超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

本実験の全体的な目的は、マンガン増強MRIを用いてマウスの神経活動をイメージングすることです。これは、一方の感覚野を刺激し、対側バレル野皮質における神経応答をマッピングすることで行われます。最初のステップは、信号発生器およびアンプで駆動される非集束超音波トランスデューサからなる超音波システムを組み立て、本実験に向けて校正することです。

マンガンを腹腔内注射した後、超音波とマイクロバブルを用いて血液脳関門を開放し、マンガンを脳実質内に進入させます。次に、マウスに神経刺激パラダイムを適用し、脳のより活動的な領域においてマンガンの蓄積量を増加させます。最終的にMRI画像を撮影し、脳内のマンガン蓄積レベルの違いに基づいた T1強調MR画像強度の領域差を可視化します。

神経科学において、マウスは脳の発達および疾患の遺伝的・分子的な基盤を研究するための主要なモデルシステムです。本手法は、これらのマウスモデルにおける神経活動をマッピングするための非侵襲的なツールを提供します。血液脳関門の超音波破砕は、機能的神経イメージングを目的としてマンガンを脳実質に届けるために利用できるだけでなく、ガドリニウムベースの造影剤や化学療法剤を含む、多種多様な他の化合物を脳実質に届けるためにも利用可能です。

一般的に、この手法を初めて行う方は、超音波システムのキャリブレーションやマイクロルールの取り扱いに苦労することがあります。そのため、当研究室では技術者が一人ひとりに手順を実演して指導します。超音波システムは、マウスの脳をカバーするのに十分な直径を持つ単一素子の超音波トランスデューサーと、2 MHzの範囲の中心周波数で構成されています。

トランスデューサは、信号発生器と50デシベルのパワーアンプによって駆動され、超音波パルスシーケンスを生成します。水槽内で超音波システムの校正を行います。ハイドロフォンを水槽の底に配置し、3軸翻訳ステージを用いてその上にトランスデューサを設置します。

次に、正弦波パルスの短いトレインをトランスデューサに印加し、ステージを調整して最大応答点を探します。この点は超音波ビームの中心かつトランスデューサの自然焦点にあるはずです。続いて、一連の入力電圧において音圧測定を数回行い、線形回帰を用いて入力電圧と音圧の関係を推定します。約0.36 megapascalsの最大負音圧を発生させるためのパルス振幅を決定してください。

このステップでは、ノーズコーンを通じてイソフルランを投与し、動物を麻酔します。ノーズコーン装置は、動物の頭部を毎回正確かつ確実に同じ位置に固定する必要があります。実験中に頭部を頭蓋骨が平らな状態で保持するために、ニューマチックピローを使用します。呼吸数をモニタリングし、呼吸数が分間85回から125回の間になるように麻酔薬を調整してください。同時に、直腸プローブで動物の体温をモニタリングし、ヒートランプまたは送風を用いて体温を維持します。

その後、動物に尾静脈カテーテルと腹腔内カテーテルを挿入します。次のステップでは、第VII脳神経の片側刺激を実証し、対側バレル野皮質におけるニューロン応答をマッピングするため、被毛をトリミングします。毛包や周囲の皮膚に刺激を与えないよう、対側の第VII脳神経を皮膚表面にできるだけ近い位置で切断します。

次に、動物を超音波診断装置へ移動させ、頭部に超音波ジェルを塗布し、その上に水柱を含む薄いプラスチックシートを被せます。綿棒を用いて水柱の中に手を伸ばし、超音波ジェル内に閉じ込められた気泡を押し出して取り除きます。その後、超音波トランスデューサーを、マウスの脳の直上の自然焦点距離に合わせて水中に配置し、指でトランスデューサーを拭って、付着した気泡を除去します。

その後、バイアルをアジテーターで45秒間振盪し、ペリン脂質マイクロスフィアを調製します。バイアルは室温で保存しますが、その日の最後の使用後は冷蔵庫に保管し、翌日の最初の使用前に取り出してください。翌日以降は、保存していたバイアルを再びアジテーターで振盪してください。

次に、塩化マンガンを 0.5 millimole per kilogram 腹腔内投与し、分布させるために10分間待ちます。その後、マイクロバブルのバイアルを手で1分間振とうし、マイクロスフィアを再懸濁させます。続いて、30 microliters とカテーテルの死容量分を採取します。

バイアル内に空気を注入すると、残りのマイクロバブルが劣化するため注意してください。直ちに超音波パルスシーケンスを開始し、遅延を最小限に抑えて尾静脈カテーテルからマイクロスフィアを注入します。その後、3分間ソニケーションを継続します。

その後、超音波システムをオフにします。脳内のマンガン濃度が約40分間で安定した後、イソフルランを停止し、ノーズコーンを取り除きます。この時点で、バレル野皮質をマッピングするための神経刺激パラダイムを開始します。

対側のvibraアレイに対して、ペイントブラシを約1〜5 Hzの円運動で90分間動かします。刺激後、麻酔を再開し、体温の維持を続けながら、呼吸数が分間85〜125回になるようにisof fluorineのレベルを調整します。次に、マウスをMRIコイルに配置し、MRIシステムへ移送します。

次に、ここで示すように、高解像度の3枚のT1強調画像を取得します。マンガンやガドリニウムベースの造影剤などのT1短縮造影剤を投与した後、血液脳関門が破綻すると、BOMAを実施しなかった脳と比較して、T1強調画像上の脳実質で信号強度が上昇します。1列目には、7匹の動物においてrisiを片側性に刺激することで作成された神経活動マップを示します。

2つの異なる部位における差分マップは、刺激側とは反対側でMRI信号が増加していることを示しています。2列目のp値マップは、これらの差の相対的な有意性を示しています。3列目の対応する脳アトラス図は、これらの活性領域が一次感覚皮質のバレル野に相当することを示しています。

習熟すれば、この手法はシミュレーションの時間を除いて約2時間で完了できます。手順を実行する際は、注入前にマイクロバブルのバイアルを撹拌すること、およびバイアル内に空気を注入しないよう注意することが重要です。さらに、超音波用ジェル内や超音波トランスデューサの下に気泡が混入していないことを必ず確認してください。

今回のデモンストレーションでは、ひげへの刺激を選択しましたが、この手法を応用すれば、あらゆる関心のある刺激を研究することが可能です。この手順の後、動物は完全に回復するため、縦断的な研究を行うことができます。