Name: 成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶ成体マウス前脳の急性スライスにおける神経芽細胞のタイムラプスイメージング法。広視野蛍光顕微鏡を用いて神経前駆細胞の動的移行を観察し、神経発生の細胞機構を解明する。

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この作品は、部分的にラヴァル大学の交わりによってサポートされていましたASJKに健康研究（CIHR）助成金のカナダの協会によってサポートされていました。 ASは出生後の神経発生におけるカナダリサーチチェアの受取人である。

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
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<li>Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+subventricular+zone+stem+and+progenitor+cells+are+sessile+and+epidermal+growth+factor+receptor+negatively+regulates+neuroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration.</a> PLoS One. 4, e8122(2009).</li>
<li>Bortone, D., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCC2+expression+promotes+the+termination+of+cortical+interneuron+migration+in+a+voltage-sensitive+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner.</a> Neuron. 62, 53-71 (2009).</li>
<li>Comte, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

適切な脳領域に神経前駆細胞の正確なターゲティングは、神経回路の適切なアセンブリと関数の基礎となる基本的なプロセスです。細胞の大半は、胚発生中に移行し、唯一のそのようなOB、歯状回および小脳な​​どのいくつかの地域では、出生後の脳では、ニューロンの変位は、まだ行われます。出生後の脳内の細胞遊走を編成するメカニズムはよくわかっていない、しかし、残っている。成熟した神経組織において細胞遊走を誘導に関与する機序と分子経路の知識は、生後脳における神経ターゲティングの我々の理解を改善し、脳の病気の領域に神経細胞の動員を誘導するために新たな戦略を開発するための臨床的意義を持っているかもしれません。 本稿では、成体マウスの前脳の急性スライスにおける細胞移動を監視するためのプロトコルを記述します。我々は、成人SVZ-OBを使用しながらモデル系として経路は、同じ技術が胚および生後初期の脳内だけでなく、成人の脳損傷後における細胞遊走をフォローするために適用することができる。我々は、小脳や成人脳卒中後の線条体（Eiriz、グレード、マルバとSaghatelyan、未発表データ）、出生後早期のRMS <su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ</td><td> S9378 </td></tr><tr><td>グルコース（ACSF） </td><td> EMD </td><td> DX0145-3 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td>シグマ</td><td> S9625 </td></tr><tr><td> KCI </td><td>シグマ</td><td> P9541 </td></tr><tr><td> MgCI 2 x6H 2 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M2670 </td></tr><tr><td> NaHCO 3を </td><td>シグマ</td><td> S5761 </td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4·xH 2 Oを</td><td> EMD </td><td> SX0710-1 </td></tr><tr><td> CACI 2 x2H 2 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C3881 </td></tr><tr><td>デキストランTexasRed </td><td>インビトロジェン</td><td> D1864 </td></tr><tr><td>デキストランカスカdeBlue </td><td>インビトロジェン</td><td> D1976 </td></tr><tr><td>グルコース（40X溶液） </td><td>シグマ</td><td> G8769 </td></tr><tr><td>ナトリウムpyruvat </td><td>ギブコ</td><td> 11360-070 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H3375 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td>ギブコ</td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>シグマ</td><td> D-5025 </td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA </td><td>ギブコ</td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> Neurobasal培地</td><td>ギブコ</td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> EMD </td><td> 2930 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td>ケタミン/キシラジン</td><td> CDMV </td><td> 5230 </td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td></tr><tr><td> 15 mlコニカルチューブ</td><tD&gt;ザルスタット</td><td> 62.553.205 </td></tr><tr><td> 50 mlコニカルチューブ</td><td>ザルスタット</td><td> 62.547.205 </td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー（定位注射） </td><td> WPI </td><td> 4878 </td></tr><tr><td>灯油</td><td> EMD </td><td> PX0045-3 </td></tr><tr><td> Proviodine </td><td>ルジェ</td><td> 65655-1370 </td></tr><tr><td>縫合</td><td> Stoelting </td><td> 50487 </td></tr><tr><td> Anafen </td><td> CDMV </td><td> 11508 </td></tr><tr><td> 20ccのシリンジ</td><td> VWR </td><td> SS-20L2 </td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td> VWR </td><td> 25384-094 </td></tr><tr><td>寒天</td><td>ラボラトリーマット</td><td> AP-0108 </td></tr><tr><td>グルー</td><td> Permabond </td><td> 910 </td></tr><tr><td> 95％O 2/5％CO 2で </td><td>リンデ</td><td> 24068835 </td></tr><tr><td>ブレード&lt;/ TD&gt; <td> WPI </td><td> 501901 </td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> 64から0198 </td></tr><tr><td>遠心</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5702 000.019 </td></tr><tr><td>ピペットプラー</td><td>サター·インストゥルメント</td><td> P-97 </td></tr><tr><td>ナノリットルインジェクタ</td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td></tr><tr><td>定位注入装置</td><td> WPI </td><td> 502900 </td></tr><tr><td>マイクロドリルシステム</td><td> WPI </td><td> 501819 </td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 920110 </td></tr><tr><td>広視野の蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BX61WIF </td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td> Photometrics </td><td> CS-HQ2-D </td></tr><tr><td>超静音イメージング室</td><td>ハーバード装置</td><td> 64から1487 </td></tr><tr><td> PH-1シリーズ20ヒータープラットフォーム</td><td>ハーバード装置</td><td> 64から0284 </td></tr><tr><td>暖房装置</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> TC-344B </td></tr><tr><td> 40X水浸対物レンズ</td><td>オリンポス</td><td> 1-UM587 </td></tr><tr><td> 10Xの水浸対物レンズ</td><td>オリンポス</td><td> 1-UM583 </td></tr><tr><td>ラムダDG-4 </td><td>サターインスツルメンツ</td><td> DG-4/OF </td></tr><tr><td> MetaMorphソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td> 4万</td></tr><tr><td> Imarisソフトウェア</td><td>ビットプレン</td><td> BPI-IM70-F1 </td></tr></tbody></table>

