Name: Picoeukaryoteのゲノム形質転換 Ostreococcusタウリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶ電気穿孔によるOstreococcus tauriの遺伝子形質転換法。海洋性ピコ真核藻類を用いた安定形質転換系の構築と選択法を解説し、植物生物学研究への応用可能性を示します。

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BBSRCとEPSRC賞D019621によって資金を供給統合システム生物学センターSynthSys。 FYBへエクセレンス &quot;マリンゲノム&quot;助成金EUのFP6ネットワークは、遺伝的形質転換法の開発に資金を提供しています。

1。藻類材料の調製<ol><li> Ostreococcus細胞は 、人工海水（ASW）で培養されています。塩分濃度計を用いて測定された海塩（1リットル当たり典型的には約40グラム）が、pptの30の塩分濃度に脱イオン水に溶解されています。表1-3で説明したように増菌培地11,12、微量金属元素やビタミンが追加されます。メディアは、0.22μmのフィルターを通して、フィルター滅菌します。 </li><li>メンテナンスのため、Ostreococcus株 OTTH95の細胞は新鮮なASW 7日ごとに1/100の希釈で無菌的に継代培養で、ムーンライトブルーフィルターを装備し、植物成長のインキュベーター内で一定の光の下で成長した。光強度に近い20モルm -2 s -1でのあるべきであり、温度を20℃に維持されてい細胞は一定の撹拌を必要としませんが、凝集を防ぐために、2〜3日後に動揺しています。 </li><li>各変換のために、細胞を50mlのセル·ドで必要とされる継代培養後に5-7日間を達成すべきである20から30×10 6 ml -1の 、のnsity。おおよその細胞密度とaxenyは、フローサイトメトリーまたはX40倍率の少なくともhaemocytometerのいずれかを使用して決定することができます。 </li></ol> 2。エレクトロポレーション<ol><li>形質転換用DNAを調製する。各形質転換のために、純粋な、線状化プラスミドDNA5μgを滅菌脱イオン水では1μg/μlの濃度で必要とされています。このDNAを得るために、著者らは他の方法が同様に働くかもしれませんが、キアゲンミディプレップキットを使用することをお勧めします。使用するベクターのバックボーンにカットする酵素ではなく、遺伝子または選択遺伝子でで製品を消化。さらに精製し、エタノール沈殿によって得られた直鎖DNAを集中し、高品質の滅菌脱イオン水の適切な量の製品を再懸濁します。 </li><li>各変換のための5μgのDNAを含むマイクロチューブを準備します。 controないDNAとlが変換される各セルの行が必要です。各変換のための2mmのエレクトロポレーションキュベットと一緒に、氷の上でこれらのチューブを保持します。 </li><li>変換ごとに再懸濁バッファー2.2 mlを準備します。のddH 2 O中1M溶液に溶解させるソルビトール、0.1％プルロニック酸F68とフィルター滅菌を追加します。 </li><li>円錐形の底の50 mlチューブに、最終的な細胞に0.1％の濃度、および10で8000X gで10分間ペレットそれら℃にプルロニック酸F68を追加します。すぐに上下にピペッティングによる再懸濁緩衝液1mlで細胞を再懸濁して、遠心管に移す。 10°Cで8000 xgで10分間スピンダウンし、すぐに作業を、もう一度、この洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>カットチップで、再懸濁バッファー40μlで各最終ペレットを再懸濁します。氷の上で線状化DNAのすべてのチューブに再懸濁した細胞の40μlを加え、穏やかに混合し、エレクトロポレーションキュベットに移す。 </li><li> electropにキュベットを入れ演説のマシン。 6 kVのcm -1で 、600Ω、25μFに設定を変更します。細胞をエレクトロポ。 </li><li> 10分間室温でキュベットにelectoporated細胞をインキュベートし、組織培養フラスコを準備するその時間を使用しています。それらにラベルを付け、それぞれに新鮮なASWの30ミリリットルを追加します。各フラスコから1mlを取り出し、優しく対応するキュベットに追加します。 2分間インキュベートし、ゆっくりとASWを削除するには、現在のセルの球を含み、優しくゆっくりと培養フラスコにASWに直接ピペット。 </li><li>細胞は一般的に球に残っています。この瞬間に集約された細胞を振るか、邪魔しないように注意してください。フラスコを振盪することにより再懸濁した後、細胞が1-2時間インキュベーターに回復することができます。この時、細胞は自由に再懸濁するべきでない塊は見えないはずです。インキュベーターで一晩回復するために文化を残す。 </li></ol> 3。半固形培地で細胞をプレートに含めること<ol><li&gt;の次の日は、攪拌棒の入ったボトルでのddH 2 O 2.1％低融点アガロース溶液をオートクレーブします。加熱マグネチックスターラーの上に水を含む大きなビーカーに65から90°Cで溶融保持します。各変換に9 ASWのmlに加えて必要な選択を含む8ペトリ皿（55 mm径）と8×15 mlチューブにそれぞれが準備します。 NourseothricinまたはG418を使用している場合は、2 mg / mlのを使用しています。 </li><li>インキュベーターから形質転換細胞を収集します。滅菌flowhoodで働いて、チューブのいずれかで9ミリリットルを沸騰LMPアガロース1mlを追加します。チューブを閉じ、転倒混和する。その後、新たに形質転換細胞の0.5mlを加え素早く混合し、プレートに注ぐ。残りの7つの管で、このプロセスを繰り返しますし、次の変換フラスコに進みます。 </li><li>アガロースを設定するためのプレートは、時間のフローフード内で開いたまま。その後、プレートを閉じて、4枚それぞれを保持する大きな正方形をペトリ皿にそれらを転送します。正方形のプレートウィットを封印Hパラフィルム。プレートが完全に設定されていないことに注意してください、その結果、ゲルは非常に壊れやすいものです。ケアは、プレートを取り扱う際にはゲルを壊さないように注意する必要があります。インキュベーター内のすべての正方形のプレートを置きます。 </li></ol> 4。形質転換コロニーの選択<ol><li>コロニーは、形質転換プレート上ではなく、モック変換プレート上で10から21日後に表示されます。コロニーを選択するカットオフヒントを200μlのピペットを使用しています。単に自由なコロニーを選択し、緑色のコロニーを吸い出す。近隣のコロニーから任意のセルが含まれていないように注意してください。 </li><li> 24ウェルプレートに、選択を含む液体培地2mlにセルを転送します。 Nourseothricinを使用する場合は、1.75 mg / mlのを使用しています。上下にピペッティングにより混和する。変換ごとに24から50コロニーを選択します。パラフィルムとインキュベータへの転送でプレートをシールします。 </li><li>一週間後、24ウェルプレートの選択で2 mlの新鮮なASWを各ウエルに100μlを転送し、additionaために成長するL 7日。生き残った細胞株は、さらなる研究のために使用することができます。ゲノムおよび挿入数に安定した統合は、PCRおよびサザンブロット法を用いて分析する必要があります。