ヒト膵島の染色プロトコル
May 23rd, 2012
このビデオでは、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）と免疫組織化学（IHC）を用いたヒト膵島の特性評価のための手順を示しています。頭、体、尾領域から膵臓のセクションは膵島内分泌物（インスリン、グルカゴン、膵臓ポリペプチド）、細胞複製（Ki67）、および炎症性浸潤（H＆E、CD3）を決定するためにH＆EとIHCの両方で染色されています。鉤状領域は、膵ポリペプチドに対してIHCを使用してローカライズされています。
この手順の全体的な目標は、ヘマチンおよびエオシン染色および免疫組織化学を使用して、ヒトの膵臓アイレットを特徴付けることです。これは、パラフィンブロックに埋め込まれた膵臓サンプルからシリアル切片を作成することによって達成されます。次に、セクションは元の向きでスライド上に配置されます。
スライドの一部をヘマチンとエオインで染色し、残りのスライドを免疫組織化学で染色します。最後のステップは、染色されたスライドをスキャンしてケースごとに整理することです。最終的には、これらの画像をオンラインの病理データベースにアップロードし、その分野の他の研究者が閲覧することができます。この手法が既存の方法よりも優れている点は、スライドを元の向きを維持しながら直列に染色できることです。
この手順を実演するのは、私の研究室の組織技術者であるLinda Snyder氏、生物学者のEmily Montgomery氏、および研究室の技術者であるTiffany Hippo氏です。まず、パラフィンミクロトミーの標準的な手順に従って、ウォーターバスとミクロトームをセットアップします。次に、正に帯電したスライドに症例番号、膵臓領域、およびスライド番号をラベル付けします。
すべての準備が整ったら、パラフィンブロックをミクロトームチャックに入れ、左側にカセットラベルを貼ります。通常のミクロトミー手順に従って、組織が均一に露出するまでブロックを切片にします。組織が均一に接触したら、厚さ約4ミクロンのシリアルセクションのリボンを作成します。
必要な初期染色の数に応じて、3〜6つのセクションが必要です。次に、リボンのセクションを分離します。各セクションを順番にピックアップして、スライドに置きます。
セクション番号を鉛筆で記録します。セクションが使用できない場合は、その番号をスキップして、セクションに正確な順序で番号を付け続けます。スライドの向きは、カセットにあるものと同じ向きを保ち、スライドラベルを左に向けてください。
次に、スライドをスライドラックに置き、一晩乾かします。室温で、パラフィンブロックの表面をパラフィンの薄層で再シールして組織を保存し、室温または摂氏マイナス20度でアーカイブします。次のサンプルについてもこの手順を繰り返します。
上記のhおよびe染色について見たように、各レベルでシリアルセクションの番号付けを維持することが重要です。各ブロックの最初のスライドをスライドラックに置き、次にラックをオートステイナーの最初のトレイに置きます。標準のHEプログラムを選択し、染色プロセスを開始します。
染色が終わったら、オートステイナーからスライドを取り外し、カバーが滑るようにフードに入れます。標準的な手法を使用して、各スライドにカバースリップを置きます。最後に、スライドに印刷されたラベルを貼り、フード内で完全に乾かします。
まず、オートステイナーをセットアップし、必要なすべての試薬を準備します。ダブルステイン用のDacoプログラムを選択してください。スライドの数と、それぞれが受ける治療を入力します。
すべての試薬をメーカーの推奨に従って自動染色器にロードします。次に、TBSTとクエン酸塩、バッファー、抗体、および手順に必要なその他の試薬を準備します。De スライドをキシレンに5分間置いてパリゼーションします。
スライドが乾燥すると、スライドがデパしている間に過度の背景と細孔の汚れが発生するため、スライドを乾燥させないでください。クエン酸緩衝液をスチーマーに注ぎ、使用前に予熱します。次に、デパスライドを一連のエタノール洗浄に提出します。
最後にもう一度、スライドを脱イオン水ですすいでください。スライドを予熱したクエン酸バッファーに加え、30分間蒸します。この期間の後、スライドが完全に冷えるまで、すぐにスライドを室温の水浴に移します。
冷却したら、スライドをDaycoオートステイナーラックに移し、適切な順序を維持するように注意します。最後に、二重染色プログラムが完了したら、前にロードした二重染色プログラムを実行します。スライドをオートステイナーから取り外し、少なくとも1時間乾かしてから脱水します。
脱水を続けるには、それらを80%エタノールに1分間移します。スライドを95%エタノールに浸し、次に100%終了して脱水を続けます。最後に、スライドをキシレンに1分間浸して保持します。
すぐにサイトシールを使用してカバースリップでスライドをマウントし、手順を完了します。臓器番号とブロック番号、染色の種類、日付などの症例情報を含むラベルを印刷します。各スライドにラベルを貼って、汚れたスライドをスキャンします。
スキャナートレイに置き、標準的な手順に従います。染色スライドは室温で保管し、残りの未染色スライドはマイナス20°Cで保存しておいて、将来の使用に備えてください。最後に、染色された画像をドナーと見た組織の種類ごとに整理します。
これは、KI 67 とインスリンを低倍率と高倍率の両方で染色した例です。染色された膵臓切片の画像は、仮想バイオバンクを作成するオンライン病理データベースに送信されます。このデータベースを使用すると、研究者は研究や1型糖尿病に必要な情報に迅速にアクセスできます。
このビデオを見た後、人間の膵臓から高品質のスライドを準備して染色する方法を十分に理解しているはずです。
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概要
このビデオは、ヘマトキシリンおよびエオジン（H&E）染色と免疫組織化学（IHC）を使用して、ヒトの膵臓島状組織の特性を示しています。この技術により、島状組織の内分泌組成、細胞増殖、および炎症性浸潤の評価が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 内分泌学
- 組織学
背景
- ヒトの膵臓島状組織は、グルコース代謝において重要な役割を果たします。
- 島状組織の組成の特性を評価することは、糖尿病の理解に不可欠です。
- H&EとIHCは組織分析の標準技術です。
- スライドの元の向きを維持することは、正確な評価のために重要です。
研究の目的
- ヒトの膵臓島状組織を特性化する。
- 島状組織の内分泌組成を決定する。
- 細胞増殖と炎症反応を評価する。
使用した方法
- パラフィン埋め込み膵臓サンプルから連続切片を作成する。
- 切片をH&EとIHCで染色する。
- 染色したスライドを分析のためにスキャンする。
- データベースにアップロードするためにケースごとに画像を整理する。
主な結果
- 島状組織におけるインスリン、グルカゴン、および膵ポリペプチドの同定。
- Ki67染色を用いた細胞増殖の評価。
- H&EとCD3染色による炎症性浸潤の評価。
- IHCを用いた有角部の成功的な局在化。
結論
- この方法は、膵臓島状組織の包括的な特性化を提供します。
- スライドの元の向きを維持することで、分析の正確性が向上します。
