Name: の調査のための人間の卵管モデル C.トラコマチス感染症 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶC. trachomatis感染によるヒト卵管細胞損傷のメカニズム。摘出卵管を用いたex vivoモデルで、慢性炎症反応と不妊症の病理を可視化し、治療戦略開発への基礎知見を提供する。

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この作品は、 &quot;インターフェイスの炎症&quot;エクセレンスのDFG-クラスター（RA-IF、RA-D）によってサポートされていました。我々は、クリスティンWischnatの優れた技術支援に感謝しています。

1。 クラミジア·トラコマチス血清型Dストックの調製<ol><li> 4ミリリットルCとしたHeLa-229細胞を含むコンフルエント175cm 2の細胞培養フラスコを感染させるバッファをSPGのでクラミジア D。 </li><li>一定の揺れの間に37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> 10％FCS、240μlのシクロヘキシミドと20ミリリットルDMEMを追加します。 </li><li> °C、5％CO 2、37で48時間加湿インキュベーター中でインキュベートします。 </li><li> C.をデタッチし、破壊するために、5 mlの滅菌ガラスビーズ、強い揺れを追加します。 HeLa細胞-229細胞をかくまっトラコマチス 。 </li><li>上清を収集し、滅菌したガラスビーズの別の5ミリリットルを追加します。 </li><li> 1分間ロック三回は、すべてのHeLa-229細胞を破壊し、リリースCにトラコマチス 。 </li><li> 1000年RPMIと4で5分間遠心°C細胞の破片を取り除くために。 </li><li>コンフルエントgをフラスコ8から10 175cm 2の培養細胞の感染上清を回収HeLa細胞229細胞とrown。 </li><li> 4 mlのSPGバッファと37℃で一時間前の​​感染から4 mlの上清°一定に振とうしながらCを持つすべてのフラスコをインキュベートします。 </li><li> 1時間10％FCS、37℃、5％CO 2で48時間インキュベートし、続いて230μLシクロヘキシミドと15ミリリットルDMEMを追加した後。 </li><li> 5ミリリットル滅菌ガラスビーズを追加し、Cを切り離し、破壊するために振るHeLa細胞-229細胞をかくまっトラコマチス 。 </li><li>上清を収集し、滅菌したガラスビーズの別の5ミリリットルを追加します。 </li><li> 1分間ロック三回は、すべてのHeLa-229細胞を破壊し、リリースCにトラコマチス 。 </li><li> 4 1000 RPMIで5分間遠心°Cは、細胞の破片を取り除くために。 </li><li>上清を収集します。 </li><li> 50ミリリットルのファルコンチューブに上清を40ml、11000 RPMI 99分間遠心を記入してください。 </li><li>遠心分離後、上清を捨て、1 mlのSPGバッファーでペレットを洗浄する。 </li><li>ホモジナイズペレット-70 1、5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ、店舗°Cを使用するまでに1 mlのSPGとアリコートを20μlインチ準備された株式の生物学的活性が確立されたHeLa-229細胞感染モデルにおいて確認された。 </li></ol> 2。ヒト卵管の調製<ol><li>すぐにRPMI準備まで、4で抗生物質を含まない°C、5％FCSを含むで手術後に子宮摘出術を受ける女性から店のヒト卵管（HFT）。プロトコルは、リューベック大学（09から153）の倫理委員会によって承認されました。研究に含まれていた女性（53歳まで34）は前のCの既往はなかったクラミジア感染症。卵管の組織は、帝王切開時または黄体期に症候性子宮筋腫による子宮中の母親のリクエストに応じて周産期滅菌で採取した。すべてのHFTは、Cに対して陰性であったPCR法によるクラミジア 。 </li><li>を含むRPMIを含むペトリ皿にHFTを分析抗生物質を含まない5％FCS。全体の処理中に組織が乾燥を防ぐために、メディア内に浸漬する必要があります。 </li><li>カットオフと手術中に破壊された結合組織と組織を破棄します。 </li><li>解剖した後に小さなメスで慎重にHFTを開きます。 </li><li>さらなる実験が1cm×1 cmに0.5cmの大きさに×0.5 cmの組織片を準備します。 </li><li>抗生物質を含まない5％FCSを含むRPMI 1ミリリットルの感染ストアHFT標本のために。 HFT検体はC.の5.5x10 5 IFU（インクルージョン形成単位）に感染していたトラコマチス 。 </li><li> 37 HFT試料をインキュベート°C、5％CO 2、21％O 2と同様に37°C、5％CO 2および2％で24時間O 2。 </li><li>インキュベーション時間の後に4で少なくとも3日間モンティの固定の標本や店舗を集める°SEM / TEMの準備までのC。 </li></ol> 3。 TEM用HFT試料の調製<ol><li>のためにTEMはモンティの固定から標本を削除して、4×5 mmの部分に2×2ミリメートルを切る。残りの組織は、SEMに使用することができます。 </li><li> 1時間カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.35の部分を洗う。 </li><li>アクアdestに1％（w / v）の四酸化オスミウムでインキュベートする。一晩。 </li><li>カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.35で6x5分を洗浄することによって過剰な四酸化オスミウムを削除します。 </li><li>水の中のエタノールの濃度を増加させ（v / v）の（2時間で30％、2時間、40％、2時間の50％、2時間で60％、夜70％以上、2の80％でインキュベートすることにより水を除去H、1時間の90％、1時間の95％、1時間の100％。 </li><li>酸化プロピレンの2×15分間エタノールを洗い流し、その後、50％の混合物（v / v）のプロピレンの新たに調製したアラルダイト（すべてのコンポーネントを含む）に転送し、一晩インキュベートする。 </li><li>少なくとも1時間、新たに調製したアラルダイト（すべてのコンポーネントを含む）に転送されます。 </li><li>平坦な埋め込み金型に移し、アラルダイトで記入してください。 </li><li>アラルダイト硬化のためにしましょう60°Cで少なくとも48時間</li><li>埋め込まれたサンプルのトリミング後のガラスナイフまたは基くダイヤモンドナイフを使用して、ウルトラミクロトームで、半薄切片（700 nm）をカットし、リチャードソン染色で染色される。 </li><li>ダイヤモンドナイフと銅グリッド（例えば150平方メッシュ）への転送を用いた超薄切片（約70 nm）を切り取ります。 </li><li>アクアdestに0.5％（w / v）の酢酸ウラニルで超薄切片を染色する。 3％（w / v）のアクアdestにクエン酸鉛に続く。自動セクション·シュタイナーインチまた、セクションはアクアdestに酢酸ウラニルの飽和遠心分離ソリューションにグリッド15分を残して、手動で染色することができます。アクアdestに0.3％クエン酸鉛（w / v）に続く。 </li></ol> 4。 SEMのHFT検体の調製<ol><li> SEMのためにモンティの固定、1.5×1cmのコルクシートや昆虫針を使用してフィックスの位置で上向きに直面している上皮と東洋から標本を削除します。 </li><li>適当な金属バスケットにコルクに試料を移し、カコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.35で30分間洗浄する。 </li><li>アセトン/水混合物の濃度の増加（v / v）の6時間で30％、6時間の40％、8時間で60％、夜70％以上、2時間、80％、90％の試料をインキュベートすることによって水を除去一晩で2時間、100％（試料が連続的に水没しておくことは非常に慎重である）。 </li><li>臨界点乾燥（温度40℃、圧力80バール）により新鮮な100％アセトンおよび乾燥標本に転送されます。 </li><li>導電性カーボンセメントを用いた導電性カーボンのタブを備えたSEM試料マウントに上向き上皮で針、コルクと接着剤の試験片を取り外します。マウントと導電性カーボンのタブの間に導電性を高めるために液体の導電性の銀を使用しています。 </li><li>スパッタコーターを用いて試料の導電性白金、金またはパラジウムコーティングを準備します。 </li></ol> 5。リチャードソンのステインセミ薄切片の染色<ol><li>スライド上半薄切片を乾燥させます。 </li><li> 1〜2分間60℃で染色溶液でセクションを染色。 </li><li>アクアdestに洗ってください。 </li><li>乾燥したセクションとカバースリップ。 </li></ol> 6。代表的な結果人間の卵管の感染症モデルの中で我々は、非感染コントロール（ 図1）とCの間の上皮形態の違いを視覚化することができましたマティス -正常酸素条件下で感染したチューブ（ 図2）。特徴的な形態の違いが非感染コントロールでは検出できなかった卵管上皮細胞の病原体誘起膨潤および溶解を示唆した。半薄切片を透過型電子顕微鏡を用いて、我々は細胞内のCを証明することができました非感染コントロール（ 図4）にヒト卵管組織（ 図3、5）感染はなく、ex vivoでのクラミジア封入体形成。酸素濃度として女性の生殖管のtionsは、我々はまた、低酸素条件下で我々のモデルを検討し、炎症過程で生理的条件下で11、さらに減少の下で既に低くなっています。予備的な結果は、モデルが酸素濃度を変化させることでクラミジアの成長と子孫を分析するのに有用であることを示します。クラミジアによって誘導される上皮細胞の損傷は感染症（ 図6）の前に卵管の無謀な準備と処理を介して媒介される成果物から分離する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="図1" /> 一日のインキュベーション後、非感染ヒト卵の図1走査型電子顕微鏡（SEM）は、コントロール培地（緑色の矢印が繊毛細胞、青色の矢印を表示、非繊毛細胞を示す）。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="図2" /> 図2走査電子マイクロ<html> ex vivoでのC.トラコマティス感染したヒト卵管一日感染後（白い矢印マーク破裂インクルージョン）のコピー（SEM）。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。セミ薄いセクションでは、Cと人間の卵管の感染後に典型的な細胞内封入体（白矢印）1Dを表示クラミジアエクスビボ 。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：コントロール培地中で一日のインキュベーション後、非感染ヒト卵管の透過型電子顕微鏡（TEM）。 <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="図5" /> 図5 のex vivoでの透過型電子顕微鏡（TEM） クラミジアは、ヒトの卵管一日感染後（白矢印はクラミジア封入体にマークを付ける）を感染させた。 ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。無謀な準備と検体の取り扱い（白い矢印マークは、上皮組織の破壊）を使用して破損して卵管上皮の走査電子顕微鏡（SEM）。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