ゲノムDNAは、植物DNA抽出のための任意のダウンスケーリングされた標準的な方法を用いてこれらの目的のために取得することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果細胞は、1/100、7日間の成長後、ミリリットルあたり2500万個の細胞密度に達して分割します。適切な設定を持つ細胞のエレクトロポレーションは、時定数10〜14ミリ秒となりました。細胞は培養フラスコに培地に移している場合、セルの球を形成する必要があります。軽く時間後に振とうした場合、細胞が容易に懸濁する必要があります。 0.2％LMP寒天に1ミリリットルの形質転換細胞の包含は、一貫しただけの半固体ゲルになるはずです。コロニーは10から21日後に表示されます。変換ごとに上記のプロトコルを使用して線状化DNAの5μgを変換し、50から100コロニープレートは、通常、負の制御プレート上なしと比べ、期待されていた。 〜選んだコロニーの80％が積極的に液体培地に抗生物質耐性によって選択されたと、その後の研究で使用されていた。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 最終濃度 </td><td> ストック溶液 </td><td> 1リットルのボリューム </td></tr><tr><td> NaNO 3を </td><td> 8.83×10 -4 M </td><td> 75グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> NH 4 Clを</td><td> 3.63×10 -5 M </td><td> 2.68グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> β-グリセロリン酸</td><td> 1×10 -5 M </td><td> 2.16グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td> 1×10 -8 M </td><td> 1.29 mg / LでのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>トリスベース液（pH7.2） </td><td> 1×10 -3 M </td><td> 121.1グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> K微量金属溶液</td><td></td><td>表2 </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td> f / 2のビタミン溶液</td><td></td><td>表3 </td><td> 0.5 mLの</td></tr></tbody></table> 表1。 Oの成長のための培地成分タウリ 11、12は 30 pptの塩分に人工海水1リットルの総量を確認し、示されているようにストック溶液から上記のコンポーネントを追加します。週間以内に培地および使用をフィルター滅菌する。ビタミン溶液を除くすべての化合物のストックは、媒体のすべてのリットルのこの溶液6mlを追加するためにプールすることができます。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 最終濃度 </td><td> ストック溶液 </td><td> 1リットルの金額 </td></tr><tr><td>のNa 2 </sUB&gt; EDTA•2H 2 O </td><td> 1×10 -4 M </td><td></td><td> 41.6グラム</td></tr><tr><td>のFeCl 3•6H 2 O </td><td> 1×10 -5 M </td><td></td><td> 3.15グラム</td></tr><tr><td>のNa 2たMoO 4•2H 2 O </td><td> 1×10 -8 M </td><td> 6.3グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛4•7H 2 O </td><td> 1×10 -9 M </td><td> 22.0グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>のCoCl 2•6H 2 O </td><td> 1×10 -9 M </td><td> 10.0グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>のMnCl 2•4H 2 O </td><td> 1×10 -8 M </td><td> 180.0グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>のCuSO 4•5H 2 O </td><td> 1×10 -8 M </td><td> 9.8グラム/ LのdH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr></tbody></table> 表2。金属溶液11,12をトレースします 。のdH 2 Oで1リットルの合計、および溶解する熱に構成しています。ストレージ用に小分け液と凍結。最終濃度は、最終的な培地ではなく、微量金属溶液を参照して示された。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 最終濃度 </td><td> ストック溶液 </td><td> 1リットルの金額 </td></tr><tr><td>ビタミンB 12 </td><td> 1×10 -10 M </td><td> 1グラム/ LのdH 2 O </td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td> 1×10 -9 M </td><td> 0.1グラム/ LのdH 2 O </td><td> 10 mLの</td></tr><tr><td>チアミン塩酸• </td><td> 1×10 -7 M </td><td></td><td> 200 mgの</td></tr></tbody></table> 表3。 F / 2ビタミン溶液11のdH 2 O、フィルター滅菌し、分注し、凍結で1リットルの合計を最大にします。最終濃度は、最終的な培地ではなく、ビタミン溶液を参照して示された。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> 図1。変換手順のグラフィカルな概要。遺伝的エレクトロポレーションによってOstreococcusタウリ型を変換する手順の模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> 図2。培養増殖。細胞は7日ごとに新鮮なASWの1/100の希釈で無菌的に継代培養であり、インキュベーターがムーンライトブルーフィルタを装着し、植物の成長に一定の光の下で成長した。光強度に近いから20マイクロモルm -2 s -1である必要があり、温度を20℃に維持するC細胞は、一定の撹拌を必要としますが、sではありません凝集を防ぐために2〜3日おきに一度ハーケン。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> 図3。 0.2パーセントLMPアガロース大きな正方形のペトリ皿に転送4プレート、パラフィルム（左上）とシールのコロニー形成 。コロニーが形成されている場合は、単にフリー（理想的には円錐形）コロニー（右上）を選択し、P200のピペットを用いてプレートからそれらを吸う。ネガティブコントロール（右下）にはコロニーがあってはなりません。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

