Name: RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析 in situでハイブリダイゼーション（FISH） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 学ぶFISH法によるPlasmodium falciparum感染赤血球における単一細胞mRNA転写解析。複数var遺伝子の同時発現を可視化し、マラリア原虫の転写動態を解明する有用な手法です。

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著者らは、優れた技術支援のために寄生虫やクリスティーナ·ホルムの遺伝子型のマイケルAlifrangisとウラAbildtrupに感謝したいと思います。この作品はハワードヒューズ医学研究所（助成55005511）、ルンドベック財団（助成R9-A840）およびニールス·ボーア財団によって資金を供給された。

1。たての選択感染赤血球の生成 PfEMP1タンパク質の表面発現のために新たに選択したカルチャを使用しているときは、このアッセイのために、最良の結果が得られる。この特定の実験3D7 Pにおける熱帯熱マラリア原虫の系統は、前述の1と特異的な抗体を用いて選択した。 1日目<ol><li> Pから満員の血液細胞の収穫を200μl 熱帯熱マラリア原虫の培養は室温で8分間800×gで遠心分離することにより2から5パーセント後期IEを含む。 </li><li> 37 2mlの血液ペレットを再懸℃の暖かい0.75パーセントゼラチン14ミリリットル滅菌チューブ内の溶液、土砂に感染していないとリングステージIEを可能にするために37℃で15〜20分放置します。 </li><li>後期IEを収穫、新しい14 mlチューブに、上相、 すなわち 、37℃の温かいRBC-ウォッシュメディアの10mlで2回洗浄する。 </li><li>特異的な抗PfEMP50μlの希釈37℃暖かいRBC-ウォッシュメディアおよび滅菌フィルタ2ml中1抗体。 </li><li> 37℃で30分間、14ミリリットル滅菌チューブとインキュベートし、穏やかに攪拌しながらCの滅菌希釈血清で洗浄後期IEを混ぜる。 </li><li>室温で8分間800 xgでスピンダウンして、37℃の温かいRBC-ウォッシュメディアの10mlで2回洗浄する。 </li><li> DynaMaq-15磁石を使用してRBC-ウォッシュメディアとサスペンション倍Dynabeadタンパク質の50μlを洗います。 </li><li> 300μlのRBC-ウォッシュメディアでのDynabeadsを再懸濁し、洗浄された後期のIEに追加します。穏やかに撹拌しながら37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> DynaMaq-15磁石にチューブを転送します。 1〜2分放置し、すべての液体を除去。 </li><li> RBC-ウォッシュメディアの4-5 mlのダイナビーズを再懸濁します。磁石の上に戻ってチューブを転送し、すべての液体を除去する前に、1〜2分間放置します。一度洗浄工程を繰り返します。 </li><li> 25cm 2の無菌培養fに洗浄したビーズを転送200μlの新鮮な濃厚赤血球を含むラスク。文化にAlbumaxメディアの5-6 mlを加える。 37℃、5％CO 2℃で一晩保存する</li></ol> 2日目<ol start="12"><li>選択されたIEが14ミリリットル滅菌チューブにすべての文化を転送することによって、新鮮な赤血球をreinvadedた培養液からのDynabeadsを削除します。 DynaMaq-15磁石の上にチューブを入れて、1〜2分間放置します。その後、培養フラスコに、すべての液体の背中を注ぐ。 </li><li> 5-10％の寄生虫血症まで、できるだけ少ないサイクルの文化や寄生虫はringstageにあります。 </li><li> IEが正しい表面表現型、どちらPFD1235wのand/orPF11_0008 すなわちタンパク質の発現は1が得られていることを確認するために、FACSによって分析されるべきである。 </li></ol> 2。