Name: プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶプリオンのタンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅法（PMCA）を用いて、ハムスター適応プリオン株をin vitroで増幅する方法。ソニケーションとインキュベーションサイクルにより、プリオン変換メカニズムと検出法の開発に貢献します。

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我々は、原稿の批判的な読みのために博士はヴェスパーのFeマリーラモスに感謝したいと思います。この作業は、研究資源のためのナショナルセンター（P20 RR0115635-6、C06 RR17417-01とG20RR024001）と国立神経疾患研究所およびストローク（2R01 NS052609）によってサポートされていました。

1。機器の準備<ol><li> Misonix 3000または37の温度を一定に保つためにサーモエレクトロンNeslab EX-7水槽（ニューイントン、ニューハンプシャー州）に接続Misonix 4000ソニケーター（ファーミングデール、ニューヨーク州）℃を使用するサーモサイエンティフィック（ウォルサム、マサチューセッツ州）から入手したドーム型のキャップ付き200μlの薄壁PCRチューブストリップのサンプルを超音波洗浄します。 </li><li>真新しいソニケーターは連続運転9の&quot;慣らし&quot;期間を必要とします。 2ヶ月のブレークイン期間は10に設定されて振幅レベルを持つ40秒の超音波処理バーストと10分インキュベーションサイクルで構成されています。一つはチタンプレートホーン（ 図1、パネルB）の表面全体に浸食を確認する必要があります。循環水は、チタンマイクロホーンの浸食による白濁を見ていきます。毎日この水を交換してください。 </li><li> PrP Scの増幅は、マイクロプレートホーンを通して変化します。最高のPrP Scの増幅効率が内に取得することができるマイクロホーンの中心から5cmの半径（ 図1、パネルCを参照してください）。 </li><li> PMCAの一周は144サイクルで構成されています。各サイクルは、5秒の超音波処理し、10分間のインキュベーションで構成されています。これは大体PMCAのラウンドごとに24時間に負わせるでしょう。 </li><li>超音波破砕機のコントロールパネルに表示されて超音波処理の電力出力は、超音波破砕機のラックと水浴から循環水の温度に存在するPCRチューブの数によって異なります。水は37℃で平衡化されていることを確認し、超音波処理装置のチューブラック（ 図1、パネルC）の30％以上を記入しない。マイクロプレートホーンを通してPCRチューブを広げた。 PCRチューブストリップ間の空の空間の少なくとも1つの行を持っている（ 図1、パネルC）ストリップあたり一緒に接続されていない4つ以上のチューブを許す。 </li><li>超音波処理の強度は、成功したプリオン株の増幅のために重要です。超音波処理しながら、パワー出力を持つように振幅を調整155〜170ワットの間の範囲。私たちの研究室では、電力レベルは、それぞれMisonix 3000およびMisonix 4000の6と7に設定されています。 </li><li>硬水の汚れを蓄積しないように水浴中で蒸留水を使用します。毎週この水を交換してください。インキュベーションおよび超音波処理サイクル中に、凝縮水は、マイクロプレートホーンのふたの内側に発生します。 図1に示すように、結露を避けるために、パネルA、超音波破砕機の筐体ボックスの上部に小さな水槽の熱·アタッチ·パッド</li></ol> 2。サンプルの準備<ol><li>動物を含むすべての手順は、クレイトン大学施設内動物のケアと使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する指針に準拠した。任意の組織採取する前に、動物を麻酔とtranscardially氷冷リン酸を用いて灌流しなければなりませんが、脳から血液を除去するとの阻害を回避するために、pH7.4の5mMのEDTAとの緩衝生理食塩水血液7によるPMCA反応。無菌技術を用いて急速に動物組織を採取し、それぞれのプリオン株のための専用の解剖ツールを持っている。