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

新しい機能性ニューロンが恒常的に成体哺乳類の脳の制限区域内の神経幹細胞の内因性のプールから生成されていることを示す証拠の実質的なボディがあります。脳室下帯（SVZ）から新生児神経芽細胞は、嗅球（OB）が1で、最終的な宛先に吻側渡り鳥ストリーム（RMS）に沿って移行します。 RMSで、神経芽細胞は、構造的な支持と移行4,5に必要な分子因子の供給源としての血管を使用して星状膠細胞の突起2,3によってensheathedチェーンで接線方向に移行します。 OBで、神経芽細胞はチェーンから切り離し、それらは介在ニューロンに分化し、既存のネットワーク1、6に統合異なる球層に放射状に移行します。 本稿では、我々は齧歯類の脳の急性スライスにおける細胞移動を監視するための手順を説明します。急性スライスの使用はassessmを許可密接にインビボ条件および in vivoイメージングにアクセスが困難な脳領域でに似ているという微小環境における細胞移動のENT。さらに、それは最終的に細胞の遊走特性を変化させることができる器官および細胞培養の場合のように、長い培養状態を回避できます。急性スライスにおける神経前駆細胞は、DIC光学または蛍光タンパク質を用いて可視化することができます。野生型マウスのSVZにレポーターマウスから神経芽細胞を移植し、神経芽細胞に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いてSVZにおける神経前駆細胞のウイルスラベリングは、神経芽細胞を可視化し、それらの移動を追跡するためのすべての適当な方法である。後者の方法は、しかし、個々の細胞が原因で標識された細胞の高密度の長時間追跡することはできません。我々は、比較的急速な取得間隔（1つのIMAを達成するためにCCDカメラを搭載した広視野の蛍光正立顕微鏡を使用確実に静止して渡り鳥のフェーズを識別するために、GEごとに15または30秒）。静止および移動相の持続時間の正確な同定結果の明確な解釈のために重要である。我々はまた、3Dでの神経芽細胞の移行を監視するために複数のzステップの買収を行いました。広視野の蛍光イメージングは、ニューロンの移動7-10を視覚化するために広く使用されています。ここで、我々は、神経芽細胞を標識成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の遊走をリアルタイムにビデオ撮影を行うと、細胞遊走を分析するための詳細なプロトコルを記述します。説明されたプロトコルは成人RMSでの神経芽細胞の遊走を例示したが、それは、胚や初期生後脳における細胞移動を追跡するために使用することができます。

我々は、マウスの前脳におけるニューロン移動のリアルタイムvideoimagingためのプロトコルを記述します。ウイルス標識又はグラフト神経前駆細胞の遊走は、固定と移動相の持続時間と速度を含む細胞遊走のさまざまなフェーズを、勉強するのは比較的急速な取得間隔と広視野蛍光イメージングを用いた急性スライスのライブで録音された移行。

