ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

このビデオでは、作製した Durant HEC 2 9 3 T 細胞から分泌タンパク質を発現するための時間とコスト効率の高い手順について説明します。最初に、40%Cofluent HEC 2 9 3 T細胞培養物を6ワールドプレートで調製します。次に、遺伝子ジュースを希釈してトランスフェクション混合物を作製し、プラスミドを無血清培地で試験します。

トランスフェクション混合物を細胞上に沈着させ、細胞を摂氏37度でインキュベートしてタンパク質の発現を可能にします。Supan薬剤中のタンパク質の検出は、ウェスタンブロットによって行うことができます。適切なコンストラクトが特定されると、10層セルファクトリを使用して手順をスケールアップできます。

細胞は、トランスフェクションとしてPEIを使用してトランスフェクションされます。試薬とタンパク質は、タンジェンシャルフローろ過とそれに続くアフィニティークロマトグラフィーを使用して、培養上清から回収できます。最終的に、このプラットフォームは、ミリグラム単位で広範囲の高分子を発現することを可能にします。

この技術がバロウイルスベースの昆虫細胞発現などの既存の方法よりも優れている点は、多数のコンストラクトをスクリーニングして発現をスケールアップし、わずか3週間で結果が得られることです。この手順を示すのは、Shada ZiniとJonathan CookのHello Aidenです。私の研究室から3人の大学院生は、6ウェルプレートで1ミリリットルのボリュームでウェルあたり250、000 HEC 2 9 3 T細胞を播種することから始め、10%FBSペントレのウェルあたり1ミリリットルを追加し、DMEMを補充し、プレートをスワワーして細胞を均一に分散させます。

次に、加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。細胞が約40%の同時流暢さに達したら、SUPナタムを2ミリリットルの新鮮な培地と交換して、トランスフェクション混合物を調製します。まず、90マイクロリットルの無血清DMEMをエンドオルフチューブに分注します。

次に、3マイクロリットルの遺伝子ジュースを加え、トランスフェクション試薬でチューブの内容物を穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、ミニ調製精製プラスミドであるDNAの1マイクロリットルあたり100ナノグラムのストックを10マイクロリットル加えます。トランスフェクトされます。

チューブの内容物を混ぜ合わせ、室温で15分間放置します。トランスフェクションを行うには、混合物をHEC 2 9 3 T細胞に沈着させます。一滴ずつプレートを静かに膨潤させて、トランスフェクション混合物を均等に分配します。

その後、細胞を摂氏37度でインキュベートします。24時間後、各ウェルに1ミリリットルの新鮮な培地を加え、さらに48時間インキュベートします。トランスフェクションの3日後、すり酸を回収し、ウェスタンブロットにより目的のタンパク質の発現レベルを検出します。

適切なコンストラクトが特定されたら、トランスフェクション手順をスケールアップできます。10層セルファクトリーを使用して、セルファクトリーに1.2リットルのDMEMを5%FBSで満たします。次に、2億個のHEC 2 9 3 T細胞を追加し、細胞をすべての層に均等に分散させます。

100%Coの流暢さまで成長した4つのT 225 cm角細胞培養フラスコには、約2億個の細胞が含まれています。細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。トランスフェクション混合物をT 75フラスコで調製し、840 μgram の DNA を 84 mL の滅菌液で 1 回希釈します。PBSの。

ミリリットルあたり1ミリグラムの2.5ミリリットル、ポリエチレンイオン溶液またはPEIを加え、室温で15分間インキュベートします。解決策は曇るはずです。次に、トランスフェクション混合物を細胞工場にゆっくりと注ぎ、完全に分配します。

全体的なレイヤー。バルプロ酸を最終濃度4ミリモルで加えます。これにより、トランスフェクション混合物を添加すると、発現収量が増加します。

培養物を摂氏37度で4日間インキュベートし、タンパク質の発現を可能にします。トランスフェクションの4日後に培地を収穫し、すぐに再利用のために細胞工場を清掃し、収集した培地を6, 000Gで摂氏4度で30分間遠心分離し、0.22ミクロンの立体カップ真空フィルター装置でろ過して粒子状物質を除去します。次に、centra mate tangential flow filtration システムを使用して、上清を 75 ミリリットルに濃縮します。

上清が濃縮されると、目的のタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーで精製できます。この実験では、ここで説明した大規模システムを使用して、ヒトAALの2つの受容体細胞外ドメインのHAタキシングサブユニットを精製し、続いて高親和性抗THAクロマトグラフィーを精製しました。このkumasi染色SDSページ分析に示されているように。

インターロイキンの2つの受容体αおよびγサブユニットの細胞外ドメインは、40キロダルトンと46キロダルトンの分子量で移動します。IL 2 R α および IL 2 R γ に存在する EnLink 糖鎖の不均一性により、SDS ページゲルのバンドが広がりました。高分子量のバンドは、BSAの汚染を表しています。

このビデオを見れば、10層の細胞工場を使用してヒト細胞培養からタンパク質を発現する方法を十分に理解できるはずです。HC 2 93 T細胞はバイオハザードと見なされ、バイオセーフティレベル2で取り扱う必要があることを忘れないでください。常に適切な個人用防護服を着用し、表面は機関および政府のガイドラインに従って消毒する必要があります。