化します。最終的に、蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡を用いて、活性化内皮細胞を介した好中球の経内皮移動を評価できます。

血管内皮細胞の分離は説明こそ簡単ですが、習得は困難です。その理由の一部として、主要な手順において臍帯の視認が必要となることが挙げられます。そのため、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。本手法は、血流条件下で白血球の動員がどのように起こるか、また血流条件下で血管内皮細胞がどのように振る舞うかといった、炎症分野における重要な疑問の解明に役立ちます。

この手法は、炎症時の好中球リクルートメントに関する知見を提供できるだけでなく、ナチュラルキラー細胞や好酸球などの希少な白血球集団にも適用可能です。私の研究室の技術者であるHong Jangが、Ritu Sharmaと共にこの手順を実演します。処置の少なくとも1時間前に、ゼラチンでコートしたT 75フラスコを37 °Cでインキュベートしておきます。

次に、層流クリーンベンチ内で血管内皮細胞の単離手順を開始します。ハサミを用いて、胎盤から臍帯を切り出します。滅菌手袋に交換した後、臍帯を詳細に観察し、血栓が含まれている部分や、分娩時の臍帯クランプによって損傷している部分は取り除きます。その後、臍帯にある2本の動脈と1本の静脈を特定します。

次に、2方活栓を取り付けたカニューレを静脈の一端にそっと挿入し、カニューレにクランプをかけて位置をしっかりと固定します。この手順で最も困難な部分の一つが、臍帯の灌流です。確実に灌流を行うために、過剰量のバッファーを用いて臍帯を灌流し、流出液が透明になるまで確認してください。

フロースルーが透明になるまで臍帯バッファーで静脈を灌流し、その後、臍帯の末端をクランプします。灌流中に、医師が臍帯血を採取したために小さな穴が開いていることが判明する場合があります。このような状況では、止血鉗子を用いて穴を塞ぎ、血管内皮細胞を分離しながら灌流を継続することができます。

コラゲナーゼ処理の時間を正確に調整することが極めて重要です。処理時間が短すぎると内皮細胞を十分に回収できず、逆に長すぎると平滑筋細胞の混入や内皮細胞への損傷が生じる可能性があります。その後、調製したばかりの温かいコラゲナーゼを静脈に灌流させます。

ストップコックを閉じ、温めた臍帯バッファーを入れたビーカーの中で臍帯をインキュベートします。10分後に取り出し、臍帯を優しくマッサージして、静脈腔から内皮細胞を剥離させます。溶液を5 mLの内皮細胞培地（ECM）を含むチューブに回収し、残った細胞を取り除くために、臍帯バッファーで2回臍帯をフラッシングします。

次に、細胞を室温にて350×gで10分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを再懸濁させます。10 mLの内皮細胞培地を用いて細胞をゼラチンコートしたT 75フラスコに移し、37°C、5% CO2条件下で内皮細胞を一晩培養します。翌日、フラスコをそっと揺らして、付着している赤血球を除去します。

次に上清を除去し、温めたHBSSで血管内皮細胞の培養液を洗浄します。HBSSを除去した後、10 millilitersの温めたECMを細胞に添加します。その後、顕微鏡下で細胞を観察し、赤血球が除去されていることを確認するとともに、血管内皮細胞のコンフルエンスの状態と形態を評価します。

細胞がコンフルエントになるまで、3日ごとに培地交換を続けてください。その後、トリプシンおよびEDTA溶液を用いて細胞を剥離させます。次に、剥離した細胞を回収し、ECMに再懸濁してください。

最後に、IBDチャンバーの各ウェルにゼラチンでコーティングを行います。余分なゼラチンを除去し、その後、1.5 × 10⁶ cells/mLの血管内皮細胞懸濁液をチャンバーの各ウェルに加えます。血管内皮細胞を活性化させる間に、適切な刺激剤を用いて内皮細胞をインキュベートし、接着分子および活性化分子の細胞表面発現の上方制御を誘導します。

既報の密度勾配遠心法により、健康なヒトボランティアの末梢血から好中球を分離し、HBSSおよびヒトアルブミンを含む溶液中で1×10⁶/mLの濃度で懸濁させる。顕微鏡のセットアップ後、刺激した血管内皮細胞を含むIBDチャンバーを顕微鏡のチューブに接続する。10倍の位相差対物レンズを選択し、シリンジポンプを吸引設定にして、目的のせん断応力でHBSSの流れを開始させる。

出口側の三方活栓をオフ位置に回して流れを一時的に停止させ、入口ラインをHBSSから単離好中球に切り替えます。活栓をオン位置に戻して、再び流れを開始します。その後、DVDレコーダーに接続したCCDカメラを使用して記録を開始します。

タイマーを開始します。4分後に好中球がチャンバーに進入したら、新しい好中球の接着を防ぐためにHBSSに戻します。ローリングおよび強固な接着の総相互作用データが必要な場合は、10倍の位相差顕微鏡を使用してください。

4分から5分の間に、6つのランダムな視野をそれぞれ10秒間撮影します。最後に40x対物レンズに切り替え、目的のタイミングで1つの視野を記録します。10分後の好中球灌流の後、5つから10つのランダムな視野を収集します。

刺激を受けていない血管内皮細胞は、好中球の遊走を促進しません。そのため、以下の図では、TNF alphaで刺激した血管内皮細胞と相互作用する好中球を示しています。黄色い矢印で示された接着好中球と、白い矢印で示された血管外遊走中の好中球に注目してください。

好中球の透過は、細胞間接合部で起こる場合と、内皮細胞自体を通過して起こる場合があります。これら2つの条件を区別するため、内皮細胞を抗VE-cadherin抗体で標識しました。ここで赤色で示されているように、透過が細胞間（paracellular）に起こったか、あるいは細胞内（transcellular）に起こったかを判定します。

このモデルでは、前の2つの図を重ね合わせたこの図に示されているように、ほぼすべての透過はパラセルラー（細胞間）経路で行われます。3つのグラフのうち最初のグラフでは、Image Jソフトウェアを用いて好中球の相互作用を検討し、測定しました。対照群である非刺激内皮細胞と比較して、好中球とTNF alpha活性化内皮細胞との間では、有意に多くの好中球-内皮細胞相互作用が起こったことに注目してください。

相互作用した全細胞について、以前と同様に、ローリング、強固な接着、または経内皮遊走のいずれであるかをさらに特性評価した。内皮細胞を単離した後、活性化内皮細胞を含むウェルにおいて、好中球の経内皮遊走が有意に多く認められた。構築後、内皮細胞生物学に関連するさらなる疑問を解消するために、ウェスタンブロッティング、リアルタイムPCR、内皮抵抗測定などの他の手法を実施することができる。

本手法は、炎症および血管生物学分野の研究者が、ヒトモデルシステムにおける血流条件下での白血球リクルートメントのメカニズムを理解するのに役立ちます。このビデオを視聴することで、ヒト臍帯静脈内皮細胞を単離し、ityチャンバーを用いて血流条件下での好中球透過性を研究する方法について十分に理解できるはずです。