感染組織への病原体によって誘発される損害の可視化は困難とマウスの実験手順にしばしば制限されています。我々 は 、C を分析するために人間の卵管にex vivoでの感染モデルを確立上部の雌の生殖器のクラミジア感染症。この方法を使用することによって、我々はC.を可視化することができましたマティス -一日後の感染内の人間卵管上皮に起因する損傷。携帯電話の腫れや溶解はC で観察された典型的な形態変化であったマティス -非感染コントロールの感染卵管はありません。 TEM分析は、再分化した小学校の体だけでなく、永続性を示している可能性があります拡大して網目状の本体と小さい介在物の大型介在物を示す、クラミジアは、感染した組織内に典型的な細胞内発育周期を実装することを明らかにした。しかし、単独で形態学的画像は、REPLを区別するのに十分ではありません減少し代謝を特徴としていicatingと永続的な感染症は、抗菌剤10に抵抗を増加させた。 感染した卵管の上皮の破壊は 、Cの破壊のいずれかによるものであるマティス -細胞内の発育サイクルや感染小学校団体のリリースや炎症性サイトカイン8のリリースが完了した後、感染した上皮細胞。病原体によって誘発される組織の損傷および Cに対する宿主によって誘導される免疫反応クラミジアは、上皮細胞機能の喪失、線維芽細胞のリモデリングおよび in vivo 8,11 で最後に卵管不妊につながる大きな要因であると考えられている。 このモデルの大きな制限の1つは、最初のCに二次的効果の分析を阻害する炎症性細胞の不在である卵管上皮のクラミジア感染症。しかし、このモデルはapです。異なる環境条件（例えば、酸素含有量）と急性Cの最初のホスト·免疫応答を調査するためにpropriate クラミジア感染症8,9。さらに計画ではC.に対する抗菌薬のテストのためのモデルを確立することです。全体の人間の卵管にクラミジアと2光子レーザー走査顕微鏡による卵管上皮で観察された別の発達段階の代謝状態を特徴づける。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-8​​02 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPGのバッファ</td><td>さまざまな</td><td></td><td>以下のレシピを参照してください。 </td></tr><tr><td>モンティの固定</td><td>さまざまな</td><td></td><td>以下のレシピを参照してください。 </td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム緩衝液</td><td>さまざまな</td><td></td><td>以下のレシピを参照してください。 </td></tr><tr><td> Richardsonの染色</td><td>さまざまな</td><td></td><td>以下のレシピを参照してください。 </td></tr></tbody></table>レシピ： 1。 SPGのバッファ<ol><li> 75グラムのショ糖を追加します。 </li><li> 2.47グラムリン酸二ナトリウムを追加します。 </li><li> 0.36グラムナトリウム、リン酸を追加します。 </li><li> 0.72グラムグルタミン酸を追加します。 </li><li>アクアdestが1 lに記入してください。 </li><li> 7.3にpHを調整します。 </li></ol> 2。 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、7.35。 <ol><li> 42.80グラムジメチルヒ酸ナトリウム塩を追加します。 </li><li> 68.46グラムのショ糖を追加します。 </li><li>アクアdestが1 lに記入してください。 0.2 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を取得します。 </li><li>アクアをdestで希釈した溶液を使用する前に。所望の濃度にし、必要に応じて7.35にpHを調整します。 </li></ol> 3。モンティの固定<ol><li> 156ミリリットル0.12 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液を追加します。 3.2アクアdestに25ミリリットル25パーセントタルジアルデヒドを追加します。 </li><li> 19ミリリットルを追加します。アクアdestに10％のパラホルムアルデヒド。 </li><li>アクアdestに3ミリリットル三パーセントCaCl 2を追加します。 </li><li> 7.35にpHを調整し、水をdestに記入してください。 312ミリリットル最終的な解決に。 </li></ol> 4。リチャードソンの染色<ol><li>アクアdestの1％水溶液ホウ砂溶液と1％アズールIIで1％メチレンブルーの等しい部分を混在させること。 </li></ol>

