Picoeukaryoteのゲノム形質転換 Ostreococcusタウリ

この手順の全体的な目標は、海洋ピコ真核生物のlgal種である新規モデル生物であるAustria Occus Toriの安定したトレンチジェニック系統を生成して選択することです。これは、形質転換ごとに50ミリリットルの高密度ALG培養物から細胞ペレットを生成することによって最初に達成されます。2番目のステップは、細胞を直鎖状DNAと混合し、次にエレクトロポレーションを行うことです。

形質転換細胞を新鮮で培地で希釈し、一晩インキュベートした後、0.2%低融点のaaseと選択剤を加え、混合物を小さなペトリ皿に注ぎます。最後のステップは、一定の青色光の下で2〜3週間のインキュベーション後に成長したコロニーを選択することです。最終的には、液体、培地、およびPCRやサザンブロットなどのその後の分子解析での選択を使用して、生成されたトランスジェニック系統のゲノムにコンストラクトがうまく組み込まれることを示します。

シロイヌナズナのような既存のモデル生物と比較してこの生物を使用する主な利点は、ゲノムの複雑さを大幅に軽減し、遺伝的冗長性をほとんど持たずにバックグラウンドでの調節ネットワークの研究を可能にすることです。私の研究室では、植物の概日時計を研究するために骨占拠を使用してきましたが、他の多くの複雑な細胞ネットワークの研究にも使用できます。したがって、この技術の意味するところは、植物生物学の領域をはるかに超えています。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、個々のステップがかなり単純に見えますが、良好な結果を得るためには細胞の適切な取り扱いと効率的なワークフローが不可欠であるため、非常に重要です。この手順の一部は、研究室の研究助手であるCulin Kishによって実演されます。オーストリアのオッカス細胞は、人工海水またはSWで培養され、SWを調製し、1リットルあたり40グラムを溶解します。

脱イオン水中の海塩は、測定された30分の100またはPPTの塩分濃度まで。塩分計を使用して、濃縮、中微量金属元素、ビタミンを添加し、その後、オーストリアのコカス株O TT H 95の0.22ミクロンフィルター総細胞を通じて滅菌した濾過を、一定の光の下でSWで行います。月光青色のフィルターを装着した植物成長インキュベーターでは、光の強度は毎秒20マイクロモル/平方メートル/秒に近く、20°Cに保たれた細胞は常時攪拌を必要とせず、凝集を防ぐために2〜3日に1回振とうします。

メンテナンスのために、7日ごとに新鮮なSWで1〜100の希釈で細胞を無菌的に継代培養します。各形質転換には、1ミリリットルあたり6個の細胞の10倍から30倍の細胞密度で50ミリリットルの細胞が必要です。この密度は、サブカルチャーの5〜7日後に達成する必要があります。

おおよその細胞密度と斧は、ヘモサイトメーターで最低40倍で推定できます。倍率は、フローサイトメトリーによって優先的に決定されます。ここでは、健康なカルチャと不健康なカルチャの例を示します。

各バイオパラメトリックプロットは、y軸に側方散乱光またはSSCを示し、x軸に細胞あたりの赤色蛍光またはFL3を示しています。FL 3はクロロフィル赤色蛍光を表し、SSCは相対的な細胞サイズを示します。健康な細胞はオーストリアのオッカスウィンドウに分類されますが、死にかけている細胞や汚染された細菌はこのウィンドウの外側に落ちます。

理想的には、細胞の99%以上がオーストリアのオッカスウィンドウにある必要があります。効率的な遺伝子形質転換のためには、各形質転換には5マイクログラムの純粋な直鎖状プラスミド、DNAは1マイクロリットルあたり1マイクログラムの濃度が必要です。滅菌脱イオン水では、プラスミドは、使用されるベクターの骨格を切断する酵素によって直鎖化されていますが、導入遺伝子や選択遺伝子では切断されません。

DNAを含むマイクロ遠心チューブを氷上に保ち、形質転換ごとに2mmのエレクトロポレーションベテと一緒に保管します。形質転換する各細胞株には、DNAを含まないコントロールが必要です。各形質転換について、50ミリリットルの細胞を円錐形の底部を有するチューブに移し、0.1%オン酸F 68を加え、10°CでGの8, 000倍で10分間遠心分離する。

ペレット化するには、細胞を直ちにsup natantを廃棄し、1ミリリットルのResus懸濁液バッファーを細胞に加えます。Resusは、ピペッティングで上下に動かして細胞を懸濁し、マイクロゴミチューブに移し、8, 000回で10分間スピンダウンします。Gは摂氏10度で働き、2回目のスピン後に細胞をもう一度すばやく洗浄します。