内因性の神経幹細胞プールから、新しい機能的ニューロンが恒常的に生成されていることを示す実証的な根拠が数多く存在します。

本手法の全体的な目的は、成体マウス脳の急性切片におけるニューロブラスト（神経芽細胞）の遊走を研究することです。まず、成体脳の脳室下帯にある神経前駆細胞を標識し、ニューロブラスト標識の5〜8日後にマウス脳の急性切片を作製することでこれを達成します。次に、ニューロブラスト遊走のタイムラプスイメージングを行います。最終的に、急性切片におけるニューロブラストの移動ダイナミクスを提示するために、広視野リアルタイム顕微鏡観察を用います。この手法は、細胞移動に関与するさまざまな分子シグナルや細胞メカニズムの役割を研究することで、神経発達分野における重要な疑問への解答に寄与します。本手法は、成脳における神経移動を制御する生理学的プロセスへの知見を提供しますが、虚血脳における神経移動や胚発生期の研究など、他の系にも適用可能です。まず、スライス作成用のスクロースベースの人工脳脊髄液と、イメージングまでスライスを維持するための32 °Cの塩化ナトリウムベースのA CSFを準備し、次に95%酸素、5%二酸化炭素を連続的にバブリングさせて溶液に酸素を供給します。次に、蛍光標識したニューロブラストを含むマウスを、ケタミン・キシラジンを用いて腹腔内投与により麻酔します。その後、液体窒素を用いて、ゼリー状の外観を持つ氷冷切片作成液を迅速に準備します。その後、20 cc シリンジで氷冷した切片作成用溶液を 15 から 20 milliliters 吸い取り、マウスを心内灌流します。切片作成用溶液による灌流の代わりに血管を標記させる必要がある場合は、10 milligrams per milliliter 濃度の dextran Texas red を 200 microliters 心内注入で心臓の左心室に注入し、2 〜 3 分間待機します。心内灌流後、マウスを速やかに断頭し、頭部を氷冷した切片作成用溶液に浸し、バイブラトームへ移動させます。小脳から嗅球にかけて、矢状縫合に沿ってハサミで頭蓋骨を切開します。続いて、ピンセットを用いて頭蓋骨のフラップを慎重に取り除きます。その後、メスを用いて脳の底部を切り出します。次に、各半球の最も外側に2本の正中切開を加え、大脳半球間裂に沿って脳を切断します。その後、スパチュラを用いて脳を慎重に取り出し、氷冷した切断用溶液に入れます。2つの脳半球を、背側がアガーに接するように、それぞれ4% agarブロックの上に配置します。次に、2つの脳半球の側切面があるブロックを、内側が上を向くようにVibramのプラットフォームに接着します。その後、プラットフォームをVibramチャンバー内に設置します。切片作成溶液を満たします。次に、95%酸素、5%二酸化炭素をバブリングし、切片作成の間、溶液に常に酸素を供給し続けます。これで、バイブレーターを用いて厚さ250 micronの切片を作成します。高品質な切片を得るためには、低速の切削速度と高周波のブレード振動を用いる必要があります。切片がブレードから離れたらすぐに、切削液から慎重に取り出し、ウォーターバスで32 °Cに維持された酸素供給済みのA CSFを満たしたインキュベーションチャンバーに入れます。この手順では、イメージング中の切片のドリフトを防ぐため、顕微鏡のイメージングチャンバーに切片を注意深く配置してください。ナイロンメッシュを慎重に上に置いて固定します。スライスに人工脳脊髄液（A CSF）が絶えず灌流されていることを確認してください。次に、10倍対物レンズを使用して、目的の視野を探します。Metamorphソフトウェアを起動し、ナイロンメッシュがイメージング領域を遮っていないことを確認します。次に、40倍の対物レンズを装着し、焦点を調整します。対物レンズと切片の間に十分な溶液があることを確認してください。MetaMorphソフトウェアを使用して、励起時間、Z平面数、各Zセクション間の距離、時間間隔、および記録時間などのタイムラプス撮影パラメータを設定します。その後、タイムラプス撮影を開始します。データはMetaMorphによってtiffファイルとして自動的に保存され、各ファイルが撮影されたタイムラプスビデオの1つのタイムポイントに対応します。これらのファイルをMrs.で開いて動画を再生します。ビデオの最初のタイムポイントの画像をプログラムアイコンにドラッグ＆ドロップして、取得した画像を読み込みます。ムービーが読み込まれたら、表示調整ウィンドウで信号の明るさとコントラストを調整します。画像プロパティで、ボクセルサイズや時間間隔などの取得ビデオのパラメータを設定し、等間隔のタイムポイントウィンドウを設定します。ボクセルサイズを指定した後、録画された細胞を自動的に追跡するために、フレームを3Dで表示し、ビデオの時間とスケールを確認することができます。spots機能を選択し、surpassウィンドウ内で視野内の各細胞にスポットを作成します。次に、sliceウィンドウで追跡対象となる細胞の直径を測定します。追跡のためのパラメータを設定し、処理を進行させてください。検出されたオブジェクトの経時的な信頼性を確認します。移動細胞がすべて自動的に検出されない場合は、検出閾値を変更し、すべてのタイムポイントにおいてすべての細胞がスポットとして選択されていることを確認してください。プログラムがタイムポイントを接続できるよう、同一トラックの隣接するタイムポイントを表す2つのスポット間の最大距離および最大ギャップサイズを指定する必要があります。トラックの作成後、不要なトラックを単純に削除することで、フィルタリングと除去が可能です。すべての修正が完了したら、異なるトラック間や同一トラック内の異なる時点を接続・切断することで、トラックを補正できます。最後にトラック全体を確認し、各時点の細胞変位、トラック長、変位長、およびトラック時間をはじめとするデータをExcelファイルにエクスポートします。このビデオでは、デキストラン・テキサスレッドで標識された血管に沿った緑色の神経芽細胞の移動のタイムラプスイメージングを示しています。移動する神経芽細胞は、移動相が静止期によって中断されるという跳躍的な挙動を示すことに注目してください。また、このビデオでは、Imarisソフトウェアによる神経芽細胞の移動トラッキングを示しています。球体と線は、それぞれ個々の細胞の細胞体と移動軌跡を示しています。この手順を行う際は、成体マウス前脳の高品質な急性生存切片を得ることが重要である点に留意してください。また、イメージング中の切片のドリフトを防ぐため、ナイロンメッシュを慎重に配置し、イメージングチャンバー内で切片を十分に安定させる必要があります。人工脳脊髄液（A CSF）灌流速度の変化、不規則な灌流、または急激な温度変化は、イメージング中のドリフトや焦点面の変動を引き起こす可能性があります。このビデオを視聴することで、成体急性切片におけるニューロブラストの遊走の記録および解析方法について十分に理解できるはずです。遊走相と静止相の開始および終了を確実に特定するために、15から30秒程度の短い撮影間隔を使用することをお勧めします。

