Name: ヒト膵島の染色プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学ぶヒト膵島のH&E染色と免疫組織化学による形態学的解析法。インスリンやグルカゴンの同定、細胞増殖と炎症浸潤の評価が可能で、糖尿病研究や膵機能理解に貢献する包括的な組織学的手法です。

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著者らは、ドナーの家族や専門家の支援のため、本研究とエミリー·モンゴメリー、ロバートPietras、アンフー、Mitali Agarwalさんと、ロシャンAgarwalさんに関与する臓器調達機関に感謝します。この作品は、糖尿病患者の膵臓の臓器提供者のネットワークをサポートするために青少年糖尿病研究財団（MC-T.）によって資金を供給された。

1。染色切片用ミクロトーム<ol><li>標準的なパラフィンミクロトーム用として、水浴及びミクロトームを設定します。ケース番号、膵臓領域（サンプル）およびスライド番号を使用して正に荷電したスライドと事前にラベルを使用しています。左側にカセットのラベルを持つミクロトームチャックに配置し、パラフィンブロック。 </li><li>組織が均一に検出されるまでブロックに通常のミクロトームの手順は、セクションに従ってください。連続切片（厚さ4μmの、初期の必要な汚れの数に応じて3-6（ケース提出フォームは、 付録1を参照））のリボンを生成します。リボン内の別のセクションでは、順番にそれぞれをピックアップし、鉛筆で番号順でスライド上の場所。セクションでは、正確な順序でセクション番号を付け、未使用である場合示す。左に向き、スライドラベル付きカセットに見られるように、スライド上の同じ方向を維持します。その後の研究に染色またはディストリビューションに進み、室温で一晩乾燥させます。 </li><li>解像度室温または-20℃で組織し、アーカイブを維持するためにパラフィンの薄い層を有するパラフィンブロックのEAL表面</li><li>その後のミクロトームの場合は、上記のように各レベルで連続切片の番号を維持。 1つの追加のスライドを取得し、各ブロック内の各〜100μMレベルのH＆E染色スライドで。 </li></ol> 2。 H＆E染色<ol><li> autostainerの最初のトレイに、スライドラック内の各ブロックから最初のシリアル切片スライドを配置します。 </li><li>標準H＆E染色プログラムを選択し、いつものように進みます。 </li><li>染色が終了したら、封入用フードでautostainerと場所からスライドを削除します。 </li><li>標準的な手法を用いてカバースリップ。印刷したラベル（セクション12を参照）で十分とラベル乾燥させます。 </li></ol> 3。 IHCセットアップ<ol><li>ダブル汚れやスライドの入力番号のダコプログラムを選択します。 TBSTとクエン酸緩衝液、抗体、および他のreagを準備します。指定されたボリューム（ 表1）に従ってエント。試薬トレイとスライドをロードします。清潔で廃棄物の線の回転は、製造元の推奨に従ってプログラムされています。 </li><li>手動でこれらのアッセイを実行する場合は、推定されたボリュームを準備します。任意のステップで乾燥スライドを避けるために、加湿チャンバー内でスライドをインキュベートします。 autostainerに使用する場合は、各試薬は、同じ手順に従ってください。 </li></ol> 4。 IHCの脱パラフィンおよび抗原検索<ol><li> 5分間、キシレンにスライドを入れてください。一回繰り返します。これは過度の背景と貧しい染色になりますように表示されるまでスライドは、後続の時点で乾燥することはできません。 </li><li> 2分間100％エタノールにスライドを移します。一回繰り返します。 </li><li> 10分間、メタノールで作りたての3％H 2 O 2のスライドを入れてください。 </li><li>ディップ90％エタノールでスライドし、3分間90％エタノールで開催。 </li><li>にスライドを転送1分間70％エタノール。 </li><li>脱イオン水でスライドを洗浄します。 </li><li> 5分間蒸し器で予熱汽船とクエン酸緩衝液。 </li><li> 30分間蒸し器及びスチームのバッファをクエン酸にスライドを追加します。 </li><li>すぐに水にスライドを移し、室温（〜20分）にクールにスライドするまで保持します。 </li><li>シーケンス（ 図1）染色によるダコautostainerラックにスライドを移し、二重染色プログラムを実行します。 autostainerプログラムの主な手順は、手動実行が複製できるように記載されています。 </li></ol> 5。最初の一次抗体（Ki-67の、CD3​​、膵臓ポリペプチド） <ol><li> 15分間スナイパー液でスライドをブロックします。 TBSTで2回洗浄。 </li><li> 30分間一次抗体のスライドをインキュベートします。 TBSTで2回洗浄。 </li><li> MACH2ヤギ抗マウス（Ki-67の場合）または抗ウサギ（CD3、膵臓ポリペプチド）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）30ポリマーmでインキュベートinutes。 TBSTで2回洗浄。 </li><li> 4分間のスライドに3,3 - ジアミノベンジジン四塩酸塩を（DAB）を適用します。水で2回洗浄する。 </li><li>膵ポリペプチドとインキュベートしたスライドを同時にアッセイされると残りのスライドは、一次抗体の2番目のセットとインキュベートされている間、後続のすべてのステップで使用TBSTダコに開催されています。また、マニュアルアッセイのために、セクション6に進みます。 </li></ol> 6。二次抗体（インスリン、グルカゴン） <ol><li> 20分間DEEBのスライドをインキュベートします。 TBSTで2回洗浄。 </li><li> 20分間TBST（インスリン）またはTBSTでスナイパー（グルカゴン）の20％のアビジンブロッカーで10％正常ヤギ血清でブロックします。 TBSTで2回洗浄。 </li><li> 15分間インスリンまたはグルカゴン一次抗体とインキュベートします。 TBSTで2回洗浄。 </li><li>インスリンで30分間1:300希釈、ビオチン化ヤギ抗モルモットでインキュベートするスライド。 TBSTで2回洗浄。標準VEでインキュベート30分間のctorのABC-AP試薬。 TBSTで2回洗浄。 </li><li>グルカゴン：30分間ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ（AP）ポリマーに続く30分間の間にバッファーでインキュベートするスライド。 TBSTで2回洗浄。 </li><li>スライドが抱合体でインキュベートされているが、室温にLPRバッファーを温める。ダコ試薬ラックでの使用および場所の前に即座に3 mLのバッファー当たりの液体の恒久的な赤の1滴（LPR）を追加します。 4分のLPCのスライドをインキュベートします。水で2回洗浄する。 </li><li> 1分間ヘマトキシリン​​でスライドをインキュベートします。水で二回リンスします。 </li><li> 1分間TBS pHは7.6でスライドをインキュベートします。水で二回リンスします。 </li><li> DAKO Autostainerからスライドをアンロードします。 </li><li>すぐに膵ポリペプチドのために染色したスライドを脱水する。少なくとも1時間乾燥したすべての二重染色したスライドについては、その後脱水する。 </li></ol> 7。脱水<ol><li>場所は1分間80％エタノールでスライドします。 </li><li> 95％エタノールでスライドを浸します。 </lI&gt; <li> 30秒間95％エタノールでスライドを保持します。 </li><li> 100％エタノールにスライドを移し、1分間保持します。繰り返します。 </li><li>キシレンのディップスライド。 </li><li> 1分間キシレンにスライドを保持します。繰り返します。 </li><li>すぐにcytosealを使用してスライドにカバースリップをマウントします。 </li></ol> 8。スライドラベル<ol><li>臓器およびブロック番号、染色、および日付プリントなどの場合の識別情報を入力します。シリアルセクション番号は、各ブロックの最初のスライドの汚れはオプションです。それ以降のレベルは番号で表されます。 </li><li>スライド上のラベルを配置します。 </li></ol> 9。スライドのスキャニング<ol><li>スキャナのトレイに染色されたスライドを配置し、計装に従ってスキャンします。 </li><li>ドナーと組織型（膵臓の頭部、胴体、尾部、脾臓）でスライドを整理します。 </li><li>室温および-20°Cで、残りの未染色スライドでアーカイブステンドスライド使用するまで。 </li></ol> 10。 Representative結果これらの染色手順は、パラフィンと新鮮凍結ブロックのベースライン特性を提供するために、糖尿病（nPOD）と膵臓の臓器提供者のためのJDRFネットワーク用に開発された。各ドナーは、それぞれの膵臓領域（頭、体、尾）と脾臓（ 図1、ケース提出フォーム、 付録1参照）から2ブロックの染色のベースライン特性で構成行ってきました。 H＆E染色で使用されて、臨床グレードのソリューションを用いた臨床施設のようにプログラムautostainerを使用して行われます。追加のドナーブロックは切片であるので、それぞれの組織形態を表示するにはH＆Eにかかるスライドを持っています。ブロックは、研究者に配布するために、再び区画されている場合は、より深いレベルでは、各レベルで連続切片を番号だけでなく、ブロック全体の組織形態を文書化する代表的なH＆Eのスライドにかかるスライドがあります。染色されたスライドがが付いていますケースの識別、膵臓領域、ブロック番号、染色と日付（ 図2）とオンライン病理情報管理システムにスキャンされます。コントロールのドナーからの代表的なイメージは、この手順は、次の期待される結果を表示するために低域と高倍率の両方で、 図3に示されています。膵ポリペプチド（D、H）で染色したスライドは手動で行い、ヘマトキシリン​​対比の減少染色強度を示すアッセイを用いて別の日に測定した。一次抗体の染色性の違いか、アッセイの間で対比染色は、個々の色補正が同じセル領域またはカウントを達成するために必要とすると画像解析を使用すると、そうでなければスライドしている場合は、特に避けなければならない。 各研究室では、ロット間の変動やその他の試薬および条件は染色強度と特異性に影響を与える可能性として、抗体濃度を最適化するために想定する必要があります。新しいREAの買収紳士は、染色の手順は、旧試薬と同様に染色強度と同程度を達成するために、既知の正および負の対照サンプルで検証されています。 nPOD病理コアに最適化された追加の抗体は、リファレンス·ソースとして表2に提供されており、共焦点顕微鏡のために免疫蛍光アッセイをmultilabelingために使用されている。 <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 Dako社は、グリッドを染色する。この回路では、ダコのautostainer上で実行さnPODドナーの膵臓からルーチン分析を示しています。 nPODドナーは、4桁の識別番号でコード化されています。 2つのスライドトレイが染色主催のスライドで表示されます。別のスライドの構成は、ドナーのスライドの番号に応じて期待されています。ポジティブコントロールは、Ki-67とCD3の2つの二重染色およびドナーの脾臓の既知の陽性のドナーの包含が含まれています。ネガティブコントロールは二重で、2枚のSLIを含むDESインスリンとグルカゴンのドナーの脾臓からの一次抗体と2スライドのホスト種からの免疫グロブリン（Ig）とともにインキュベートした一人のドナーの膵臓ブロックから。 <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。