細胞の状態や文化axenyは、変換手順については、非常に重要である。細胞は通常、光12時間のサイクルで維持されていますが、12時間暗、これらの条件下で培養した細胞の形質転換効率が不十分であることが判明した。繰り返しペレット化/再懸濁ステップ中に、細胞は常に容易に再懸濁する必要があります。細胞の集合体、あるいは粘液様物質が存在する場合は、再度最初から手順を開始することをお勧めします。通常は、〜50のコロニーがネガティブコントロールのプレート上なしと比べ、各形質転換プレートに期待することができます。低い形質転換効率の場合には、培養条件は細胞が最適な状態であることを確認するために変更する必要があります。形質転換効率に影響を与える変数は、周囲の研究室の温度（に近い20°Cなければなりません）と処理速度（ペレット化細胞からの手順[2.3]回復[2.7]〜1時間を取るべきであるから）が含まれています。それはまた重要であるすべてのソリューション再は、各変換の前に新鮮ました。プレートに含めるために、LMPアガロースの濃度が非常に重要です。Ostreococcus細胞が高いアガロース濃度で成長せず、低濃度で拡散します。 Ostreococcusの3つの形質転換ベクターは、以前6公開されており、より多くのベクトルが生成され、まもなく公開されることが期待されています。既存のベクトルポットリュック6 Potoxベクトル6 Ostreococcusから採取した強力な誘導13プロモーターを運ぶのに対し、高速なトランスジェニックラインの選択に加えて扱いやすいの発現パターンを可能にするC-末端ホタルルシフェラーゼタグとの組み合わせで、任意のプロモーターを使用することができます目的の遺伝子の過剰発現に対する高親和性リン酸トランスポーター（HAPT）遺伝子。 Potox-Lucのベクトルが過剰発現株の間接的な選択のために使用できる追加のルシフェラーゼマーカーを運ぶ、Potoxから派生<s14&gt;まで。これらのベクトルに成功した選択マーカーはNourseothricinとG148があります。しかし、Ostreococcus細胞は多くの抗生物質に対して非常に耐性があり、トランスジェニックOstreococcus細胞の選択のために必要な化合物の濃度は、従来のモデルシステム（2 mg / ml）をより高くなっています。 プロセスが非効率に見えますが、この手順に必要な細胞とプラスミドDNAの大規模な数は有意な障害をもたらしません。大きな制限は、選択マーカーに耐性のあるすべての生成された行は、全体構造がDNAに組み込まれていることを確認するために個別に分析する必要があるということです。我々は、選択マーカーの正常な発現は、興味のある実際の遺伝子の挿入に対応していませんでした例を観察している、すなわち部分的な統合が発生する可能性があります。明らかに、ゲノムにランダムに挿入すると、このメソッドを使用して、挿入部位のないコントロールが存在しないことを意味し、メソッドB相同組換えにasedは、現在開発されています。しかし、ここで説明するメソッドは、現在、私たちの最善の知識に、遺伝子組み換えOstreococcus細胞を生成するための唯一の特徴とする方法である。 Ostreococcusタウリはごく最近の実験モデル生物として使用されているように、これらの細胞で働くほとんどのメソッドは進化する可能性があると関わって成長している研究コミュニティによって洗練される。このプロトコルは、人々がOstreococcusで作業を開始する際に役立ちますが、決してこの藻類のゲノム変換について知っているそこにあるすべてを説明するために主張されています。読者はインキュベーターの小さな違い（光のレベルまたは質）およびその他のパラメータが存在し、おそらくこのために必要な健康文化を得るためにすべての個々の研究室で最適化する必要がありますので、自分のニーズに合わせて、このプロトコルを適応させることができると著者らは、信頼プロトコル。マスタリング後の技術は、ここで説明するベクターは、プロモーターの範囲の制御下で発光、蛍光、またはその他のタグ融合行を生成するように構築することができます。このエキサイティングな新しい実験プラットフォームは、どのように複雑な生化学的な問題を勉強するために有用であろう薬理学的ア ​​プローチは、非常に3を容易にされている、複雑さの低減の真核生物で解決されています。

