の調査のための人間の卵管モデル

Chlamydia trachomatisは、グラム陰性の細胞内寄生性細菌です。眼または生殖器系の感染症を引き起こす、異なるクラミジア血清型が知られています。C. trachomatisによる生殖器感染症は、世界中で最も頻度の高い性感染症です。

欧州連合では1990年から2009年までに、報告された感染件数が約300万件に達する有病率が認められています。2009年には約400,000件の症例が報告されました。公衆衛生と性教育は絶えず向上しているものの、新規の生殖器クラミジア感染症の発生率は、1990年の70,000件から2009年には400,000件へと増加しています。

全新規感染の75%が15歳から24歳の若年層で報告されています。臨床的な後遺症は、病原体の排除が不十分であるために起こると考えられており、それが下生殖器から上生殖器への上行性感染を招き、結果として感染組織に慢性的炎症性損傷を引き起こす可能性があります。chlamydia tracheitisに感染した女性の10～30%に骨盤内炎症性疾患（PID）が発症し、PID症例の最大50%がchlamydia tracheitis感染に起因しています。

その結果、卵管不妊の患者の50%および異所性妊娠の患者の40%において、原因病原体としてクラミジアが検出されています。感染のない健康な女性では、受精卵は卵管を通って子宮へと移動し、そこで分娩まで発育します。感染患者では、クラミジアが下生殖器から卵管へと上昇し、慢性的な炎症プロセスを誘発することがあります。

病原体によって誘導される上皮細胞の損傷および中心的な上皮細胞機能の喪失が、最終的に卵管閉塞を引き起こし、その結果、卵巣から子宮への卵子の輸送が減少または完全に消失すると考えられています。この目的のため、子宮摘出術を受ける女性からヒト卵管を採取し、保存します。採取した卵管は解剖し、慎重に開いた状態にします。

実験設定に従い、それらを小さな検体へと切断し、感染性 chlamydia tracheitis elementary bodies を接種して、それぞれの時点から 24 ～ 48 時間感染させます。検体は、次なる準備まで少なくとも 3 日間、Monty's fixative で固定します。子宮摘出術を受ける女性から採取したヒト卵管 HFT は、手術直後に保存してください。

抗生物質を含まない5% FCS含有RPMI中で、準備まで4°Cで保存する。全工程において、抗生物質を含まない5% FCS含有RPMIを入れたペトリ皿の中でヒト卵管を解剖する。乾燥を防ぐため、卵管は常に培地に浸しておくこと。結合組織および手術中に損傷した組織は切除して廃棄する。

解剖後、小型メスを用いてHFTを慎重に開きます。ピンセットやメスの不注意な操作による組織損傷を避けてください。感染用に5 mm × 5 mmのサイズの小さな組織片を準備し、抗生物質を含まない5% FCS含有RPMI 1 mLにHFT検体を保存し、C trackを添加します。

OMAS elementary bodies HFT検体は、通常のインキュベーター内（37 °C、5% CO2、20% O2）または低酸素チャンバー内（5% O2未満の低酸素環境）で、最大48時間インキュベートします。それぞれのインキュベーション時間経過後、検体を回収し、SEMまたはTEM（透過電子顕微鏡）での作製まで、Monty's Fixative中で4 °Cで少なくとも3日間保存します。固定した組織を小さく切断して洗浄し、1% osmium tetroxideと共に一晩インキュベートします。

数回の洗浄および乾燥工程の後、脱水した試料を新しく調製したアイトに転写し、60 °Cで48時間重合させます。トリミング後、セミシンセクションおよびウルトラシンセクションを切出し、それぞれスライドガラスまたはグリッド上に転写します。染色後、セミシンセクションを光学顕微鏡で観察し、透過電子顕微鏡観察のための部位を確認します。

標本をMonty固定液から取り出し、最大2×2×5 mmの大きさに切断します。洗浄、ナトリウムCCO希釈緩衝液でのインキュベーション、四酸化オスミウムによる洗浄、脱水、および段階的なエタノール濃度の昇圧処理の後、標本を50%プロピレンオキシドとエポキシ樹脂の混合液に一晩浸漬します。翌日、新しく調製したエポキシ樹脂に移し、少なくとも1時間静置します。

その後、平型モールドに移して樹脂を満たし、60 °Cで48時間重合させます。包埋したサンプルをトリミングした後、ガラスナイフまたは（好ましくは）ダイヤモンドナイフを備えたウルトラマイクロトームを用いて、約700 nmのセミシンセクションまたは70 nmのウルトラシンセクションを作製します。セミシンセクションおよびウルトラシンセクションを用いて、光学顕微鏡および透過電子顕微鏡で試料を分析します。走査電子顕微鏡についても同様に行います。

試料は上皮を上にした状態でコルクプレートにピン留めし、濃度の段階的に上げたアセトンを用いて洗浄および脱水を行います。臨界点乾燥機で乾燥させた後、試料をSEM用試料台に移し、スパッタコーターを用いて白金、金、またはパラジウムでコーティングします。これで、走査電子顕微鏡を用いた走査電子顕微鏡観察による分析の準備が整います。

検体をMonty固定液から取り出し、上皮面を上にしてコルクシート上に配置し、昆虫ピンで組織片の位置を固定する。ナトリウムカコジエート緩衝液で洗浄した後、アセトン処理を行い、臨界点乾燥機で検体を乾燥させる。検体をコルクからSEM用試料ホルダーに移した後、スパッタコーターを用いて検体に導電性の白金・金またはパラジウムのコーティングを施す。スパッタ処理した検体を走査電子顕微鏡に移し、詳細な解析を行う。

女性における子宮頸管感染の高い罹患率と、上行性感染による重大な臨床的影響が、この分野における基礎およびトランスレーショナル研究を強化する根拠となっています。我々は、St. Perusらのグループによって構築されたヒト卵管のexvivo組織モデルを用い、卵管におけるクラミジア誘発性の細胞損傷を形態学的に特徴づけました。この手法を用いることで、細胞内封入体の形成を異なる発達段階で観察することができ、複製段階および持続性感染の両方を確認することができました。

しかしながら、ヒト卵管組織において持続性クラミジアが存在するという実験的根拠はいまだ不足しており、クラミジア、子孫、および持続性遺伝子の転写上昇に関するさらなる解析が必要である。本モデルの主な制限の一つは、炎症細胞が存在しないことであり、これが初期のKLA緑内障性感染による二次的影響の解析を困難にしている。しかし、本モデルは、卵管上皮細胞損傷の文脈における酸素含有量などの環境条件の解析や、急性緑内障性感染に対する初期の宿主免疫応答を解析するのに適していると考えられる。

今後の目的の一つは、pHヒト卵管組織モデルにおけるCTUのMIC試験のためのより精緻なモデルを構築し、このモデルを用いて、二光子レーザー走査顕微鏡技術を活用し、CLIsの異なる発達段階を代謝的に定義することです。