デジタルスキャンが実行される前に、 代表的な二重染色したスライド。典型的な完成したスライドは、スライドのラベルパラメータと組織の配置で示されています。 <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。膵臓のセクションの代表的なH＆EとIHC染色。大人の女性の臓器提供者（6096から04頭）の膵臓からのセクションは、プロトコルで説明されて行われ染色し、デジタルスキャンしました。画像は、セクション全体（AD）の一小島（EH）からImageScope表示プログラムを使用して得られた。インスリン、グルカゴン、及び膵ポリペプチドの予想される膵島染色強度はこの膵頭部ブロックはすべての島は、主に膵ポリペプチド陽性細胞が含まれているように鉤状の地域や腹側膵葉の小さな部分が含まれているセクションDの輪郭を描くようにセクションBDを観察した。 BとCのヘマトキシリン​​対比強度が最適である間、パネルDのヘマトキシリン​​対比が軽すぎることに注意してください。 EHパネルはβ細胞とα細胞の予想される分布と背葉から膵島を示しています。いくつかの膵ポリペプチド細胞は膵島（H）の左下部分に記載されています。 、E-H &amp;E; B、F-Ki67 +インスリン、C、G-CD3 +グルカゴン、D、H-膵ポリペプチド。 AD、0.2×、EH-12.8x。

<ol><li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li>
<li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).</li>
<li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex%2C+obesity%2C+and+presence+of+type-2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Anat%22%5BJournal%5D)">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li>
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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

IHC手順の標準化は、時間をかけてスライドの多数を越えて、コンピュータベースのアルゴリズムを使用する場合は特に、画像解析のために重要です。このレポートに記載されIHC染色の手順は、8時間の作業日以内にautostainerを使用して、特定のドナーのサンプルのバッチ分析をできるようになり、以前の報告書5から変更されます。各染色されたスライドのデジタル化されたスライド全体のイメージは、Webベースのオンライン病理システムを介してnPOD系の研究者に利用できるようになります。調べでは、（参照スライドと一緒にドナーの人口統計、実験データ、および他の適切な病歴を確認し、彼らの研究に最も適したブロックを選択することができますすることができます<a href="http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php" target="_blank">http://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php</a>詳細については、）を。このようなオンラインの病理システムは、 &quot;仮想バイオバンク&quot;としての役割を果たします。このシステムへの更なる改...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 30％過酸化水素（H 2 O 2） </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td>内因性ペルオキシダーゼのブロッキング</td></tr><tr><td> ABC-アルカリホスファターゼ（AP） </td><td>ベクトル</td><td> AK-5000 </td><td> APコンジュゲート</td></tr><tr><td>抗体希釈液</td><td>インビトロジェン</td><td> 003218 </td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>アビジンブロッカー</td><td>ベクトル</td><td> SP-2001 </td><td>内因性ビオチンをブロックする</td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗モルモット</td><td>ベクトル</td><td> BA-7000 </td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>ブルーイング試薬</td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td>ライカautostaineR </td></tr><tr><td>クエン酸緩衝液、pH6.0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td>抗原回復</td></tr><tr><td>清澄1 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td>ライカautostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312から4 </td><td>カバーガラス封入</td></tr><tr><td> DAB </td><td>ベクトル</td><td> SK-4100 </td><td> HRP発色</td></tr><tr><td> DEEB </td><td> DAKO </td><td> S2003 </td><td>ブロッキング試薬内因性AP </td></tr><tr><td>アルコールエオシンY </td><td> FisherScientific </td><td> 71204 </td><td>ライカautostainer </td></tr><tr><td> Ethanols-100％、95％、90％、70％ </td><td> FisherScientific </td><td>さまざまな</td><td>脱パラフィンと封入</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td> DAKO </td><td> S3301 </td><td> Dako社autostainer </td></tr><tr><td>ヘマトキシリン​​7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td>ライカautostainer </td></tr><tr><td> IgG抗体（一次抗体のすべてのホスト種） </td><td>さまざまな</td><td>さまざまな</td><td>予備選挙のためのネガティブコントロール</td></tr><tr><td>液体パーマネントレッド（LPR） </td><td> DAKO </td><td> K0640 </td><td> AP発色</td></tr><tr><td> MACH2 AP </td><td>バイオケア·医療</td><td> MALP521L </td><td>ヤギ抗マウスAPコンジュゲート</td></tr><tr><td> MACH2 HRP </td><td>バイオケア·医療</td><td> MHRP520L </td><td>ヤギ抗マウスHRPコンジュゲート</td></tr><tr><td> MACH2 HRP </td><td>バイオケア·医療</td><td> RHRP520L </td><td>ヤギ抗マウスHRPコンジュゲート</td></tr><tr><td>メタノール</td><td> FisherScientific </td><td>さまざまな</td><td> H 2 O 2希釈剤</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ベクトル</td><td> S-1000 </td><td> IHCブロッキング試薬</td></tr><tr><td>スナイパー</td><td>バイオケア·医療</td><td> BS966M </td><td> IHCブロッキング試薬</td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> TA-999-TT </td><td> IHCバッファー</td></tr><tr><td> Triology 20倍</td><td>セルのマーケ</td><td> 920P-06 </td><td>抗原回復</td></tr><tr><td>キシレン</td><td> FisherScientific </td><td>さまざまな</td><td>脱パラフィンと封入</td></tr></tbody></table> 表1特定の試薬 ​​が含まれています。 <table border="1"><tbody><tr><td> 一次抗体 </td><td> 宿主動物種 </td><td> ベンダー </td><td> 猫。 ＃ </td><td> コメントと抗原検索 </td></tr><tr><td> パラフィン </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アミラーゼ</td><td>マウス</td><td>サンタクルス</td><td> SC-46657 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td>アミリン</td><td>マウス</td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td>炭酸脱水酵素19.9 </td><td>マウス</td><td>アブカム</td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td>切断されたカスパーゼ-3、 </td><td>ウサギ</td><td>細胞シグナリング</td><td> 9961 </td><td>クエン酸またはトリロジー</td></tr><tr><td> CD20 </td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M0755 </td><td>クエン酸またはトリロジー</td></tr><tr><td> CD3 </td><td>ウサギ</td><td> DAKO </td><td> A0452 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> CD34 </td><td>マウス</td><td>細胞シグナリング</td><td> 3569 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> CD4 </td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M7310 </td><td>クエン酸塩</td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> CD45 </td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M0754 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> CD68 </td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M0876 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> CD8 </td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M7103 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td>クロモグラニンA </td><td>ウサギ</td><td> DAKO </td><td> A0430 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> CK17 </td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M7046 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> CK19 </td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M0772 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> CK7 </td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M7018 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> C-ペプチド</td><td>ウサギ</td><td>細胞シグナリング</td><td> 4593 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> Foxp3は</td><td>ラット</td><td>電子バイオサイエンス</td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td>クエン酸塩</td></tr><tr><td>グレリン</td><td>ヤギ</td><td>サンタクルス</td><td> SC-10386 </td><td></td></tr><tr><td>グレリン</td><td>ウサギ</td><td>アブカム</td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td>グルカゴン</td><td>ウサギ</td><td> DAKO </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td>グルカゴン</td><td>マウス</td><td>アブカム</td><td> ab10988 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td>グルカゴン</td><td>モルモット</td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> Glut-1の</td><td>マウス</td><td>アブカム</td><td> ab40084 </td><td> 3部作</td></tr><tr><td> GLUT-2 </td><td>ウサギ</td><td>サンタクルス</td><td> SC-9117 </td><td>ヒト膵島で発現していない</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>モルモット</td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> Ki-67の</td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M7240 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> MAFA </td><td>ウサギ</td><td>ノーバス生物</td><td> NB400-137A </td><td> 3部作</td></tr><tr><td>膵臓ポリペプチド</td><td>ウサギ</td><td>インビトロジェン</td><td> 18から0043 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> PDX-1 </td><td>モルモット</td><td>アブカム</td><td> ab47308 </td><td>クエン酸またはトリロジー</td></tr><tr><td>プロインスリン</td><td>マウス</td><td> Novocastra </td><td> NCL-proin-1G4 </td><td></td></tr><tr><td>プロインスリン</td><td>マウス</td><td>発達研究ハイブリドーマバンク</td><td> GS-9A8 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td>ウサギ</td><td>シグマ</td><td> HPA 006641 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td>平滑筋アクチン</td><td>ウサギ</td><td>アブカム</td><td> ab5694 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td>ソマトスタチン</td><td>ウサギ</td><td> DAKO </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td>シナプトフィジン</td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M0776 </td><td>クエン酸塩</td></tr><tr><td> 冷凍新鮮な </td><td> 宿主動物種 </td><td> ベンダー </td><td> 猫。 ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td> CD11bを</td><td>ラット</td><td>アブカム</td><td> ab6332 </td><td> 4％のPFと修正</td></tr><tr><td> CD11cは</td><td>ウサギ</td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td>マウス</td><td>ノーバス生物</td><td> NB 600から564 </td><td>パラフィン切片のために一晩インキュベーションを使用して、 </td></tr><tr><td> CD94 </td><td>マウス</td><td>アブカム</td><td> ab61874 </td><td>アセトンで固定する</td></tr><tr><td> GAD65 </td><td>マウス</td><td>サンタクルス</td><td> SC-130569 </td><td> 4％のPFと修正</td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td>マウス</td><td> DAKO </td><td> M0736 </td><td>アセトンまたは4％PFと修正</td></tr></tbody></table> 表2一次抗体。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アペリオScanscope CS </td><td>アペリオ</td><td></td><td>デジタルスライドスキャナ</td></tr><tr><td> DAKO Autostainerプラス</td><td> DAKO </td><td></td><td> IHC染色</td></tr><tr><td>ラベル行列印刷ソフトウェア</td><td> BioCarta </td><td> LM7UP57 </td><td>スライドラベルソフトウェア</td></tr><tr><td>ライカXL Autostainer </td><td>ライカ</td><td></td><td> H＆E染色</td></tr><tr><td>プレミアムカバーガラス</td><td> FisherScientific </td><td> 12から548-5J </td><td>カバースリップ</td></tr><tr><td>スペクトル情報マネージャ</td><td>アペリオ</td><td></td><td>スキャナソフトウェア</td></tr><tr><td> Superfrostプラススラ​​イド</td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td>正に荷電したスライド</td></tr><tr><td>野菜蒸し器</td><td>ブラック＆デッカー</td><td>さまざまな</td><td>抗原回復</td></tr><tr><td>ゼブラTLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td>スライドラベルプリンタ</td></tr></tbody></table> 表3固有の供給と装置。

ヒト膵島の染色プロトコル

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

膵島面積と数字および成人ヒト膵臓の内分泌細胞組成の推定値は数十万から500〜1500 mgの1-3に数百万とベータの質量範囲に異なります。この既知の不均一性と、標準処理と染色手順は、膵臓領域を明確に定義されており、島には厳格な組織病理学および免疫学的局在診断を用いて特徴づけたように開発されました。 臓器提供者から回収されたヒト膵臓を処理するための標準的な手順は、このシリーズのパート1で説明されています。膵臓は、横断に続いて3つの主要領域（頭、体、尾）に処理されます。膵臓の頭部からの横断は、サイズに基づいて示されているように、さらに分割し、サブセクションを示すためにアルファベット順に番号が付けられています。この標準化は、構成の小島が含まれている鉤状領域を含む頭部の完全な断面分析を可能にする主に尾部領域、膵ポリペプチドの細胞。 現在のレポートには、このシリーズのパート2を含み、シリアルセクショニングと膵島内分泌細胞、レプリケーション、およびT細胞の浸潤に重点を置いた膵のパラフィン切片の病理組織学的特性評価に使用する手順について説明します。膵臓切片の病理は、外分泌、ductular、内分泌の両方のコンポーネントを特徴づ​​けることを意図しています。外分泌コンパートメントは、特に膵臓の膵管内腫瘍4の存在との関係では、膵炎（アクティブまたは慢性）、萎縮、線維症、脂肪の存在だけでなく、ダクトシステムに評価されます。膵島の形態、大きさ、密度、内分泌細胞、炎症、線維症、アミロイド、およびH＆EとIHC染色を使用して複製またはアポトーシス細胞の有無を評価されます。 パート2で説明した最後のコンポーネントは、染色されたスライドの提供です。デジタル化されたスライド全体のイメージとしての。デジタル化されたスライドは、仮想バイオバンクを作成するオンライン病理データベースの場合、膵臓領域によって構成されています。このオンラインコレクションへのアクセスは現在、1型糖尿病の研究に関与して200以上の臨床医と科学者に提供されています。オンラインデータベースは、迅速かつ完全なデータ共有のために、パラフィンまたは凍結連続切片のブロックを選択するための捜査手段を提供します。

このビデオでは、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）と免疫組織化学（IHC）を用いたヒト膵島の特性評価のための手順を示しています。頭、体、尾領域から膵臓のセクションは膵島内分泌物（インスリン、グルカゴン、膵臓ポリペプチド）、細胞複製（Ki67）、および炎症性浸潤（H＆E、CD3）を決定するためにH＆EとIHCの両方で染色されています。鉤状領域は、膵ポリペプチドに対してIHCを使用してローカライズされています。

成人ヒト膵臓における膵島面積、数、および内分泌細胞組成の推定値は、数十万から数百万まで幅があり、...