time-lapse-imaging-neuroblast-migration-acute-slices-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

出典: Wiegreffe, C., et. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain using In Utero エレクトロポレーション. J. Vis. Exp. (2017)...

形質導入マウス胚脳切片における皮質ニューロン放射状移動のタイムラプスイメージング

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。...

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。...

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated...

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

磁気共鳴イメージング（MRI）は、遺伝子組み換えマウスの表現型を調べるために、ますますよく使われる道具となっている。この記事では、複数のマウスMRIを用いて遺伝子組み換えマウスのハイスループット表現型解析を実現するために必要なメソッドを示しています。...

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

現在のビデオは、開発ゼブラフィッシュの脳内の個々の神経前駆細胞のライブイメージングを実行するためのエレクトロポレーション、共焦点顕微鏡の組み合わせを活用する方法を示しています。...

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

記録カルシウム活性のためのカルシウムインジケーター色素と脳室下帯（SVZ）細胞をロードする方法について説明する。生後SVZは、神経前駆細胞および神経芽細胞を含む、密に詰まった細胞が含まれています。むしろ風呂ローディングを使用するよりも、我々はより良​​い染料拡散を可能にする組織内部の圧力によって色素を注入した。...

カルシウムイメージングの急性脳室下帯スライスの調製

隔離された海馬から急性脳スライスだけでなく、アストロサイトとニューロンの同時電気生理学的記録の準備...

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

学ぶ成体マウス前脳の急性スライスにおける神経芽細胞のタイムラプスイメージング法。広視野蛍光顕微鏡を用いて神経前駆細胞の動的移行を観察し、神経発生の細胞機構を解明する。

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

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