Name: カルシウムイメージングの急性脳室下帯スライスの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶカルシウムイメージング法で産後マウスの脳室下帯スライスを調製し、神経前駆細胞と神経芽細胞の活動動態を可視化する技術。この方法は細胞間コミュニケーションの研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、NIH（DC007681、AB）、CTの幹細胞助成（AB）、パーディー財団（AB）、博士号を取得する前のルース·L·キルシュシュタイン国立研究サービス賞（NRSA）（SZY）、およびNSFの大学院研究からの補助金によって支えられてフェローシップ（BL）。我々は、原稿上の有益なコ​​メントをBordey室のメンバーに感謝します。本材料は、部分的にコネチカット幹細胞研究助成金プログラムの下コネチカット州によってサポートされた仕事に基づいています。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもコネチカット州の公式見解を示すものではない、コネチカットやCTイノベーションの州の公衆衛生省は、株式会社。

<ol><li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction-mediated+calcium+waves+define+communication+networks+among+murine+postnatal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells.</a> Eur. J. Neurosci. , (2011).</li>
<li>Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrony+of+spontaneous+calcium+activity+in+mouse+neocortex+before+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis.</a> Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).</li>
<li>Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+increases+calcium+in+subventricular+zone+astrocyte-like+cells+through+L-+and+T-type+voltage-gated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels.</a> Front. Cell. Neurosci. 4, 8(2010).</li>
<li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+Release+and+Uptake+Regulate+Neuronal+Precursor+Migration+in+the+Postnatal+Subventricular+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li>
<li>Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+a+whole+mount+preparation+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone.</a> J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. Neuroscience Meeting Planner, San Diego, CA, , Society for Neuroscience. (2007).</li>
<li>Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP-expressing+cells+in+the+postnatal+subventricular+zone+display+a+unique+glial+phenotype+intermediate+between+radial+glia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes.</a> Glia. 54, 394-410 (2006).</li>
<li>Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+and+ionic+signature+of+neuronal+progenitors+of+the+postnatal+subventricular+zone+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ.</a> J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).</li>
<li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca%282%29+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators.</a> Science. 333, 1888-1891 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

SVZ細胞のカルシウムイメージングは、神経芽細胞10、両方の神経芽細胞およびアストロサイト4,6,8とアストロサイトのカルシウム波3受容体チャネル発現における自発活動のパターンを研究するために使用されています。 SVZにおける細胞はどちら未熟であるか、またはグリア特性を持っているので、彼らは成熟したネットワークでの活動を示す電位におけるミリ秒の変化は、この地域では適用されないことを意味し、活動電位11,12を起動しません。したがって、遅いカルシウムイベント（秒のオーダーで）キャプチャすると生物学的に意味がないだけですが、おそらく、これらの細胞における活動の最も関連性の高い形。 調べでは、特にスライスの健康に関しては、この手順には多くのステップを意識しなければなりません。ソリューションの不適切な作りは、悪い水質（ソリューションを作るために使用される）、遅い、不正確解剖し、組織を切断する汚いかみそりの刃を使用すると、すべての有害なefを及ぼす可能性があります活動上のfects。 <p cl...