この手順の全体的な目的は、ヘマトキシリン・エオシン染色および免疫組織化学を用いてヒト膵島を特性評価することです。これは、パラフィンブロックに埋め込まれた膵臓サンプルから連続切片を作成することによって達成されます。その後、切片を元の向きのままスライドグラス上に配置します。一部のスライドはヘマトキシリン・エオジンで染色され、残りのスライドは免疫組織化学染色されます。最終ステップとして、染色されたスライドをスキャンし、症例ごとに整理します。最終的に、これらの画像はオンラインの病理データベースにアップロードされ、同分野の他の研究者が閲覧することが可能です。既存の手法に対する本手法の主な利点は、元の方向性を維持したまま、スライドを連続して染色できる点にあります。手順の実演は、私の研究室の組織技術者のLinda Snyder、生物学者のEmily Montgomery、および臨床検査技師のTiffany Hippoが行います。まず、パラフィン切片作成の標準手順に従って、恒温槽とミクロトームを準備します。次に、正電荷スライドに症例番号、膵臓の部位、およびスライド番号を記入します。すべての準備が整ったら、パラフィンブロックのカセットラベルを左側にしてマイクロトームのチャックに固定します。通常のミクロトミーの手順に従い、組織が均一に現れるまでブロックを薄切します。組織が均一に露出したら、厚さ約4 µmの連続切片のリボンを作成します。必要な初期染色の数に応じて、3枚から6枚の切片を用意します。次に、リボン状の切片を個々に切り離します。各切片を順番に採取し、スライドグラス上に配置します。鉛筆で切片番号を記録してください。切片が使用不可能な場合は、その番号を飛ばし、正確な順序で次の切片の番号付けを続けてください。スライドの向きはカセット内の向きを維持し、スライドラベルが左側に来るように注意してください。次に、スライドをスライドラックにセットし、一晩乾燥させます。室温で、パラフィンブロックの表面を薄いパラフィン層で再封印して組織を保存し、室温または-20 °Cでアーカイブします。次のサンプルについても、この手順を繰り返します。上記のように、H&amp;E染色のための各レベルにおける連続切片の番号を維持することが重要です。各ブロックからの最初のスライドをスライドラックに入れ、そのラックをオートステイナーの最初のトレイに配置します。標準のHEプログラムを選択し、染色プロセスを開始します。染色の終了後、オートステイナーからスライドを取り出し、カバーガラス封入のためにフード内に置きます。標準的な手法を用いて、各スライドにカバーガラスを載せます。最後に、印刷したラベルでスライドに標識を付け、フード内で十分に乾燥させます。オートステイナーをセットアップし、必要な試薬をすべて準備することから始めてください。二重染色の場合はDacoプログラムを選択します。スライド枚数と、それぞれに適用する処理内容を入力してください。製造元の推奨に従って、すべての試薬をオートステイナーにセットします。次に、TBST、クエン酸緩衝液、抗体、および本手順に必要なその他の試薬を準備します。スライドをキシレンに5分間浸し、脱パラフィン処理を行います。スライドが乾燥すると、脱パラフィン中に過剰な背景染まりや孔の染まりが生じるため、乾燥させないようにしてください。使用前に、シトレート緩衝液をスティーマーに入れて予熱します。次に、脱パラフィン後のスライドを一連のエタノール洗浄に供します。スライドを脱イオン水で最後にもう一度すすぎます。あらかじめ加熱しておいたクエン酸緩衝液にスライドを入れ、30分間蒸気滅菌（ステミング）させます。この後、スライドを直ちに室温の水槽に移し、完全に冷却されるまで放置します。冷却後、適切な順序を維持するように注意しながら、スライドをDayco自動染色機のラックに移します。最後に、あらかじめロードしておいた二重染色プログラムを実行します。二重染色プログラムが完了したら、自動染色機からスライドを取り出し、脱水させる前に少なくとも1時間乾燥させます。脱水処理を継続するため、スライドを80% ethanolに1分間浸します。続いて、95% ethanol、次いで100% ethanolに浸して脱水処理を続けます。最後に、スライドをxyleneに1分間浸して保持します。手順を完了するため、サイトシールを用いてカバーグラスで直ちにスライドを封入します。臓器、ブロック番号、染色の種類、日付などの症例情報を含むラベルを印刷してください。染色のスライドをスキャンするため、各スライドにラベルを貼付します。それらをスキャナーのトレイに置き、標準的な手順に従います。染色済みのスライドは室温で、未染色の残りのスライドは今後の使用に備えて-20°Cで保存します。最後に、染色画像をドナーおよび確認された組織型ごとに整理します。低倍率および高倍率におけるKI 67とインスリンの二重染色の例を以下に示します。染色された膵臓切片の画像はオンライン病理データベースに送信され、仮想バイオバンクが構築されます。このデータベースを利用することで、研究者や1型糖尿病の研究に必要な情報に迅速にアクセスすることが可能です。このビデオを視聴することで、ヒト膵臓から高品質なスライドを調製し、染色する方法について十分に理解することができます。

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