成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

我々は、マウスの前脳におけるニューロン移動のリアルタイムvideoimagingためのプロトコルを記述します。ウイルス標識又はグラフト神経前駆細胞の遊走は、固定と移動相の持続時間と速度を含む細胞遊走のさまざまなフェーズを、勉強するのは比較的急速な取得間隔と広視野蛍光イメージングを用いた急性スライスのライブで録音された移行。

この手順の全体的な目標は、成体マウスの4つの脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移動を研究することです。これは、まず、神経芽細胞標識の5〜8日後に成体脳室内ゾーンのニューロン前駆細胞を標識し、脳用のマウスの急性スライスを調製することによって達成されます。次に、神経芽細胞の移動のタイムラプスイメージングを行います。

最終的には、広視野リアルタイム顕微鏡法を使用して、急性切片における神経芽細胞の移動のダイナミクスを示します。この方法は、細胞の移動に関与するさまざまな分子的手がかりと細胞メカニズムの役割を研究することにより、ニューロン発生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。現在、この方法は、成人の脳の神経移動を調節する生理学的プロセスについての洞察を提供することができますが、虚血性脳の神経移動や胚発生中の神経移動の研究など、他のシステムにも適用できます。

この手順は、スライスを切断するためのスクロースベースの人工脳脊髄液と、イメージングまでスライスを維持するための摂氏32度の塩化ナトリウムベースのA CSFを準備することから始めます。次に、ケタミンキシラジンをインターアナルに使用して、蛍光標識された神経芽細胞でマウスに麻酔をかけます。次に、液体窒素を使用してゼリーのような外観の氷冷切断液をすばやく調製します。

その後、20ccのシリンジで15〜20ミリリットルの氷冷切断液を取り、マウスイントラカーディを灌流します。切断液で灌流する代わりに血管にラベルを付ける必要がある場合は、1ミリグラムあたり10ミリグラムの濃度で200マイクロリットルのデキストランテキサスレッドを注入し、心臓の左心室にカーディをトランス注入し、2〜3分待ってからマウスの首を切る 経心臓灌流に続いてマウスを斬首し、マウスの首を切って頭を氷冷した切断液に急速に浸し、ビブラートに移します。小脳から嗅球までの矢状縫合糸に沿ってハサミで頭蓋骨を切断します。

その後、一対の鉗子を使用して頭蓋皮弁を静かに取り除きます その後、メスを使用して脳の甘えん坊部分を切除します。次に、各半球の最も外側の部分に2つの矢状切開を行い、半球内裂傷に沿って脳を切断します。次に、へらを使用して脳をそっと取り出し、氷のコールドカッティング溶液に入れます。

2つの半球を別々に4%寒天ブロックに置き、背側を寒天に接触させます。次に、2つの半球の横方向に切り取られた側でブロックをビブラムのプラットフォームに接着し、内側を上にします。その後、プラットフォームをビブラムチャンバーに入れます。

切削液を充填します。次に、溶液を95%の酸素、5%の二酸化炭素で泡立てることにより、スライス調製全体を通して溶液を酸素化します。次に、バイブレーターで250ミクロンの厚さのセクションを準備します。

高品質の切片を得るためには、低い切削速度と高周波のブレード振動を使用する必要があります。ブレードからスライスが解放されたらすぐに、切断液からゆっくりと取り出し、摂氏32度に維持された酸素化A CSFで満たされたインキュベーションチャンバーに水浴に入れます。この手順では、イメージング中にスライスがドリフトしないように、スライスを顕微鏡のイメージングチャンバーに慎重に配置しました。

上にナイロンメッシュを丁寧に乗せて安定させます。スライスに A CSF が連続的に灌流されていることを確認してください。次に、10 x 対物レンズを使用して、関心のあるフィールドを見つけます。

metamorphソフトウェアを開き、ナイロンメッシュがイメージングフィールドを遮らないことを確認します。次に、40 倍の対物レンズをかみ合わせ、ピントを調整します。対物レンズとスライスの間に十分な解があることを確認してください。

metamorphソフトウェアを使用して、励起時間、Z平面の数、各Zセクション間の距離、時間間隔、記録時間などのタイムラプス取得パラメータを設定します。次に、タイムラプス取得を開始します。データはMetamorphによってtiffファイルとして自動的に保存され、取得したタイムラプス動画の1つの時点に対応する各ファイルで動画を開き、動画

時点の画像をプログラムアイコンにドラッグアンドドロップするだけで取得した画像をロードします。ムービーが読み込まれたら、表示調整ウィンドウで信号の明るさとコントラストを調整します。画像プロパティでボクセルサイズや時間間隔など、取得したビデオのパラメーターを設定し、等距離のタイムポイントウィンドウを設定します。

ボクセルサイズを指定した後、フレームを3Dで確認したり、ビデオの時間やスケールを確認したりして、記録されたセルを自動的に追跡することができます。スポット関数を選択して、surpassウィンドウのフィールド内の各セルにスポットを作成し、スライスウィンドウで追跡するセルの直径を測定します。トラッキングのパラメータを設定して続行します。

検出されたオブジェクトの信頼性を経時的に検査します。すべての移動セルが自動的に検出されない場合は、検出のしきい値を変更し、すべての時点でスポットがあるすべてのセルが選択されていることを確認してください。同じトラックの隣接するタイム ポイントを表す 2 つのスポット間の最大距離と最大ギャップ サイズを指定して、プログラムがタイム ポイントを接続できるようにする必要があります。

トラックが作成されたら、それらをフィルタリングし、無関係なトラックを削除するだけで削除できます。トラックは、すべての修正が行われるとすぐに、同じトラックの異なるトラックと異なる時点を接続および切断することで修正できます。線路を最後に確認し、タイム ポイントごとのセルの移動量、線路の長さ、移動距離の長さ、線路の継続時間などのデータを Excel ファイルにエクスポートします。

このビデオは、デキストラン、テキサスの赤色で標識された血管に沿った緑色の神経芽細胞の移動のタイムラプスイメージングを示しています。移動する神経芽細胞は、移動期が静止期で中断されると塩性行動を示すことに注意してください。また、このビデオでは、imasソフトウェアによる神経芽細胞の移動の追跡を示しています。

球体と線は、それぞれ個々のセルのセル本体と移動トラックを示しています。この手順を試行する際には、成体マウスの前脳の良質な急性期ライフスライスを取得する必要があることを覚えておくことが重要です。さらに、イメージング中にスライスがドリフトしないようにナイロンメッシュを慎重に配置することにより、イメージングチャンバー内でスライスを十分に安定化させる必要があります。

A CSF灌流の速度の変化、不規則な灌流、または温度の急激な変動は、イメージング中にドリフトや焦点面の変化を引き起こす可能性があります。このビデオを見た後、急性成人スライスの神経芽細胞の移動を記録および分析する方法を十分に理解しているはずです。15秒から30秒程度の短い医師間隔を使用して、移動期と固定期の始まりと終わりを確実に特定することをお勧めします。