Bio - Rad社のTotal RNA Kitを使​​用してNeuroprecursor細胞からのRNA抽出

こんにちは。私はカリフォルニア大学アーバイン校のEd Maki博士の研究室に所属する大学院生のJosh Shです。ここでは、BioRad社のRNA mini kitを用いて、神経前駆細胞からRNAを抽出する方法を説明します。私はこの研究室で数年前からこのキットを使用していますが、常に高い収量で安定した結果が得られています。

使用する細胞は、胚皮質から急性解離させたE14.5神経前駆細胞です。通常、PDLおよびラミネートでコーティングされた24ウェル組織培養処理プレートに播種し、1ウェルあたり10万個の細胞でプレートします。開始する前に、RNA作業専用のベンチで作業する必要があることをお伝えしておきます。まず最初に、RNAベンチが清潔であることを確認してください。

ベンチを洗浄する適切な方法は、このRNA zapを使用することです。基本的に、これはすべてのRNAを分解します。その理由は、RNaseがRNAを破壊するためです。もう一点は、抽出操作を行う際は常に手袋を着用することです。皮膚にはこれらのRNAが大量に存在しているためです。

ですから、それは絶対に避けてください。さて、ここにBioRad total RNA mini kitを用意しています。中身を取り出しましたので、何が入っているかお見せしましょう。

まず、X dep C処理済みのPBSと、70% DEP処理済みのエタノールを用意します。次に、エタノールを添加した全RNA溶解溶液を用意します。続いて、100%エタノールを添加した低ストリンジェンシー洗浄液、高ストリンジェンシー洗浄液、DNA希釈溶液、DNA本体、および全RNA溶出液を用意します。

この溶液を70°Cのヒートブロックに入れます。他に準備するものとして、1.5 mLのキャップ付きチューブがあります。これらにDNAやRNAが含まれていないことを確認し、それらが混入していないチューブを使用してください。

そして、2 mLのキャップレスチューブが2本あります。そして何よりも重要なのが、RNAカラム自体です。これ 없なければ、RNA抽出を行うことはできません。

これらのカラムを組み立てるには、RNAカラムと2 mLのキャップレスチューブが必要であり、このように組み合わせれば準備完了です。さて、最後に常に必要となるのがこれらの細胞です。ここで使用する細胞は、Eton 1.5 神経前駆細胞です。

胚皮質から急性解離させました。これらの細胞を数日間、培養液で培養しました。37°Cのインキュベーターから細胞を取り出しました。

このプロトコルは接着細胞に特化したものです。これらの細胞は、PDLおよびラミネートでコーティングされた組織培養処理済みの0.4ウェルプレートで培養されました。それでは、バキュームホースを使用して培地を吸引除去します。

次のステップは、dep SEA PBSを約500 µL加えることです。ここでも、フィルターチップを使用します。PBSを加えることで、基本的に培地を洗い流します。

RNAカラムに培地成分が混入したり、RNA抽出を妨げたりすることを避ける必要があります。そうでないと、十分な収量が得られません。神経幹細胞はPBSを好まないため、すぐにPBSを吸引します。次に、それぞれに350 µLの溶解バッファーを加えます。

改めて、ライシスバッファーにβ-メルカプトエタノールが添加されていることを確認してください。次に、細胞を完全に溶解させ、内部のRNAを抽出できるように、ライシスバッファーをピペッティングで15回混ぜ合わせます。

次に、各ウェルに70%エタノールを添加します。この70%エタノールを350 µLずつ加え、各ウェルで10回ピペッティングします。各ウェルに対して10回ずつピペッティングを行いました。各ウェルの合計容量は700 µLであるため、ピペッターの設定を700 µL以上に合わせます。

次に、700 µLを超える分を回収し、それをRNAカラムに分注します。カラムの内容物を加えた後、遠心機に入れ、最大速度で30秒間遠心分離します。溶解物の最初の30秒間の遠心分離後、ろ液を空の容器に捨てて廃棄します。

または、バッキングホースを使用してろ液を吸引する方法もあります。次に、低ストリンジェンシー洗浄バッファーを700 µL加えます。ここでも、必ずエタノールを加えてください。

次に、最大速度で30秒間遠心分離します。低ストリンジェンシー洗浄バッファーで洗浄した後、ろ液を捨てます。いいですね。その後、DNA溶液を調製します。

各サンプルに5 µLのDNAを添加します。酵素であるため、私たちは実際に開始前にDNAを分注しています。

これらは分注して保存するのが望ましいです。まとめて保存すると、凍結融解によって酵素活性が失われてしまいます。そのため、5 µLのDNAを加えた後、75 µLのDNA希釈溶液で希釈します。

それを加えると、DNA溶液の全量は80 µLになります。次に、各サンプルにDNA溶液を80 µLずつ加えます。カラムのメンブレンの上に確実に滴下させてください。

DNA溶液をメンブレンに吸着させます。これにより、DNAが除去され、RNAの回収率を高めることができます。

DNAを添加した後、酵素を作用させるため、カラムを室温で15分間静置します。繰り返しになりますが、15分間インキュベートしてください。さて、タイマーが鳴りました。