プローブの調製アンチセンスRNAプローブはPFD1235wとPF11_0008 varのほとんどの可変領域から生成された&lt;Pから/ em&gt;の遺伝子熱帯熱マラリア原虫 3D7ゲノムDNA。 DNAは、製造元の説明（Roche社）によると、それぞれPCRで増幅し、転写のためpSPT18または19ベクターにクローニングした。プローブ（580塩基対（bp）で、長さは590 bp）をそれぞれDIG RNAラベリングキットまたはビオチンRNA標識ミックスを使用して、ジゴキシゲニン（DIG）またはビオチンで標識した。我々は両方のノーザンブロット分析により、単一ラベルのFISH解析1によるプローブの特異性を確認した。 3。 in situハイブリダイゼーションの前に寄生虫の薄層塗抹標本および固定 1日目すべての手順は、RNaseフリーの環境で実行されて、すべての試薬はRNaseフリーまたはジエチルピロカーボネート（DEPC）またはRNase ZAP（Invitrogen）を用いて前処理されています。スライドとカバースリップ残留製造グリースを除去するためにアルコールで洗浄してください。ステップ間で途切れることなく、プロトコルを実行することが重要ですヌクレアーゼの混入の危険性を最小にするために。 <ol><li>標準拡散法3により細い血管映画を作る。顕微鏡の100倍の油浸対物レンズを使用して、IEを数え、文化の中でIEの割合を計算する。寄生虫段がリングとIEサイクルの早期栄養体段階で、おおよその同期であることを確認します。これらは、事前に複製、単核生成段階、発現しているvarの遺伝子のmRNAとこのタイプの単一細胞のFISH転写アッセイに適しています。 </li><li> 1.5ミリリットルRNaseフリーのエッペンドルフチュー​​ブに、5〜10％の寄生虫で、原虫の培養液50μlを転送します。室温で2,000 rpmで1分間遠心します。 </li><li>メディアを取り出し、DEPC処理水に50μlのPBSのpHは7.2を追加します。優しくチューブを攪拌。メディアや細胞の破片から遊離細胞を洗浄するために二回遠心沈降ステップを繰り返します。 </li><li> 4良質薄い塗抹標本を作成します。各スメアについては、上に1スミアを作るよくRNaseフリーフードで合計4ウェルスライド、 すなわち 4スライドガラス、（ 重要なステップ ）のいずれか11ミリメートルの直径。波は乾燥するために空気中に簡単にスライドします。特定のプローブ、RNase処理のために別のスライドと、目的の遺伝子を発現していないIEを含む3枚目のスライドを使用して、他の無関係な遺伝子のための単一のプローブ染色に陰性コントロール-1のスライドの3つの余分なスライドを作成した。 10〜20分間ベンチに乾燥するスライドのままにしておきます。 </li><li>ウェルに4％パラホルムアルデヒド、5％氷酢酸を含む固定液の60μlを添加して薄膜を修正します。室温でベンチで10分間のままにしておきます。 </li><li>室温で穏やかに撹拌して5分間2×SSPEバッファでスライドを洗浄します。簡単に言えばティッシュペーパーで軽く細胞を含むウェルに触れることにより、過剰な液体を除去。 </li><li> 37℃（ 非常に重要なステップで2分間、0.01M HCl中で0.01％のペプシンでスライドをカバー）。室温で5分間、2×SSPEでスライドを洗浄します。 </li><li> 10μg/ mlの最終濃度までのRNase溶液を希釈。のRNase溶液60μlをネガティブコントロールスメアをカバーしています。 37℃で30分間インキュベートした後、室温で5分間、2×SSPEでスライドを洗浄してください。 </li><li>ハイブリダイゼーション工程に即座に進みます。 </li></ol> 4。固定スライドへのRNAプローブのハイブリダイゼーション 1日目<ol><li>そのようなThermoStar 100 HC4またはRNaseザップを噴霧し、それはティッシュペーパーできれいに拭いて、クリーンオーブンに入れて空のピペットチップボックスとしてハイブリダイゼーションチャンバーを準備します。スライドはハイブリダイゼーション中に乾燥しないことを確認するためにハイブリダイゼーションチャンバーまたはDEPC処理水でボックスの下部のチャンネルを埋める。 48にチャンバーと予熱を閉じ℃に</li><li> 12 ng /μlに、最終濃度のハイブリダイゼーション溶液中にプローブを薄める。