の調査のための人間の卵管モデル<em&gt; c.トラコマチス</em&gt;感染症

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

クラミジアトラコマチス（C.トラコマティス ）と生殖器感染症は最も頻繁には、世界中の女性に性的に病気を送信されます。病原体の非効率的なクリアランスや永続性は上部生殖管の感染を昇順と感染組織1,2に慢性炎症性損傷を引き起こすことになっているにつながる可能性があります。その結果、骨盤内炎症性疾患（PID）、卵管閉塞と不妊のような重篤な臨床的後遺症は3,4を発生する可能性があります。 Cとの研究のほとんどクラミジアは、上皮細胞株（例えば、HEp-2細胞およびHeLa-229）または、マウスで実施されている。しかし、細胞培養ベースのモデルと同様に、彼らはどちらもネイティブの組織の生理機能やCの病態を反映しません。 in vivoで 5 のクラミジア性器感染症。さらに制限が事実によって与えられている中央のシグナル伝達カスケード（例えば、IFN-γmediat細胞内のクラミジア増殖を制御ED JAK / STATシグナル伝達経路）は、基本的にマウスとヒト6,7の間で異なる。我々や他したがって、Cの間の直接的な相互作用を調査するために全体の臓器卵管モデルを確立クラミジアと人間の卵管細胞のex vivoで 8,9。 この目的のために、子宮摘出術を受ける女性からのヒト卵管は、Cで収集し、感染したトラコマチス 24時間感染後以内に血清D.、 クラミジア·トラコマチスを検出するために走査型電子顕微鏡（SEM）および透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて分析試料は同様にCなどの上皮損傷を媒介卵組織内のクラミジア封入体形成。

