フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

本手順の全体的な目的は、高品質なヒト血管内皮細胞を単離し、それを用いて、アンダーフロー条件下での好中球走化性遊走を調節するメカニズムを検討することです。まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞を単離して播種します。次に、これらの細胞をIBDチャンバーに分割して分注します。

次に、 freshly isolated（新鮮に単離した）ヒト好中球を活性化内皮細胞上に播種し、好中球のローリング、強固な接着、および経内皮移動を誘導します。最終ステップでは、ビデオ顕微鏡を用いて経内皮移動を定量化します。最終的に、蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡を用いて、活性化内皮細胞を介した好中球の経内皮移動を評価することができます。

血管内皮細胞の単離は、言葉で説明するのは簡単ですが、習得するのは困難です。その理由の一つとして、重要な工程で臍帯（さいたい）を可視化する必要があることが挙げられます。そのため、本手法を視覚的に実演することは極めて重要です。本手法は、血流条件下でどのように白血球の遊走が起こるのか、また血流条件下で血管内皮細胞がどのように振る舞うのかといった、炎症分野における重要な課題を理解する上で役立ちます。

この手法は、炎症時の好中球の動員に関する知見を得るのに有用ですが、ナチュラルキラー細胞や好酸球などの希少な白血球集団にも適用可能です。私の研究室の技術者であるHong Jangが、Ritu Sharmaと共にこの手順を実演します。処置の少なくとも1時間前に、ゼラチンでコートしたT 75フラスコを37 °Cでインキュベートしておきます。

次に、ラミナーフローフード内で血管内皮細胞の単離手順を開始し、はさみを用いて胎盤から臍帯を切り出します。滅菌手袋に付け替えた後、臍帯を詳しく観察し、血栓が含まれている部分や、分娩時の臍帯クランプによって損傷している部分は取り除きます。その後、臍帯にある2本の動脈と1本の静脈を確認します。

次に、2方活栓を取り付けたカニューレを静脈の一端にゆっくりと挿入し、クランプでカニューレを固定して位置を安定させます。この手順で最も困難な点の一つが臍帯の灌流です。確実に灌流を行うために、十分な量のバッファーで臍帯を灌流し、流出液が透明になるまで観察してください。

流出液が透明になるまで、臍帯バッファーで静脈を灌流させ、その後、臍帯の末端をクランプします。灌流中、医師が臍帯血を採取したために小さな穴が見つかることがあります。このような場合は、止血鉗子を用いて穴を塞ぎ、血管内皮細胞を分離しながら灌流を継続させることができます。

コラゲナーゼ処理の時間を正確に調整することが極めて重要です。処理時間が短すぎると、十分な数の内皮細胞を回収できず、長すぎると、平滑筋細胞の混入や内皮細胞への損傷が生じる可能性があります。その後、新たに調製した温かいコラゲナーゼを静脈内に灌流させます。

ストップコックを閉め、温めた臍帯バッファーを入れたビーカー内で臍帯をインキュベートします。10分後、臍帯を取り出し、静脈の内腔から内皮細胞を剥離させるために、臍帯を優しくマッサージします。溶液を5 mLの内皮細胞培地（ECM）が入ったチューブに回収し、残りの細胞を取り除くために、臍帯バッファーで2回臍帯をフラッシングします。

次に、室温で3,000 ×gで10分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを再懸濁します。10 mLの血管内皮細胞培地に懸濁した細胞を、ゼラチンコートしたT 75フラスコに移し、37 °C、5% CO2条件下で血管内皮細胞を一晩培養します。翌日、フラスコを軽く揺すって、付着している赤血球を除去します。

次に、上清を除去し、温めたHBSSで血管内皮細胞の培養液を洗浄します。HBSSを除去した後、温めたECM 10 millilitersを細胞に添加します。その後、顕微鏡下で細胞を確認し、赤血球が除去されていること、および血管内皮細胞のコンフルエンスの程度と形態を評価します。

細胞がコンフルエントになるまで、3日ごとに培地交換を続けてください。コンフルエントに達したら、トリプシン-EDTA溶液を用いて細胞を剥離させます。その後、剥離した細胞を回収し、ECMに再懸濁してください。

最後に、IBDチャンバーの各ウェルにゼラチンでコーティングを行います。余分なゼラチンを除去し、1.5 × 10⁶ cells/mLの血管内皮細胞懸濁液を各ウェルに加えます。血管内皮細胞を活性化させながら、適切な刺激剤を用いてインキュベートし、接着および活性化分子の細胞表面発現のアップレギュレーションを誘導します。

既報の密度勾配遠心法により、健康なヒトボランティアの末梢血から好中球を単離し、HBSSにヒトアルブミンを添加した溶液中で1×10⁶/mLの濃度で懸濁させます。顕微鏡の準備が整ったら、刺激した内皮細胞を含むIBDチャンバーを顕微鏡のチューブに接続します。10倍の位相差対照対物レンズを選択し、シリンジポンプを設定してHBSSを吸引し、目的のせん断応力でフローを開始させます。

出口側の三方コックをオフ位置に回して流れを一時的に停止させ、入口ラインをHBSSから単離好中球に切り替えます。コックをオン位置に戻して、再び流れを開始させます。その後、DVDレコーダーに接続されたCCDカメラを用いて記録を開始します。

タイマーを開始します。4分後に好中球がチャンバーに流入したら、新たな好中球の接着を防ぐためにHBSSに戻します。ローリングおよび強固な接着の全相互作用データが必要な場合は、10倍の位相差顕微鏡を使用してください。

4分から5分の間に、6つのランダムな視野をそれぞれ10秒間イメージングします。最後に40倍の対物レンズに切り替え、目的の時点で単一の視野を記録します。10分後の好中球灌流後、5〜10個のランダムな視野を収集します。

刺激されていない内皮細胞は、好中球のリクルートを促進しません。したがって、以下の図では、TNF alphaで刺激された内皮細胞と相互作用する好中球を示しています。黄色の矢印で示されている接着好中球と、白色の矢印で示されている遊走（トランスマイグレーション）中の好中球に注目してください。

好中球の遊走は、細胞間接合部で起こる場合と、内皮細胞自体を通過して起こる場合があります。これら2つの状態を区別するため、内皮細胞をanti VE-cadherin抗体で標識しました。ここで赤色で示されているように、遊走が傍細胞的に起こったか、あるいは経細胞的に起こったかを判定します。

このモデルでは、前の2つの図を重ね合わせたこの図に示されているように、ほぼすべての透過がパラセルラー（細胞間）経路であることがわかります。3つのグラフのうち最初のグラフでは、Image Jソフトウェアを用いて好中球の相互作用を検討し、測定しました。好中球とTNF alpha活性化内皮細胞との間では、対照群の未刺激内皮細胞よりも、好中球と内皮細胞の相互作用が有意に多く発生していることに注目してください。

相互作用した全細胞を、前述と同様に、ローリング、強固な接着、または経細胞移動のいずれであるかさらに特性評価した。内皮細胞を単離した後、活性化内皮細胞を含むウェルにおいて、好中球の経細胞移動が有意に多く認められた。構築後、内皮細胞生物学に関連するさらなる疑問を解消するために、ウェスタンブロッティング、リアルタイムPCR、および内皮抵抗などの他の手法を実施することができる。

この手法は、炎症および血管生物学分野の研究者が、ヒトモデルシステムにおける血流条件下での白血球リクルートメントがどのように起こるかを理解するのに役立ちます。このビデオを視聴することで、ヒト臍帯静脈内皮細胞を単離し、ityチャンバーを用いて血流条件下での好中球の透過性を研究する方法について、十分に理解することができます。