<table border="1"><tbody><tr><td> 溶質 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 郭（MM） </td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ</td><td> S0389 </td><td>解剖：147 mMの ACSF：0 mMの</td></tr><tr><td> NaClを</td><td>シグマ</td><td> S9888 </td><td>解剖：42ミリメートル ACSF：126 mMの</td></tr><tr><td> KClを</td><td>シグマ</td><td> P3911 </td><td>解剖：2.5mMの ACSF：2.5mMの</td></tr><tr><td>のMgCl 2·6H 2 O </td><td>シグマ</td><td> M9272 </td><td>解剖：4.33 mMの ACSF：1mMの</td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4·H 2 O </td><td>シグマ</td><td> S8282 </td><td>解剖：1.25 mMの ACSF：1.25 mMの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td> G8270 </td><td> Dissection：10mMの ACSF：10mMの</td></tr><tr><td> NaHCO 3を </td><td>シグマ</td><td> S6014 </td><td>解剖：26 mMの ACSF：26 mMの</td></tr><tr><td>のCaCl 2·2H 2 O </td><td>シグマ</td><td> C3306 </td><td>解剖：1.33 mMの ACSF：2 mMの</td></tr></tbody></table> 表1化学物質リストおよび解剖ソリューションとACSFのレシピ。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [ヘッダ] </td></tr><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td>バーモント1000S </td><td></td></tr><tr><td>スーパー接着剤</td><td> Sureholdまたは3M </td><td> Surehold 3Gスーパー接着剤または3M獣医ボンド</td><td></td></tr><tr><td>解剖ツール</td><td> Robozまたはテッドペラ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のFluo-4 AMのカルシウム感受性色素</td><td>インビトロジェン</td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td>オレゴングリーンBAPTA-1、AMカルシウム感受性色素</td><td>インビトロジェン</td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO中プルロニックF-127の20％溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td>直立共焦点顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> FV300またはFV1000 </td><td></td></tr><tr><td>水浸目標</td><td>オリンポス</td><td> LUMPlanFl 40×幅/ IR（NA 0.80）; LUMPlanFl 60×W / I（NA 0.90） </td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サッター</td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td>圧力コントローラ&lt;/ TD&gt; <td>パーカー·ハネフィン</td><td> Picospritzer </td><td>塗布時&lt;3 PSI </td></tr><tr><td>ピペットプラー</td><td>サッターまたはNarshige </td><td>サッターのP-97またはNarshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>サッター</td><td> BF150-110から10 </td><td> ID：1.10、外径：1.50 </td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>モデル720 </td><td>流速：1ml /分</td></tr><tr><td>商工会議所のお風呂</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> RC-26のGLP </td><td>ロープロファイルには、客観的なクリアランスが可能</td></tr><tr><td>管類</td><td>タイゴン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度調節器</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> 表2。材料/機器リスト。

カルシウムイメージングの急性脳室下帯スライスの調製

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

脳室下帯（SVZ）は、出生後の脳内の2つの神経原性のゾーンの一つである。 SVZは、アストロサイトの機能（SVZアストロサイトと呼ばれます）、神経芽細胞、中間前駆細胞と神経前駆細胞を含む密集した細胞などを持っている。 SVZで生まれた神経芽細胞は接線方向に、彼らは介在ニューロンに分化する嗅球への偉大な距離を移行します。接着分子と拡散信号を介して細胞間のシグナル伝達はニューロン新生の制御において重要な役割を果たしている。これらの信号の多くは、細胞の内側との間で情報を伝達する細胞内カルシウム活性を誘発する。カルシウム活性は、細胞外シグナルの活性こうして反射性であり、SVZ細胞間の機能的な細胞間シグナル伝達を理解するための最適な方法です。 カルシウム活性は成熟したアストロサイトとニューロンを含む他の多くの地域との細胞型で研究されている。しかし、LOAに伝統的な方法カルシウムインジケーター色素（ すなわち浴ローディング）とdの細胞はすべてSVZ細胞型をロードするには効率的ではありませんでした。実際、SVZにおける細胞密度は、組織内部で染料拡散を妨げる。また、矢状スライスを準備した方が特にSVZ細胞、吻側 - 尾軸の神経芽細胞の移行の流れの3次元配列を保持します。 ここでは、SVZ、カルシウムインジケーター色素とSVZ細胞の読み込みや、タイムラプスムービーカルシウム活性の買収を含む矢状切片を作製するための方法を説明します。私達はのFluo-4を使用した組織内部の圧力アプリケーションを使用して、SVZアストロサイトをロードするための染料AM。カルシウム活性には、識別のための個々の細胞のための正確な分解能を可能走査型共焦点顕微鏡を用いて記録した。我々のアプローチは、成人の海馬下帯や胚神経性ゾーンを含む他の神経性のゾーンに適用されます。また、染料の他の種類のことができます記載された方法を使用して適用する。

記録カルシウム活性のためのカルシウムインジケーター色素と脳室下帯（SVZ）細胞をロードする方法について説明する。生後SVZは、神経前駆細胞および神経芽細胞を含む、密に詰まった細胞が含まれています。むしろ風呂ローディングを使用するよりも、我々はより良​​い染料拡散を可能にする組織内部の圧力によって色素を注入した。