加熱ブロック中で5分間65℃プローブ溶液°Cを変性。直ちに氷上で冷却する。 </li><li>簡単に言えば空気は2x SSPEの洗浄された後はスライドを乾燥させてください。慎重にティッシュペーパーで井戸の周り過剰な液体を除去。 </li><li>ハイブリダイゼーションチャンバを開き、チャンバー内でスライドを配置します。 1またはウェルあたり60μlの総体積で両方のプローブを適用します。慎重に滅菌ピンセットを使用してRNaseフリーカバースリップで液滴をカバーしています。 </li><li>チャンバーを閉じて、一晩、少なくとも16時間48℃でスライドをハイブリダイズする。 </li></ol> 5。抗体結合と蛍光増幅 2日目次の手順は、パーキンエルマーから、TSAプラス蛍光パレットシステムに基づいています。すべてのステップは室温で行われています。 <ol><li>穏やかに攪拌しながら5分間スライドをTNT緩衝液で3回洗浄する。 </li><li> 30分間TNBバッファー150μlのウェルをブロック。 </li><li> 1:500の割合で、TNBバッファーで1:100の割合でTNBのバッファ内のHRP-結合のα-DIG抗体とHRP標識α-ビオチン抗体を希釈します。ティッシュペーパーを使用してスライドから余分TNBバッファを削除します。同時に2つの転写物を検出した場合、両方の抗体が一度行くことができます。ウェル当たり抗体-TNB溶液を100μlの合計額を適用し、慎重にカバースリップで覆う。 2時間スライドをインキュベートする。 </li><li>慎重にカバースリップを取り外します。 5分間3回のTNT緩衝液中でスライドを洗浄します。 </li><li> 1:500の割合でチラミド増幅試薬には、FITC蛍光体を希釈し、各ウェルに溶液100μlを適用します。カバースリップでウェルをカバーし、12分間インキュベートする。 </li><li>慎重に滑ると穏やかに攪拌することにより、TNTのバッファーで5分間スライドを3回洗ってカバーを外します。 </li><li> 1:500の割合でチラミド増幅試薬でCyan3 - フルオロフォアを希釈します。当たり100μlを加えこのソリューションの井戸。カバースリップでウェルをカバーし、12分間インキュベートする。 </li><li> TNTのバッファ内に浸漬することにより素早くスライドを注意深くリンスしてからカバーガラスを外します。 </li><li> 5分間のTNT緩衝液を用いてスライドを3回洗浄します。 </li><li> DEPC処理水にすばやくスライドを浸す。 </li><li>空気乾燥したスライドを残す。 DAPIを含む抗退色試薬でスライドをマウントします。マニキュアでカバースリップの四隅をシールします。 </li><li>スライドは現在、顕微鏡検査のための準備が整いました。実験は次の日に完成しなければならないならば4でアルミホイルや店舗で覆われたスライド℃で保管してください。スライドの側面の完全な密封は、抗フェード試薬を適用した24時間後に行うことができる。これはプロトコルが完了した後、スライドを1週間用に撮像することができるようになります。 </li></ol> 6。ハイブリダイズしたプローブの可視化<ol><li>顕微鏡の電源をオンにします。標準免疫蛍光顕微鏡はsufficです実験のこの種のientが、あなたはまた、3D映像のためにこれを使用するか、またはあなたの染色された細胞のビデオを得るために共焦点顕微鏡へのアクセスを持っている場合。顕微鏡は、15〜30分間ウォームアップしてください。コンピュータとソフトウェアのスイッチをオンにします。 </li><li>免疫蛍光顕微鏡で染色の品質を確認してください。少数の寄生虫を含むスポットを選択してください。 </li><li>手動で各レーザのゲインを調整します。ピクセルは4-6 M -1 s -1で 、512×512ピクセルへのステップに住む調整します。 </li><li>フレームラムダを使用してテスト撮影してください。レーザーゲインを再調整します。 </li><li>蛍光単一細胞の20良い写真の最小値を取る。 5月20日の寄生虫を含むフィールドの少なくとも2月5日の画像は正寄生虫の割合の公正な概観を得るために必要とされている。 </li></ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