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 培地成分 </td></tr><tr><td> 化学物質 </td><td colspan="2" > カタログ番号 </td><td> サプライヤー </td></tr><tr><td>インスタントオーシャンマリンソルト</td><td colspan="3">から<a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a>または<a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3を </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td> NH 4 Clを</td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>グリセロール-2 - リン酸二ナトリウム塩水和物</td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td> H 2 SEO 3 </td><td colspan="2"> 84920-250G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>超純粋なトリス</td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td>のNa 2 EDTA•2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td></tr><tr><td>のFeCl 3•6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>のNa 2たMoO 4•2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100G-R </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>硫酸亜鉛4•7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>のCoCl 2•6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>のMnCl 2•4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>のCuSO 4•5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>ビタミンB 12（シアノコバラミン） </td><td colspan="2"> V2876 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>ビオチン</td><td colspan="2"> 47868 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>チアミン塩酸• </td><td colspan="2"> T4625 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>ネオマイシン</td><td colspan="2"> N6386 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td colspan="2"> K4000 </td><td>シグマ</td></tr><tr><td colspan="4"> 培養用消耗品 </td></tr><tr><td colspan="2"> アイテム </td><td> カタログ番号 </td><td> サプライヤー </td></tr><tr><td colspan="2">チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT25懸濁培養</td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2">チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT75懸濁培養</td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedトン</td></tr><tr><td colspan="2">チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT175懸濁培養</td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> TPPボトルトップフィルター、1L、完全な</td><td> 99950T </td><td>バイオヘレナ</td></tr><tr><td colspan="2"> TPPボトルトップフィルター、500ミリリットル、 </td><td> 99500T </td><td>バイオヘレナ</td></tr><tr><td colspan="2"> TPPボトルトップフィルター、250ミリリットル、 </td><td> 99250T </td><td>バイオヘレナ</td></tr><tr><td colspan="2"> TPPボトルトップフィルター、150ミリリットル、 </td><td> 99150T </td><td>バイオヘレナ</td></tr><tr><td colspan="2">海洋水族館のための塩分計</td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > 変換のための化学物質 </td></tr><tr><td> 化学物質 </td><td> カタログ数</td><td> サプライヤー </td></tr><tr><td> D-ソルビトール</td><td> S6021-1KG </td><td>シグマ</td></tr><tr><td>プルロニックF-68ソリューション</td><td> P5556-100ML </td><td>シグマ</td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td>ウェルナー</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td> 16520-050 </td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td colspan="3"> 変換のための消耗品 </td></tr><tr><td> アイテム </td><td> カタログ番号 </td><td> サプライヤー </td></tr><tr><td>チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT25懸濁培養</td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td>チャンネルを注ぐと通気組織培養フラスコT75懸濁培養</td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td>組織培養フラスコT175サスペンションのCu注ぐチャンネルで通気ltures </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td>グライナー遠心管を50ミリリットル</td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td>ジーンパルサー/ MicroPulserキュベットは0.2 cmのギャップ、50 </td><td> 165-2086 </td><td>バイオ·ラッド</td></tr><tr><td>ペトリ皿の丸いPS 3通気孔H14.2Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWRインターナショナル</td></tr><tr><td>照射明確な120ミリメートルによって滅菌4口のポリスチレンとペトリ皿の正方形</td><td> FB51788 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td></tr><tr><td>ムーンライトブルー光フィルター</td><td> 183 </td><td>イ·照明</td></tr></tbody></table>

