ヒト膵島の染色プロトコル

この手順の全体的な目的は、ヘマトキシリン・エオジン染色および免疫組織化学を用いてヒト膵島を特性評価することです。これは、パラフィンブロックに埋め込まれた膵臓サンプルから連続切片を作成することで達成されます。その後、これらの切片を元の方向のままスライドガラス上に配置します。

スライドの一部はヘマトキシリン・エオジンで染色し、残りのスライドは免疫組織化学染色を行います。最終工程として、染色したスライドをスキャンし、症例ごとに整理します。最終的に、これらの画像はオンラインの病理データベースにアップロードすることができ、同分野の他の研究者が閲覧することが可能です。既存の手法に対する本手法の主な利点は、元の方向性を維持したまま、スライドを連続して染色できる点にあります。

本手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の組織学的技師であるLinda Snyder、生物科学者のEmily Montgomery、および実験員であるTiffany Hippoです。まず、パラフィン切片作成の標準手順に従って、恒温槽とミクロトームを準備します。次に、正電荷スライドに症例番号、膵臓の部位、およびスライド番号を記入します。

すべての準備が整ったら、カセットのラベルを左側にして、パラフィンブロックをミクロトームのチャックに取り付けます。通常の薄切の手順に従い、組織が均一に現れるまでブロックを薄切します。組織が均一に現れたら、厚さ約4 µmの連続切片のリボンを作成します。

必要な初期染色の数に応じて、3〜6枚の切片を用意します。次に、リボン状の切片を切り離します。各切片を順番に採取し、スライドグラス上に配置します。

鉛筆でセクション番号を記録します。セクションが使用不能な場合は、その番号を飛ばし、正確な順序でセクションのナンバリングを続けてください。スライドラベルを左に向けた状態で、カセット内と同じ方向を維持するように注意してください。

次に、スライドをスライドラックに置き、一晩乾燥させます。室温で、組織を保存するためにパラフィンブロックの表面を薄いパラフィン層で再封し、室温または−20 °Cで保存します。次のサンプルに対してもこの手順を繰り返します。

上述のH&E染色と同様に、各レベルの連続切片の番号を維持することが重要です。各ブロックから最初のスライドをスライドラックに配置し、そのラックをオートステイナーの最初のトレイにセットします。標準的なHEプログラムを選択し、染色プロセスを開始します。

染色の完了後、オートステイナーからスライドを取り出し、カバーガラスを掛けるためにフード内に置きます。標準的な手法を用いて、各スライドにカバーガラスを載せます。最後に、印刷されたラベルでスライドに標識を付け、フード内で十分に乾燥させます。

まず、自動染色機をセットアップし、必要な試薬をすべて準備します。二重染色にはDacoプログラムを選択してください。スライド枚数と、それぞれのスライドに適用する処理内容を入力します。

製造元の推奨に従い、すべての試薬をオートステイナーにセットします。次に、TBST、クエン酸緩衝液、抗体、および手順に必要なその他の試薬を準備します。スライドをキシレンに5分間浸し、脱パラフィン処理を行います。

スライドが乾燥すると、脱パラフィン中に過剰な背景染色や孔染色が生じるため、乾燥させないでください。使用前に、クエン酸緩衝液をスチーマーに注いで予熱します。次に、脱パラフィン済みのスライドを、一連のエタノール洗浄に供します。

スライドを最後に一度、脱イオン水で洗浄します。予熱したクエン酸緩衝液にスライドを入れ、30分間蒸らします。この後、直ちにスライドを室温の水槽に移し、完全に冷却されるまで放置します。

冷却後、適切な順序を維持することに注意して、スライドをDayco自動染色機のラックに転送します。最後に、あらかじめロードしておいた二重染色プログラムを実行します。二重染色プログラムが完了したら、スライドを自動染色機から取り出し、脱水を行う前に少なくとも1時間以上乾燥させます。

脱水処理を続けるため、スライドを80%ethanolに1分間浸します。続いて、95%ethanol、次に100%ethanolに浸し、脱水処理を継続します。最後に、スライドをxyleneに1分間浸し、保持します。

手順を完了させるために、CytoSealを用いて直ちにカバーガラスでスライドを封入します。臓器、ブロック番号、染色の種類、日付などのケース情報を含むラベルを印刷してください。染色済みスライドをスキャンするため、各スライドにラベルを貼付します。

それらをスキャナートレイに載せ、標準的な手順に従います。染色済みのスライドは室温で、未染色の残りのスライドは将来の使用に備えて-20°Cで保存してください。最後に、染色画像をドナーおよび確認された組織型ごとに整理します。

ここでは、低倍率および高倍率におけるKI 67とインスリンの二重染色の例を示します。染色された膵臓切片の画像はオンライン病理データベースに登録され、仮想バイオバンクが構築されます。研究者はこのデータベースを利用することで、研究および1型糖尿病に関する必要な情報に迅速にアクセスすることが可能です。

このビデオを視聴することで、ヒト膵臓から高品質なスライドを作成し、染色する方法について十分に理解することができます。