のRNA FISH分析は、例えば、ノーザンブロットおよびRT-PCRなどの方法とは対照的に、単一細胞レベルで特定のmRNA転写物の識別を可能にします。これにより、P.、この例では、転写活性および不活性細胞を区別することができ寄生原虫は、ヒト赤血球内原虫。このような全細胞の観察はしばしば必要であり、重要かつ新規な転写パターン1を解明することがあります。 他のRNA FISH法は4月10日に記載されているが、Pの同時varの mRNAの転写の研究のための新しい、洗練されたプロトコルの開発が望まれてい熱帯熱マラリア 。検出ツールとしてasRNAプローブを使用することにより、mRNAの活動の特殊な空間パターンは容易に細胞に局在することができます。また、asRNAプローブはその特異性1をサポートする他の実験系でも使用することができます。他のクリティカル新しいプロトコルを開発する際に重要であるiC...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> 338826〜100ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td> Albumaxメディア：RPMI 1640グルタミンソリューション</td><td>ロンザ</td><td> BE12-115F </td><td> 500ミリリットルのRPMI 1640 5 mlのグルタミンソリューション</td></tr><tr><td> Albumaxメディア：ゲンタマイシン硫酸Albumax溶</td><td>ロンザ</td><td> BE02-012E </td><td> 2.5ミリリットルゲンタマイシン硫酸塩 50ミリリットルAlbumax溶</td></tr><tr><td> Albumax-ソリューション：ヒポキサンチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H9377 </td><td> 0,8グラムヒポキサン​​チン</td></tr><tr><td> Albumax-ソリューション：AlbuMAX II </td><td>私nvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200グラムAlbumax </td></tr><tr><td> Albumax-溶液：RPMI 1640 </td><td>ロンザ</td><td> BE12-115F </td><td> 4リットルRPMI1640中 maxで磁石で溶かす。 50℃フィルタリング殺菌し、アリコートで-20℃で保管してください。 </td></tr><tr><td>アンバーライト</td><td>シグマ</td><td> A5710-110G </td><td>脱イオンホルムアミドをする樹脂。 </td></tr><tr><td>抗ビオチンヤギpAbのペルオキシダーゼコンジュゲート</td><td>カルビオケム</td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td>抗DIG抗体</td><td> Novusの生物学的製剤</td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> DAPIでアンチフェード試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> P36931 </td><td>マウントメディアを完全にスライドを密封する24時間前に硬化されています。 </td></tr><tr><td>ビオチンRNAラベリングミックス</td><td&gt;ロシュ</td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td> Nikonデジタル視力DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>メンツェル·グレイザー</td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ25cm 2の Nunclon面</td><td>ヌンク</td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td>フルカ/シグマ</td><td> 32490〜100ミリリットル</td><td>千ミリリットルdeinonized水で1mlのDEPC。攪拌棒を追加し、12時間撹拌した。 30分間オートクレーブ。 </td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td> Nikonデジタル視力DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダイナプロテイン</td><td>インビトロジェン</td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15マグネット</td><td>インビトロジェン</td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミドbioultra 99パーセント</td><td>フルカシグマ/ </td><td> 47671〜1リットル-F </td><td>脱イオン化ホルムアミド：ホルムアミド100ml当たりのイオン交換樹脂が5グラム。 30分かき混ぜる。ワットマン濾紙でろ過。 </td></tr><tr><td> ゼラチン0 75％溶液：ゼラチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G2500 </td><td> 500ミリリットルRPMI 1640中3.75グラムゼラチン。 〜56℃に加熱溶解する。ときに56℃殺菌フィルタリング分注して-20℃で保存。 </td></tr><tr><td> 。ゼラチン0 75％溶液：RPMI 1640 </td><td>ロンザ</td><td> BE12-115F </td><td> 500ミリリットルRPMI 1640中3.75グラムゼラチン。 〜56℃に加熱溶解する。ときに56℃殺菌フィルタリング分注して-20℃で保存。 </td></tr><tr><td> グルタミン溶液：L-グルタミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G3126 </td><td> 500ミリリットル0.9％NaCl中14.6グラムのLグルタミン。溶かし、フィルターのterilizeとアリコートで-20℃で保管してください。 </td></tr><tr><td> グルタミン溶液：塩酸</td><td>シグマ</td><td> H1758 </td><td> 500ミリリットル0.9％NaCl中14.6グラムのLグルタミン。溶解、滅菌フィルタし、アリコートで-20℃で保管してください。 </td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーション溶液：ホルムアミドバイオ超99パーセントSSCの20倍</td><td>フルカ/シグマ</td><td> 47671〜1リットル-F </td><td>合計20ミリリットルは、アリコートで-20℃で凍結させておく 10ミリリットル脱イオン化ホルムアミド</td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーション溶液：デンハルト50倍濃縮</td><td>シグマ</td><td> D2532 </td><td> 5ミリリットル20xSSC </td></tr><tr><td> ハイブリダイゼーション溶液：酵母tRNARocheブロッキング試薬</td><td>シグマ</td><td> R-6750 </td><td> 2ミリリットル50倍デンハルト 酵母tRNAミリリットル当たり250μlの20 mgの</td></tr><tr><td><sチョン·&gt;ハイブリダイゼーション溶液：サケ精子DNA </td><td>フルカ/シグマ</td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4グラムロシュブロッキング試薬 mlのサケ精子DNAあたり10mg（：変性サケspermDNA 96で5分間℃のハイブリダイゼーション溶液に添加する前にクリティカル）の1ミリリットル</td></tr><tr><td>ハイブリダイThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoilインスツルメンツ社</td><td> 1004-0011 </td><td>ハイブリダイゼーションオーブンとDEPC水で水増しRNaseフリーのハイブリダイゼーションチャンバーに置き換えることができます。 </td></tr><tr><td>浸油UV透過蛍光無料</td><td>シグマ</td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td>免疫蛍光または共焦点顕微鏡</td><td>ニコンD-EclipseのTE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td>任意のドラッグストアで利用可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBSで20倍：塩化ナトリウム KClを のNa 2 HPO 4×2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC脱イオンH 2 O </td><td></td><td></td><td> pHを7.4にアジャスト 160グラム 4グラム 23グラム 4グラム 1リットル</td></tr><tr><td>パラ4パーセント</td><td>フルカ/ chemika </td><td> 76240 </td><td> 80ミリリットルのPBS / DEPCで4グラムPFA。 65℃の熱PFAが溶けるまで。 20ミリリットルのPBSを加え、溶液が冷却させます。 pHを7.4に調整してください。フィルター。 -20℃でアリコートで保管</td></tr><tr><td>パラ4パーセント/酢酸五パーセント</td><td></td><td></td><td> 950μlのparaformaldhyde +50μlの酢酸</td></tr><tr><td>ペプシン</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ標識抗ビオチン</td><td>カルビオケム</td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-ウォッシュメディア：RPMI 1640グルタミンソリューション</td><td>ロンザ</td><td> BE12-115F </td><td> 500ミリリットルのRPMI 1640 5mlのグルタミンソリューション</td></tr><tr><td> RBC-ウォッシュメディア：硫酸ゲンタマイシン</td><td>ロンザ</td><td> BE02-012E </td><td> 2.5ミリリットルゲンタマイシン硫酸塩</td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td></td><td> 10 mg / mlの原液を作る。 </td></tr><tr><td> RNaseフリーの1.5 mlチューブ</td><td>アンビオン</td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseのザップ</td><td>アンビオン</td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> 4ウェル11ミリメートルスライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSCの20倍：塩化ナトリウム</td><td>シグマ/アルdrich </td><td> S9625 </td><td> 3 MのNaCl（175グラム/リットル）0.3MのNa 3クエンX、H 2 O（88グラム/リットル）は、1M HClでpHを7.0に調整し</td></tr><tr><td> SSCの20倍：クエン酸ナトリウム水和物</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> W302600 </td><td> 3 MのNaCl（175グラム/リットル）0.3MのNa 3クエンX、H 2 O（88グラム/リットル）は、1M HClでpHを7.0に調整し</td></tr><tr><td> 20X SSPE：NaClを</td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> S9625 </td><td> 175.3グラムのNaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20X：のNaH 2 PO 4 </td><td>シグマ/アルドリッチ</td><td> S0751 </td><td> 27.6グラムのNaH 2 PO 4。 </td></tr><tr><td> SSPE 20X：4 EDTA粉</td><td></td><td></td><td> 9.4グラムのEDTA粉 DEPC処理水を加え、pHを7.4に調整。オート20分間オ​​ートクレーブ</td></tr><tr><td> TNBバッファー：TNTバッファー</td><td></td><td></td><td> 10ミリリットルのTNTバッファー</td></tr><tr><td> TNBバッファー：ブロッキング試薬</td><td></td><td></td><td> 0.05グラムブロッキング試薬 ブロッキング試薬を溶解するために、攪拌しながら1時間60℃に溶液を加熱する。 -20℃で保存する。 （パーキンエルマー社TSA-プロトコルから派生したもの。） </td></tr><tr><td> TNTバッファー：トリス/ HCl </td><td>シグマ</td><td> T1503 </td><td> 1Mトリス/ HCl、pH8.0で</td></tr><tr><td> TNT緩衝液：塩化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S9625 </td><td> 100ミリリットル </td></tr><tr><td> TNT緩衝液：ツイーン20 </td><td>シグマ</td><td> 93773 </td><td> 5 M NaClを30ミリリットル 1ミリリットルのDEPCのdH 2 O869 M1の 室温でpHを7.5に調整してください。 （パーキンエルマー社TSA-プロトコルから派生したもの。） </td></tr><tr><td> TSAはプラスCyanine3 /フルオレセインシステム</td><td>パーキンエルマー</td><td> NEL753000IKT </td><td>実験を開始する前に、慎重にTSAからプロトコルプラス蛍光パレットシステムをお読みください。 </td></tr><tr><td>滅菌チューブ14ミリリットル</td><td> Almeco - CM LABのAP </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