- 結果は、健康と疾病における膵臓機能の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized histopathology workflows for human pancreatic islets enable reproducible endocrine cell characterization, supporting target validation in diabetes research. By preserving serial section orientation and generating digitized whole-slide images, the method facilitates cross-functional data sharing and biobanking for mechanistic de-risking of islet-targeted therapies. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantifiable, spatially resolved data on islet composition, replication, and immune infiltrates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through rigorous histopathology and immunolocalization of islet endocrine cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing islet morphology, size, density, and endocrine cell composition using H&E and IHC stains.
- Predictive Value: Assists in portfolio triage by evaluating islet replication and apoptotic cells via Ki67 and other proliferation markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized processing of human pancreas into defined regions (head, body, tail) and transverse sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility by numbering and alphabetically denoting subsections based on size for complete cross-sectional analysis.
- Platform Value: Highlights screening readiness and scalability via digitized whole-slide images organized in an online pathology database accessible to over 200 researchers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by evaluating islets for inflammation, fibrosis, amyloid, and T-cell infiltrates using H&E and CD3 staining.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by assessing both endocrine and exocrine compartments, including ductular pathology and neoplasia.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by characterizing pancreatic intraductal neoplasia and its relationship to the duct system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment by enabling serial sectioning, standardized staining, and digital biobanking of human pancreatic tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through histopathology and immunolocalization of pancreatic islets and endocrine cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility by maintaining original slide orientation during serial sectioning and staining in series.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of islet area, numbers, endocrine cell composition, replication, and T-cell infiltrates via H&E and IHC to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by evaluating islet amyloid, fibrosis, and inflammatory infiltrates relevant to type 1 diabetes pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability through an online pathology database that provides rapid data sharing and block selection for paraffin or frozen serial sections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in islet endocrine composition and immune interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of serial sectioning, staining, and digital slide archiving.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early identification of islet pathology and replication status.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable islet morphology, density, and endocrine cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histotechnology, immunohistochemistry, and digital pathology workflows.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtome, auto stainer, slide scanner, and online pathology database access.
- Cross-team standardization requirements for slide labeling, section numbering, and orientation maintenance across histology and imaging teams.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for applying standardized regional processing (head, body, tail) to non-human pancreata.
- Practical limitations include tissue variability from organ donors and the need for optimized antibody validation for multiplex IHC staining.