我々は、説明します<em&gt; ex vivoでの感染</em人間の卵管細胞を用いた細菌の病原体からの直接的な相互作用の可視化のために&gt;モデル。全体の臓器組織モデルは、調査するために設立されました<em&gt; C.トラコマチス</em&quot;生命のような&quot;条件下での女性の卵管へ&gt;誘導病理。

の調査のための人間の卵管モデル<em&gt; C.トラコマチス</em&gt;感染症

Chlamydia trachomatis（C. trachomatis）による生殖器道感染症は、世界中の女性において最も頻度の高い性伝播性疾患である。不十分な...

Chlamydia trachomatisは、グラム陰性の細胞内寄生性細菌です。眼または生殖器系の感染症を引き起こす、異なるクラミジア血清型が知られています。C. trachomatisによる生殖器感染症は、世界中で最も頻度の高い性感染症です。欧州連合では1990年から2009年までに、報告された感染件数が約300万件に達する有病率が認められています。2009年には約400,000件の症例が報告されました。公衆衛生と性教育は絶えず向上しているものの、新規の生殖器クラミジア感染症の発生率は、1990年の70,000件から2009年には400,000件へと増加しています。全新規感染の75%が15歳から24歳の若年層で報告されています。臨床的な後遺症は、病原体の排除が不十分であるために起こると考えられており、それが下生殖器から上生殖器への上行性感染を招き、結果として感染組織に慢性的炎症性損傷を引き起こす可能性があります。chlamydia tracheitisに感染した女性の10～30%に骨盤内炎症性疾患（PID）が発症し、PID症例の最大50%がchlamydia tracheitis感染に起因しています。その結果、卵管不妊の患者の50%および異所性妊娠の患者の40%において、原因病原体としてクラミジアが検出されています。感染のない健康な女性では、受精卵は卵管を通って子宮へと移動し、そこで分娩まで発育します。感染患者では、クラミジアが下生殖器から卵管へと上昇し、慢性的な炎症プロセスを誘発することがあります。病原体によって誘導される上皮細胞の損傷および中心的な上皮細胞機能の喪失が、最終的に卵管閉塞を引き起こし、その結果、卵巣から子宮への卵子の輸送が減少または完全に消失すると考えられています。この目的のため、子宮摘出術を受ける女性からヒト卵管を採取し、保存します。採取した卵管は解剖し、慎重に開いた状態にします。実験設定に従い、それらを小さな検体へと切断し、感染性 chlamydia tracheitis elementary bodies を接種して、それぞれの時点から 24 ～ 48 時間感染させます。検体は、次なる準備まで少なくとも 3 日間、Monty's fixative で固定します。子宮摘出術を受ける女性から採取したヒト卵管 HFT は、手術直後に保存してください。抗生物質を含まない5% FCS含有RPMI中で、準備まで4°Cで保存する。全工程において、抗生物質を含まない5% FCS含有RPMIを入れたペトリ皿の中でヒト卵管を解剖する。乾燥を防ぐため、卵管は常に培地に浸しておくこと。結合組織および手術中に損傷した組織は切除して廃棄する。解剖後、小型メスを用いてHFTを慎重に開きます。ピンセットやメスの不注意な操作による組織損傷を避けてください。感染用に5 mm × 5 mmのサイズの小さな組織片を準備し、抗生物質を含まない5% FCS含有RPMI 1 mLにHFT検体を保存し、C trackを添加します。OMAS elementary bodies HFT検体は、通常のインキュベーター内（37 °C、5% CO2、20% O2）または低酸素チャンバー内（5% O2未満の低酸素環境）で、最大48時間インキュベートします。