rnaの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（fish）

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

マラリア感染時のヒト内皮受容体に熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（IE）の接着は 、var遺伝子によってコードされたPfEMP1タンパク質変異体の発現によって媒介される。 ハプロイドP.熱帯熱マラリア原虫のゲノムは1つだけですが、感染症の血液の段階で一度にセルごとに転写されると考えられていたそのうちの約60種類のvarの遺伝子を抱いている。 varの遺伝子転写のような相互に排他的な規制がどのように実現されるか、個々の遺伝子やvarの異なる受容体とPの臨床転帰の差動結合の結果に関連付けられているvarの遺伝子のサブグループの識別があるので、不明である熱帯熱マラリア原虫感染症。最近では、相互に排他的な転写のパラダイムは、個々のPに基づいて転写アッセイによって疑問に呼ばれてきたシングルinfに熱帯熱マラリア原虫の転写産物の同定Pの個々の核内寄生虫によるvarの遺伝子転写のin situハイブリダイゼーション（FISH）分析に蛍光RNAを用いてected赤血球細胞熱帯熱マラリア原虫 、IE 1。 ここでは、Pの単核の var遺伝子転写の解析のためのRNA-FISH法を実施するための詳細なプロトコルを提示熱帯熱マラリア原虫は、ヒト赤血球に感染した。方法はジゴキシゲニンとTSA Plusの蛍光パレットシステム2（パーキンエルマー）、顕微鏡分析と新たに選択されたPを使用してビオチン標識アンチセンスRNAプローブの使用に基づいています熱帯熱マラリア原虫のIE。 in situハイブリダイゼーション法Pのさまざまな段階で発現している遺伝子の多様性の転写および規制を監視するために使用することができます熱帯熱マラリア原虫のライフサイクルとは、他のマラリア原虫種と他の生物や細胞のタイプに適応可能です。

図1に、主な手順やRNA FISH法の持続時間を示すフローチャートである。 シングルPを使用してよく、不十分保存ステンドmRNAのFISH実験の代表的な一連の画像熱帯熱マラリア原虫のIEを図2に示します。この細胞内原虫はDAPIで青色に染色されている小さな（1〜1.5μmの直径）は核を持っています。二十四時間Pの赤血球侵入後熱帯熱マラリア原虫増員生殖、 すなわち核分裂のプロセスが開始されます。 varの遺伝子転写の最適なFISHの検出は、この48時間内赤血球溶菌サイクルに10から22の周りの時間で行われます。プローブは、一般おそらく核膜関連小胞体であるもので、主要な核体の隣に表示され種をmRNAにハイブリダイズする。行の良い品質の画像を表示、FITC（緑）とCyan3-（赤）PFD1235wとPに対応する標識プローブダブル選ばPにおけるそれぞれF11_0008 v...