P 200チップをカットして、各ペレットを40マイクロリットルのResus懸濁液に再懸濁します。再懸濁した細胞の40マイクロリットルで、氷上の直鎖状DNAの各チューブに緩衝します。穏やかに混合し、エレクトロポレーションベテに移します。

veteをエレクトロポレーションマシンに入れます。設定を、相互センサーあたり6キロボルト、600オーム、25マイクロデイに調整します。エレクトロポレーション後にセルを電気操作します。

キュベット内の細胞を室温で10分間インキュベートします。この間に、組織培養フラスコにラベルを付け、各フラスコに30ミリリットルの新鮮なSWを追加します。各フラスコから1ミリリットルのSWを取り出し、対応する獣医に静かに加え、2分間インキュベートします。

次に、細胞のグロを含んでいるa SWを静かに取り除き、培養フラスコ細胞が通常大きなグロに残る SW.In に直接優しくゆっくりとペットします。このとき、凝集したセルを振ったり、乱したりしないように注意してください。細胞をインキュベーター内で1〜2時間回復させます。

最後に、フラスコを手動で振って細胞を再懸濁します。この時点で、細胞は自由に再懸濁し、凝集物は見えないはずです。エレクトロポレーションオートクレーブの翌日にインキュベーターで一晩回復するために培養物を残し、スターロッドを含むボトル内の二重蒸留水に2.1%低融点ハーゼの溶液を

加熱磁気スターに水が入った大きなビーカーで摂氏65〜90度で溶かし続けます。変換ごとに、8つの50ミリメートルペトリ皿と8つの50ミリリットルチューブを準備し、それぞれに9ミリリットルのSWプラスが含まれています。必要な選択。

インキュベーターから形質転換細胞を回収します。この手順の最も難しい部分は、形質転換された細胞を低割合のアグロスゲルに含め、細胞を過度の熱にさらすことによって細胞の完全性を損なうことなく含めることです。そのため、手順の次のいくつかのステップを迅速かつ効率的に実行することが重要です 無菌フローフードでの作業。

1ミリリットルの沸点に近い低融点のアースを、チューブの1つ SW.In 9ミリリットルに加え、チューブを閉じて反転させて混合します。次に、0.5ミリリットルの新しく形質転換した細胞を追加します。チューブをすばやく閉じて反転させ、混合してから、その内容物をペトリ皿に注ぎます。

残りの7本のチューブでこのプロセスを繰り返してから、次の形質転換フラスコに進みます。アレイが固まるまで、皿をフローフードで1時間開いたままにします。次に、皿を覆い、それぞれが4つの丸い皿を保持する大きな正方形のペトリ皿に注意深く移します。

皿が完全にセットされていなかったため、ジェルは非常に壊れやすいです。お皿を取り扱う際は、ジェルを破らないように注意してください。正方形の皿をパラフォームで密封し、インキュベーターに入れます。

コロニーが現れたら、カットオフチップ付きの200マイクロリットルのパープを使用します。無菌フードでコロニーを選ぶには、単に無料のコロニーを選択し、緑色のコロニーを吸い出します。隣接するコロニーの細胞を含めないように注意してください。

細胞を、選択物を含む2ミリリットルの液体培地に移します。24ウェルプレートでは、上下にペッティングして混合します。形質転換ごとに24または48のコロニーを選択した後、プレートをパラフィルムで密封し、インキュベーターに移します。

一週間後、各ウェルの100マイクロリットルを新鮮なSWの2ミリリットルに選択して移します。24ウェルプレートでさらに7日間成長させます。その後、生き残った細胞株を5マイクログラムの直鎖状DNAを形質転換する際に、さらなる研究に使用できます。

このプロトコルを使用すると、形質転換プレートあたり20〜60のコロニーが2〜3週間後に現れるはずです。選抜されたコロニーの約80%は、液体培地中の抗生物質耐性によって陽性に選択され、この手順に続くその後の研究で使用されました。

PCRまたはサザンブロットのような他の方法は、その後、その開発後のトレンチ遺伝子の挿入数および位置を確認するために実施することができる。この技術により、概日時計と細胞周期の分野の研究者は、この新しいモデル生物であるオーストリアコーカスで、それぞれのシステムの複雑な構成要素と振る舞いを理解することができました。トーリ、このビデオを見た後、トランスジェニックオーストリアの党員集会ラインを生成する方法についてよく理解しているはずです。