picoeukaryoteのゲノム形質転換<em&gt; ostreococcusタウリ</em

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

植物科学の急速な進歩を妨げる一般的な問題は、細胞、組織および生物全体の複雑さ、および高等植物の簡単な遺伝学に影響を与えるゲノムの冗長性の特に高いレベルが含まれています。小説のモデル生物Ostreococcusタウリ型は、日付に知られている最小の自由生活真核生物であり、大幅に減少ゲノムサイズと細胞の複雑さの1,2を有しており 、あたりほとんどの細胞小器官の一つの存在（ミトコンドリア、葉緑体、ゴルジスタック）によって明らかにセル、唯一の〜8000の遺伝子を含むゲノム。さらに、unicellularityと容易に文化の組み合わせは、ケミカルバイオロジー的アプローチの影響を受けやすいプラットフォームを提供します。最近、Ostreococcusが正常に概計時3-6基礎となる基本的なメカニズムを研究するために採用されている。このモデル生物からの結果は、植物科学だけでなく、哺乳類の生物学7だけでなく、影響を与えています。この例は、どのように迅速な実験に焦点を当て緑系統からの単純な真核生物は、複雑さの低減のこの背景には技術的に可能な方法を使用して検証可能な仮説を生成することによって、より複雑な生物の研究を加速することができます。ゲノムや遺伝子を変更する可能性の知識はすべてのモデル種で欠かせないツールです。遺伝的Ostreococcusを変換する以前に報告された方法6,10は世界でも数少ない研究室によく知られているのに対し、ゲノムの1、トランスクリプトーム8、この種のプロテオミクス9については、自由に利用可能です。 この記事では、遺伝的に過剰発現してこの小説のモデル生物を変換するための実験方法はから発信された変換線の選択を可能にするためにエレクトロポレーションを用いて詳細に説明されて、同様に低い割合アガロースで形質転換細胞の封入の方法で構築する単一の形質転換細胞。 Ostreocoの成功したアプリケーションは、次概日リズムの研究にccus、Ostreococcusへの関心の高まりは、バイオテクノロジーの領域を含む植物科学、内と外の多様な研究分野から期待することができます。保存された生化学的経路上で動作生物学および医学の広い範囲から研究者が大規模なモデル生物種のゲノムと生物複雑性から自由に、Ostreococcusの研究を追求すると考えるかもしれません。

この資料では、単細胞の海藻の遺伝的形質転換を説明<em&gt; Ostreococcusタウリ</emエレクトロポレーションによる&gt;。この真核生物では、大幅に減少し、ゲノムと細胞の複雑さを憑依し、細胞培養と化学生物学の両方に容易に従順され、高等植物のための有効なモデルのプラットフォームです。

Picoeukaryoteのゲノム形質転換<em&gt; Ostreococcusタウリ</em

植物科学における急速な進展を妨げる共通の課題には、細胞、組織、および個体全体の複雑さに加え、特にゲノムの高いレベルの...