蛍光灯<em&gt;その場で</em個々の細胞におけるmRNA転写産物を同定する&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）は、複数のメンバーを同時に転写などの多遺伝子活性の分析を可能に<em&gt; VAR</em&gt;多重遺伝子ファミリーで<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</em&gt;感染した赤血球<sup&gt; 1</sup&gt;。技術が適応さや遺伝子、細胞及び生物のさまざまな種類で使用することができます。

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

マラリア感染時における熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）感染赤血球（IE）のヒト血管内皮受容体への接着は、var遺伝子によってコードされるPfEMP1タンパク質バリアントの発現によって媒介される。半数体であるP. falciparumのゲノムは約60種類の異なるvar遺伝子を保有しており、感染の血液期において、1つの細胞につき一度に1つの遺伝子のみが転写されると考えられてきた。このようなvar遺伝子転写の相互排他的な制御がどのように達成されるのかは不明であり、また、異なる受容体に関連する個々のvar遺伝子やvar遺伝子のサブグループの特定、および結合能の違いがP. falciparum感染の臨床的転帰に及ぼす影響についても同様に不明である。最近では、P. falciparum IEの個々の核における原虫のvar遺伝子転写をRNA蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）解析を用いて単一の感染赤血球細胞内で同定する転写アッセイにより、この相互排他的転写のパラダイムに疑問が投げかけられている。本稿では、P. falciparum感染ヒト赤血球の単一核におけるvar遺伝子転写を解析するためのRNA-FISH法の詳細なプロトコルを提示する。本手法は、TSA Plus Fluorescence Palette System（Perkin Elmer）を用いたジゴキシゲニンおよびビオチン標識アンチセンスRNAプローブの使用、顕微鏡解析、および精製した直後のP. falciparum IEに基づいている。このin situハイブリダイゼーション法は、P. falciparumのライフサイクルの異なる段階で発現する様々な遺伝子の転写および制御のモニタリングに使用でき、他のマラリア原虫種や他の生物、細胞型にも応用可能である。