それぞれのインキュベーション時間経過後、検体を回収し、SEMまたはTEM（透過電子顕微鏡）での作製まで、Monty's Fixative中で4 °Cで少なくとも3日間保存します。固定した組織を小さく切断して洗浄し、1% osmium tetroxideと共に一晩インキュベートします。数回の洗浄および乾燥工程の後、脱水した試料を新しく調製したアイトに転写し、60 °Cで48時間重合させます。トリミング後、セミシンセクションおよびウルトラシンセクションを切出し、それぞれスライドガラスまたはグリッド上に転写します。染色後、セミシンセクションを光学顕微鏡で観察し、透過電子顕微鏡観察のための部位を確認します。標本をMonty固定液から取り出し、最大2×2×5 mmの大きさに切断します。洗浄、ナトリウムCCO希釈緩衝液でのインキュベーション、四酸化オスミウムによる洗浄、脱水、および段階的なエタノール濃度の昇圧処理の後、標本を50%プロピレンオキシドとエポキシ樹脂の混合液に一晩浸漬します。翌日、新しく調製したエポキシ樹脂に移し、少なくとも1時間静置します。その後、平型モールドに移して樹脂を満たし、60 °Cで48時間重合させます。包埋したサンプルをトリミングした後、ガラスナイフまたは（好ましくは）ダイヤモンドナイフを備えたウルトラマイクロトームを用いて、約700 nmのセミシンセクションまたは70 nmのウルトラシンセクションを作製します。セミシンセクションおよびウルトラシンセクションを用いて、光学顕微鏡および透過電子顕微鏡で試料を分析します。走査電子顕微鏡についても同様に行います。試料は上皮を上にした状態でコルクプレートにピン留めし、濃度の段階的に上げたアセトンを用いて洗浄および脱水を行います。臨界点乾燥機で乾燥させた後、試料をSEM用試料台に移し、スパッタコーターを用いて白金、金、またはパラジウムでコーティングします。これで、走査電子顕微鏡を用いた走査電子顕微鏡観察による分析の準備が整います。検体をMonty固定液から取り出し、上皮面を上にしてコルクシート上に配置し、昆虫ピンで組織片の位置を固定する。ナトリウムカコジエート緩衝液で洗浄した後、アセトン処理を行い、臨界点乾燥機で検体を乾燥させる。検体をコルクからSEM用試料ホルダーに移した後、スパッタコーターを用いて検体に導電性の白金・金またはパラジウムのコーティングを施す。スパッタ処理した検体を走査電子顕微鏡に移し、詳細な解析を行う。女性における子宮頸管感染の高い罹患率と、上行性感染による重大な臨床的影響が、この分野における基礎およびトランスレーショナル研究を強化する根拠となっています。我々は、St. Perusらのグループによって構築されたヒト卵管のexvivo組織モデルを用い、卵管におけるクラミジア誘発性の細胞損傷を形態学的に特徴づけました。この手法を用いることで、細胞内封入体の形成を異なる発達段階で観察することができ、複製段階および持続性感染の両方を確認することができました。しかしながら、ヒト卵管組織において持続性クラミジアが存在するという実験的根拠はいまだ不足しており、クラミジア、子孫、および持続性遺伝子の転写上昇に関するさらなる解析が必要である。本モデルの主な制限の一つは、炎症細胞が存在しないことであり、これが初期のKLA緑内障性感染による二次的影響の解析を困難にしている。しかし、本モデルは、卵管上皮細胞損傷の文脈における酸素含有量などの環境条件の解析や、急性緑内障性感染に対する初期の宿主免疫応答を解析するのに適していると考えられる。今後の目的の一つは、pHヒト卵管組織モデルにおけるCTUのMIC試験のためのより精緻なモデルを構築し、このモデルを用いて、二光子レーザー走査顕微鏡技術を活用し、CLIsの異なる発達段階を代謝的に定義することです。

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