本手順の全体的な目的は、新しいモデル生物であり、海洋性のピコ真核藻類の一種である Austria Occus Tori の安定したトレンチジェニック系統を作製し、選抜することです。これは、まず形質転換1回につき 50 milliliters の高密度 ALG 培養液から細胞ペレットを作製することで達成されます。次のステップでは、細胞を線形化 DNA と混合し、エレクトロポレーションを行います。形質転換細胞を新鮮な培地で希釈し、一晩培養した後、0.2% 低融点アガロースと選択剤を加え、混合液を小型のペトリ皿に分注します。最終ステップとして、一定の青色光の下で2〜3週間培養した後に成長したコロニーをピックアップします。最終的に、液体培地での選択を行い、続いて PCR やサザンブロットなどの分子解析を行うことで、作製した形質転換系統のゲノムにコンストラクトが正常に組み込まれたことを確認します。Arabidopsisのような既存のモデル生物と比較して、この生物を使用する主な利点は、ゲノムの複雑さを大幅に軽減できることであり、これにより、遺伝的な冗長性が実質的にない状態で制御ネットワークの研究が可能になります。私の研究室ではosteo occusを用いて植物の概日時計の研究を行ってきましたが、この生物は他の多くの複雑な細胞ネットワークの研究にも利用可能です。したがって、本手法の意義は植物生物学の領域をはるかに超えて広がっています。個々の手順は比較的単純に見えますが、良好な結果を得るためには、細胞の適切な取り扱いと効率的なワークフローが不可欠であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。本手順の一部は、研究助手のCulin Kishによって実演されます。Austria Occus細胞は人工海水（SW）で培養します。SWを調製するには、1リットルあたり40 gを溶解させます。脱イオン水に海塩を加え、測定値で塩分濃度を30 parts per thousand（PPT）に調整します。塩分計を用いて、濃縮液、培地微量金属元素およびビタミンを添加し、その後、0.22 micronフィルターでろ過滅菌した海水中にAustria cocus strain O TT H 95の粗細胞を添加し、定常光下で培養します。ムーンライトブルーフィルターを備えた植物育成インキュベーター内で、光強度は20 micromoles per meter square per second付近とし、温度は20 degrees Celsiusに維持します。細胞に絶え間ない撹拌は必要ありませんが、凝集を防ぐために2〜3日ごとに1回振盪させます。細胞の維持には、7日ごとに新鮮なSWを用いて1:100の希釈率で無菌的に継代してください。各形質転換には、細胞密度が20〜30×10⁶ cells/mLの細胞が50 mL必要です。この密度は、継代から5〜7日後に到達する必要があります。おおよその細胞密度と軸は、ヘモサイトメーターを用いて最低40倍の倍率で推定することができます。あるいは、フローサイトメトリーによる測定が推奨されます。ここでは、健康な培養細胞と不健康な培養細胞の例を示します。各バイオパラメトリックプロットは、y軸にサイドスキャッター（SSC）を、x軸に細胞あたりの赤色蛍光（FL3）を示しています。FL3はクロロフィル赤色蛍光を表し、SSCは相対的な細胞サイズを示します。健康な細胞はAustria Occusウィンドウ内に収まりますが、死滅しつつある細胞や混入した細菌はこのウィンドウ外に分布します。理想的には、99%以上の細胞がAustria Occusウィンドウ内にある必要があります。効率的な遺伝子形質転換のためには、1回の形質転換につき、濃度1 µg/µLの純粋な直線化プラスミドDNAを5 µg使用します。滅菌脱イオン水中で、使用したベクターのバックボーンを切断し、外来遺伝子または選抜遺伝子を切断しない酵素によって、プラスミドを直線化しておきます。各形質導入において、DNAを含むマイクロ遠心チューブと2 mmのエレクトロポレーションキュベットを共に氷上で保持します。形質導入を行う各細胞株について、DNAを含まないコントロールが必要です。各形質導入につき、50 millilitersの細胞をコニカルチューブに移し、0.1%onic acid F 68を添加し、10 degrees Celsiusで8,000 ×gにて10分間遠心分離します。細胞をペレットにするため、直ちに上清を除去し、1 mLのResus懸濁バッファーを細胞に加えます。ピペッティングにより細胞を再懸濁し、マイクロ遠心チューブに移して、10 °C、8,000 ×gで10分間遠心分離します。