脳室下帯（SVZ）は、出生後の脳における2つの神経発生領域の1つである。SVZには、神経...を含む細胞が高密度に集積している。

この手順の目的は、出生後の脳室下帯における細胞のカルシウム活性をイメージングすることです。まず、出生後のマウスから脳組織を慎重に取り出します。次に、脳室下帯を含む生きた急性脳切片を作成します。次に、脳切片にカルシウム感受性色素を導入します。最終ステップとして、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて活動をイメージングします。最終的に、心室帯細胞におけるカルシウム活動のタイムラプスイメージングにより、細胞間の活動ダイナミクスを提示し、異なる細胞種および血管系との間の通信パターンを明らかにします。この手法は、異なる細胞タイプが互いにどのように通信し、細胞が血管系にどのような影響を与えるかなど、神経発生分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。P 20からP 30のマウス幼仔を安楽死させ、断頭します。施設で承認されたガイドラインに従い、頭部を解剖液を満たしたトレイに置きます。ピンセットで頭部を固定し、マイクロ剪刀を用いて頭蓋骨の周囲および正中線に沿って連続的に切開します。嗅球が脳に付着したままであり、損傷していないことを確認します。背側を切開し、ピンセットを用いて脳上の頭蓋骨を取り除きます。次に、ピンセットで頭部を保持したまま、外科用メスを使用してラムダ（lambda）のレベルで冠状切開を行います。同じカミソリの刃を使用して、正中線から外側に約2〜3 mmの位置で、脳の両側に矢状切開を加えます。次に、刃を脳の下に滑り込ませて、頭蓋骨から完全に脳を取り出します。ここまでの処置は3分以内に完了させてください。シアノアクリレート系瞬間接着剤をバイブラムのプレートに少量塗布します。次に、脳組織を拾い上げ、側方矢状断によって作成された平坦な面のいずれかに固定します。切断中の組織を安定させるためにアガロースブロックを装着することも可能ですが、これは任意です。バイブラブレードをエタノールで洗浄して油分を除去し、続いて蒸留水で洗浄します。ブレードをブレードホルダーに装着し、ブレードホルダーをバイブレーターに取り付けます。高周波振動かつ低速で、組織切片の厚さが250から350 micronsになるようにバイブレーターを設定し、組織を順次切片化します。嗅球が現れたことは、矢状断が脳室下帯に近づいていることを示す良い指標となります。また、脳室の出現や脳梁の肥厚も、その後に脳室下帯が現れることを示す良好な指標です。脳室下帯に達したら、先端をカットしたプラスチック製パスタピペットを使用して、各スライスを回収し、スライス保持チャンバーに転送します。A CSFを用いて処理します。切片をA CSF中で1時間インキュベートする必要があります。この間に、次行程のイメージングに使用するピペット、染料、および顕微鏡を準備することができます。ピペットを準備するには、6〜8本のガラスピペットを引き出し、それぞ

preparation-of-acute-subventricular-zone-slices-for-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

神経回路網の開発の自発的な活動は、カルシウム感受性インジケータ染料のAM...

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

このプロトコルでは、カルシウムイメージングの最近の進捗状況を更新...

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

このビデオは、脳海馬スライスにおける全細胞パッチクランプ記録と2光子カルシウムイメージングのプロトコルを示しています。この方法により、急性脳スライスのさまざまなニューロンタイプの樹状突起における局所Ca2+過渡現象(CaT)のダイナミクスを研究することができます。...

脳切片の2光子カルシウムイメージングのための全細胞構成の確立

膜電位または電流と細胞内カルシウム濃度の変化を同時に記録する手順が説明されています。視交叉上核ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成のパッチクランプ電極を使用してカルシウムインジケーターbis-fura-2で満たされています。...

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

マウスの仔の脳をカットするために、複数の角度を使用して、我々は主要な聴覚中脳と前脳構造のほとんどの間の接続をキャプチャ前述の急性脳スライスを改善。...

商工会議所のコンポーネントとマルチスケール光イメージングの3次元印刷を組み込むColliculo、視床皮質マウス脳スライスの変更、

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

ここでは、脊髄スライス培養における膠 (SG) ニューロンから作られた全細胞パッチク録音のために不可欠な手順について述べる。このメソッドでは、組み込みの膜特性、シナプス伝達、調査される SG...

膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。...

マウス脳の水平海馬スライス

マウスの下-中間海馬からの急性スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この横断的な準備を、記録の質と記録されたニューロンの形態学的特徴の保存の観点からコロナスライスと比較する。...

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で...

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

学ぶカルシウムイメージング法で産後マウスの脳室下帯スライスを調製し、神経前駆細胞と神経芽細胞の活動動態を可視化する技術。この方法は細胞間コミュニケーションの研究に有用です。

カルシウムイメージングの急性脳室下帯スライスの調製

さらに動画を探す