私の名前はエレナ・ランドです。デンマークのコペンハーゲン大学医学病理学センターに勤務しています。ここでは、世界各地から集まった約60名がマラリアの研究に取り組んでいます。私たちのグループは、寄生虫であるPlasmodium fociの研究を行っています。これらはヒトにおいてマラリア病を引き起こす最も病原性の高い種であり、表面に宿主細胞への接着などの様々な機能を担う表面タンパク質を発現しています。接着タンパク質の最大のグループは、いわゆる Plasmodium falciparum 赤血球膜タンパク質1、すなわち PfMP1 と呼ばれるものです。少なくとも60種類の変異体が存在しますが、感染の血中期において、1つの細胞につき1種類のみが転写されていると考えられてきました。当研究室では、寄生虫内で複数のタンパク質が同時に転写されている可能性があると考えています。このような活性を検出する方法の一つに、mRNA蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）があります。ここでは、odum FCIに感染した赤血球の単一核内における、2つの異なる遺伝子の転写産物であるmRNAを検出するためのカスタム手法を提示します。この手法の完了には2日間を要します。1日目は、RNAプローブの調製、ガラススライド上の固定済み寄生虫へのプローブ添加、および夜間のハイブリダイゼーションを行います。2日目は、抗体の集積、蛍光増幅、および共焦点顕微鏡による染色された寄生虫の可視化を行います。実験の概要として、操作のフローチャートおよび実験に使用した重要な試薬と材料を示します。RNA zap dig ラベリングキット biotin、RNA、ラベリングミックス、パラホルムアルデヒド、氷酢酸、pepin anti dig 抗体、anti biotin 抗体、TSA PL plus 蛍光パレットシステム、DPI RNAs、1.5 mL マイクロチューブ、ETH エタノール、拭き上げ済みのガラススライド、オートクレーブ済みカバーガラス、ハサミやピンセットなどの滅菌器具、カップリングガラス瓶。感染赤血球が適切な発育段階にあることを確認するために、ギムサ染色による検査を行う必要があります。つまり、VARを転写しているリングステージが同期しており、良好な状態であるかを確認します。転写が起こるライフサイクルの正確な発育段階を選択することが極めて重要です。個々のRNA種はステージ分けされており、特異的に転写され、かつ急速に分解されるため、清潔なガラススライド上に非常に高品質で薄い血液塗抹標本を作成する前に、細胞を穏やかに洗浄する必要があります。ガラススライド上の感染赤血球の均一な単層を、4%パラホルムアルデヒドおよび5%氷酢酸溶液で10分間固定します。その後、ガラススライドをPBSで2回洗浄し、組織を用いてスライド上の液体を穏やかに除去します。次に、あらかじめ温めておいた10 millimolar 塩化水素溶液で細胞を透過処理し、Pepsiを添加します。ハイブリダイゼーションの前に、これを37 °Cで2分間インキュベートします。プローブを65 °Cで5分間加熱して変性させた後、速やかに氷上で冷却し、ガラススライド上で固定した細胞に添加します。細胞の上にカバーガラスを載せ、小さなピペットチップを使用して気泡を取り除きます。スライドがチャンバー内で湿った状態に保たれるよう、ハイブリダイゼーションチャンバーの周囲に2回蒸留水を数滴滴下して加湿します。ハイブリダイゼーションの手順では、ガラススライドをチャンバーに入れ、48 °Cで一晩ハイブリダイゼーションを行います。16〜17時間のハイブリダイゼーション後、スライドをハイブリダイゼーションチャンバーから慎重に取り出します。このステップ以降は、厳密なRNaseフリー環境である必要はありません。TNTバッファーを満たしたガラス瓶の中でスライドを洗浄し、カバーガラスがガラススライドから外れるようにします。この洗浄工程を3回繰り返し、その後TNBバッファーで30分間ブロッキングを行います。細胞にHRP結合anti-dig抗体またはanti-biotin標識抗体を添加します。2種類の標識抗体は同時に添加することが可能です。細胞内の2種類のmRNA転写産物の検出を目的とする場合は、抗体をあらかじめ希釈しておく必要があります。TNBバッファー中で1〜2時間インキュベートし、TNTバッファーで3回洗浄した後、希釈したFSEまたはシアニンのフルオロクロムを洗浄済み細胞に添加します。3種類の溶液を調製する必要があります。ここからの工程では、スライドを強い光に直接さらさないようにすることが重要です。ガラススライドを蛍光色素とともに10～15分間インキュベートします。最初のインキュベーション後に2つのmRNA転写物を検出する場合は、1種類目の染料を洗い流し、2種類目の染料を添加します。最後にTNTバッファーで洗浄してください。スライドを二回蒸留水に浸した後、風乾させます。滴下し、スライドの上にカバーガラスを載せます。気泡を取り除き、カバーガラスの端を速乾性のマニキュアまたはポリッシュで封止します。ここでは、1匹の寄生虫を含む単一の感染赤血球が観察できます。青色はDPEであり、寄生虫のDNAを表しています。緑色は転写されているある遺伝子のmRNAを表しています。別の画像では、赤色がもう一方の遺伝子のmRNAを表しており、3番目の画像では、両方の遺伝子転写の二重染色を確認できます。またこれらの画像から、付着しているmRNAが核DNAに重ね合わされており、一般的にその上や横に位置しているわけではないことが分かります。感染した赤血球の99%において、2つの遺伝子のmRNAが転写されていることを検出できます。この実験の重要な点は、プローブが他の遺伝子にアニーリングしていないかを確認することです。この画像では、感染した赤血球を両方のプローブとともにインキュベートしていますが、1つのプローブのみがIEに結合しています。ここでは、他の遺伝子は転写されていません。可視化された感染赤血球の他の画像では、この状況が逆転しています。Plasmodium falciparum原虫は一般に膜がよく保存されており、DNAとRNAの両方で明確な染色が見られます。何らかの理由で細胞の質が低い場合、染色性も同様に低下します。この画像に示されているように、DNAとRNAは拡散して混濁し、比較的不明瞭に現れます。結論として、この手法は他の血液寄生虫にも容易に適用できると言えます。また、我々の転写データは、感染細胞上の表面発現pf EMP1タンパク質を標的とする特異的抗体を用いて、解析したmRNAから翻訳されたタンパク質を検出する実験によっても裏付けられています。

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

RNAのホールマウントするための方法を組み合わせることにより、...

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明...

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。...

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

栄養膜巨細胞(TGC)は、健康な妊娠を確保するために胎盤で重要な役割を果たします。着床後胚のクライオスタット切片または胚の7日目の外胎盤錐体の短期培養における新生蛍光in...

の新生RNA FISHによる転写分析<em&gt;インビボ</em&gt;栄養膜巨細胞または<em&gt;インビトロ</em&gt;栄養膜コーン外植片の短期文化

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ...

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ...

その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

学ぶFISH法によるPlasmodium falciparum感染赤血球における単一細胞mRNA転写解析。複数var遺伝子の同時発現を可視化し、マラリア原虫の転写動態を解明する有用な手法です。

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析

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