15分間のインキュベーション後、遠心機に移し、最大速度で30秒間DNAをスピンダウンさせます。30秒間の遠心によりDNAを回収した後、ろ液を廃棄します。次に、残留しているDNAを洗浄するために、700 µLの高ストリンジェンシーバッファーを加えます。

それを加えた後、再び遠心機で30秒間遠心分離します。遠心後、高ストリンジェンシーのろ液を容器に捨てて除去します。そして、700 µLの低ストリンジェンシーバッファーを加えます。

今回は、Centri Beachを用いて最大速度で1分間遠心分離します。最初の1分間の低ストリンジェンシー洗浄後、ろ液を捨てます。そして今回は何も添加せず、さらに2分間遠心分離して、余分な低ストリンジェンシー洗浄液を取り除きます。低ストリンジェンシー洗浄液にはエタノールが含まれており、それが原因でRNAの回収率が低下するためです。

それでは、70°Cに設定したヒートブロックから溶出バッファーを取り出します。改めてご注意いただきたい点として、実験を開始する前に必ず溶出バッファーを70°Cに加熱しておいてください。バッファーを温めておくことで、RNAの回収効率を高めることができます。カラムの準備は整っています。

遠心分離機から取り出した後、次のステップとしてカラムを取り出します。まず、キャップ付きチューブを廃棄し、こちらのキャップ付きチューブに移し替えます。

各カラムにLucianバッファーを50 µLずつ加えます。メンブレンにバッファーが十分に行き渡り、しっかりと浸透するようにしてください。適切に行われない場合、良好なRNA収量が得られません。

ここで、溶出液がカラムのメンブレンに十分に浸透するように、1〜2分間静置します。1分経過しました。これで遠心機に移動させることができます。

それでは、カラムを遠心機にセットします。最大回転数で1分間遠心します。これが最後の遠心ステップであり、これにより溶出された汚染物質またはRNAをこれらのキャップ付きチューブに回収します。

最後の遠心分離が終わったら、中身を取り出し、カラムを除去して廃棄してください。チューブに蓋をし、-80°Cで保存します。これにより、後で必要に応じて使用することが可能です。以上で、BioRad RNA kitを用いたRNA抽出が完了しました。次に、抽出したRNAの濃度を測定するか、分光光度計を用いてOD値を読み取ります。

これから手順を説明します。まず、希釈液を作成する必要があります。ここでは1対5の希釈を行います。

RNAとMilli-Q超純水を混合します。まず、ブランク（空白試料）を作成します。RNAの溶出に使用した溶出液を2 µL取り、そこにMilli-Q超純水を8 µL加えます。

これがブランクとなります。次に、サンプルを調製します。目的のRNAを2 µL使用します。

再び、8 µLのMQ水を追加します。これで1/5希釈になりますね。サンプルを入れるためのこのキュベットを用意し、これを分光光度計にロードします。

それでは、測定を行いましょう。RNAサンプルのOD値を測定する前に、キュベットを洗浄する必要があります。こちらがガラスキュベットです。

表面には決して触れないでください。指紋が付着すると、誤った測定値が出る原因となります。そこで、まず最初に行うのは、ガラスキュベットをダブルDIウォーターで洗浄することです。

次に、バキュームホースを使用して水を吸引します。その後、95% ethanolで洗浄し、再びバキュームホースを用いてethanolを除去します。

それでは、ブランクをロードします。測定値を正規化するために、まずブランクが必要になります。先ほど作成したミックスを10 µL分取り出します。

溶液を上下に混ぜ合わせて、均一な混合液にします。次に、この分光光度計に溶液を移します。使用するのはUltra Spec 3, 100 probeであり、これでRNA濃度を測定します。

装置を開き、これらのホルダーのいずれかにセットします。RNAのみを読み取るようにプログラムを操作します。なお、希釈倍率は1/5としています。

希釈倍率を5に設定します。準備が整いましたので、「run」を押してブランクの参照を行います。

これでゼロ点調整が完了しました。これでサンプルの測定準備が整いましたので、ガラス製のキーベッドを取り出します。

ブランクの内容物を吸い出します。次に、2倍量の超純水（DI water）で洗浄します。その後、5%エタノールで洗浄します。

それでは、目的のサンプルを10 µLロードします。ここでも、サンプルを十分に混合させてから、ガラスキュベットにロードするようにしてください。

これで読み取りの準備が整いました。OD値を測定した後、良好な収量と純度である場合の目安は、RNAの吸収比が2.60から2.80の間であり、約2.0であることです。また、収量は1µLあたり約144µgとなります。

装置には1mlあたり72µgと表示されていますが、我々のベクターの長さが半分であるため、この値を2倍にする必要があります。2cmの箇所で、神経前駆細胞からRNAを抽出する方法を説明しました。ここでも、BioRad社のtotal mini RNA kitを使用しています。他のキットも試しましたが、効率の面からこのキットが最適であると判断しました。

これにより、高品質なRNAが得られます。このキットを使用すれば、私たちが常に得ているのと同様の高品質な結果を得ることができます。