迅速に操作を行い、2回目の遠心後に細胞をもう一度洗浄します。P 200チップを切断し、各ペレットを40 µLのResus懸濁バッファーで再懸濁します。氷上で、再懸濁した細胞40 µLを線状化DNAが入った各チューブに加えます。穏やかに混合し、エレクトロポレーションキュベットに移します。キュベットをエレクトロポレーション装置にセットします。設定を6 kV/cm、600 Ω、25 µFに調整します。エレクトロポレーション後、細胞を回収します。キュベットに入れた細胞を室温で10分間インキュベートします。その間に、組織培養フラスコにラベルを貼り、各フラスコに新鮮なa SWを30 milliliters加えます。各フラスコからa SWを1 milliliter取り出し、対応するveteに緩やかに加え、2分間インキュベートします。次に、細胞の凝集塊を含むa SWを慎重に取り出し、a SWに直接、ゆっくりと丁寧にピペッティングします。培養フラスコ内では、細胞は通常、大きな凝集塊のまま留まります。この時点で、凝集した細胞を振ったり乱したりしないように注意してください。その後、インキュベーター内で1〜2時間、細胞を回復させます。最後に、フラスコを手で振って細胞を再懸濁させます。この時点で、細胞は容易に再懸濁され、凝集塊が見られないはずです。電気穿孔法の翌日まで、インキュベーター内で一晩培養して細胞を回復させます。その後、スターラーバーを入れたボトル内で、2.1%低融点アガロース溶液を二回蒸留水で調製し、オートクレーブで滅菌します。加熱磁気撹拌機上の水を入れた大きめのビーカーに入れ、65から90 °Cで溶融状態を維持します。各形質転換につき、50 mmのペトリ皿8枚と、SWプラス選択培地を9 mLずつ入れた50 mLチューブ8本を準備します。インキュベーターから形質転換細胞を回収します。この手順で最も困難な点は、細胞を過度な熱にさらして整合性を損なうことなく、低濃度のAgrosゲルに形質転換細胞を組み込むことです。そのため、滅菌フローフード内で、次に行ういくつかの手順を迅速かつ効率的に実施することが重要です。沸点に近い低融点アガロース1 mLを、SW 9 mLに加えます。チューブの1本を密閉し、転倒混和させます。次に、新鮮な形質転換細胞0.5 mLを加えます。速やかにチューブを密閉して転倒混和させ、その後、内容物をペトリ皿に注ぎます。残りの7本のチューブでこの操作を繰り返し、次に別の形質転換フラスコに移ります。アレイを固めるため、フローフード内でディッシュを開いたまま1時間放置します。その後、ディッシュに蓋をし、4つの丸型ディッシュが入る大きな正方形のペトリ皿に慎重に移します。ディッシュが完全に凝固していないため、ゲルが非常に脆くなっています。ディッシュを扱う際は、ゲルを破損させないよう注意してください。正方形のディッシュをパラフィルムで密封し、インキュベーターに入れます。コロニーが出現したら、カットオフチップを装着した200 µLピペットを使用します。クリーンベンチ内でコロニーをピックアップするには、独立したコロニーを選択し、緑色のコロニーを吸い上げます。この際、隣接するコロニーの細胞を含めないよう注意してください。細胞を選抜剤を含む2 mLの液体培地に移します。24ウェルプレートを用い、ピペッティングで混合します。形質転換あたり24または48個のコロニーを選抜した後、プレートをパラフィルムで密閉し、インキュベーターに移します。1週間後、各ウェルから100 µLを、選択剤を含む2 mLの新鮮なSWへ移します。24ウェルプレートを用いて、さらに7日間培養します。生き残った細胞株は、5 µgの直線化DNAを導入して、さらなる研究に使用することが可能です。本プロトコルを用いると、2から3週間後に形質転換プレートあたり20から60個のコロニーが出現します。ピックアップしたコロニーの約80%が液体培地での抗生物質耐性により陽性選択され、本手順に従ってその後の研究に使用されました。trench遺伝子の導入後、挿入数および挿入部位を確認するために、PCRやサザンブロットなどの他の手法を後続して実施することができます。この技術により、概日時計や細胞周期分野の研究者は、新たなモデル生物であるAustria Caucus. Toriにおけるそれぞれのシステムの複雑な構成要素と挙動を理解することが可能となりました。このビデオを視聴することで、形質転換Austria caucus系統の作製方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

プロトコルは、メチロトローフ酵母を用いたタンパク質の発現を説明します...

メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス</em

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

出典: Stefan、A.、 et al.、 大腸菌におけるタンパク質共発現の多面的な利点。 J. Vis. 経験。 (2015年)このビデオでは、抗生物質耐性遺伝子を保有するプラスミドで 大腸...

高電圧エレクトロポレーションを用いた細菌の調製と形質転換

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合成生物学は、非正規のアミノ酸の co-translational の挿入を使用して前例のないプロパティとタンパク質工学を可能です。ここでは、我々 は選択圧定款 (SPI) 経由のエシェリヒア属大腸菌の「ゴールド」蛍光タンパク質 (GdFP) と呼ばれる、蛍光分光特性を持つ型 GFP...

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リ モシラクトバチルス・ロイテリ におけるエレクトロポレーションと形質転換確認の方法 DSM20016

この原稿では、 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌の抗生物質の生存を評価するための包括的なプロトコルを提供し、プラスミドを 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌...

緑 膿菌 および 黄色ブドウ球 菌の不均一な表現型のタイムラプス落射蛍光顕微鏡イメージング

このプロトコルは生物発光レポーターを採用しており、 Saccharomyces eubayanus...

インビボ 酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

学ぶ電気穿孔によるOstreococcus tauriの遺伝子形質転換法。海洋性ピコ真核藻類を用いた安定形質転換系の構築と選択法を解説し、植物生物学研究への応用可能性を示します。

Picoeukaryoteのゲノム形質転換

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