切開した後、1.5 mlのマイクロチューブに組織を置き、フラッシュがドライアイスの上に凍結し、-80℃で保管して℃を均質化するまで。 </li><li> PMCA基板（PrP Cの ）溶液を調製し、Tenbroeck組織グラインダーを用いて氷冷変換バッファで10％重量/体積（w / v）溶液（パート3を参照）に感染ハムスター脳（国連BH）ホモジナイズする。ホモジナイズしながら、溶液の過剰な泡立ちを避けるために、グラインダーの内側に空気を入れないように注意してください。 30秒、アリコートを1.5ml微量遠心チューブの上清を500×gで遠心分離することによって解決策を明らかにする。 -80℃で保存さらなる使用まで。 </li><li> PMCAシード（PrP Scの）溶液を調製し、氷冷ウォートを10％（w / v）の溶液中に感染性物質（脳、脾臓、リンパ節、他の組織または汚染された土壌）をホモジナイズrとアリコート0.6ミリリットルマイクロチューブ内の溶液。 -80℃で保存さらなる使用まで。 </li></ol> 3。変換バッファの準備<ol><li> 50mlのメスフラスコ（結果はトリトンX-100の1％の最終濃度である）（;シュタインハイム、ドイツのSigma-Aldrich社）でのTriton X-100の0.5093グラムの重量を量る。 </li><li> 1コンプリートプロテアーゼインヒビタータブレット（;マンハイム、ドイツロシュ·ダイアグノスティックス社）を追加します。 </li><li> EDTAの0.0931グラム（これはEDTAの5mMの最終濃度になります）（;フィリップスバーグ、ニュージャージー州マリンクロット·ベイカー社）を追加します。 </li><li> 1N NaOHでpHを7.4に調整してください。 </li><li>ダルベッコのリン酸50mlに音量を調節するには（;マナッサスメディアテック株式会社）（DPBS）緩衝生理食塩水。 </li><li>真空ろ過装置と0.45μmのニトロセルロース膜を通して溶液をフィルタリングします。変換バッファが一箇月以内に4℃で保存することができます。 </li></ol> 4。 PMCAを使用したプリオン株の増幅<ol><li>PCRチューブに1:20の比率（ すなわちミックス PMCAシードの5μlとPMCA基板の95μl）をPMCAで基板にPMCAシードを希釈します。 -80℃で15μlのアリコート°unsonicated制御のためのCを削除して保存すること。このunsonicatedコントロールはウエスタンブロット（WB）の分析に続いてプロテイナーゼK（PK）消化によりPrP Scの増幅を定量化するために使用されます。追加unsonicated制御はPMCA反応の持続時間のために37℃で第二15μlのアリコートを配置することによって生成することができます。 3回繰り返しの最小値は統計上の目的のために必要です。 </li><li>主題図1に示すように、PMCAの1ラウンドにサンプルの残り（70μl）を、パネルA.シェイクチューブPCRチューブのドーム型キャップの結露を避けるために、すべての5時間。 </li><li>サンプルのチューブがhomog確保するために、任意の手順の後に開く前に（溶液はドーム形キャップに行っていないことに注意して）スピンダウンし、軽くボルテックスして下さいeneityと潜在的な汚染を避ける。 </li><li>短い潜伏期間株（ すなわち 、HY、TME、HaCWD、または263K）のシリアルPMCA（sPMCA）では、新鮮な未感染の95μLにラウンド1からの超音波処理したサンプルの5μlを転送することにより、1:20の割合で超音波処理した材料を希釈脳ホモジネート（ 図2、パネルB）。 </li><li>潜伏期間が長い株（ すなわち DY TME、139H、22CH、22AH、またはME7H）のsPMCAについては、感染していない新鮮な50μlのにラウンド1からの超音波処理したサンプル50μlを転送することにより、1:1の割合で超音波処理した材料を希釈脳ホモジネート（ 図2、パネルB）。 </li><li>以前に希釈混合超音波処理（ステップ4.4または4.5）から215μlのアリコートを取り出して、-80℃で、それらのいずれかを格納し、37℃と他の℃（PMCAラウンド2用unsonicated制御ソリューション）。 PMCAラウンド2への残党を施す。 </li><li>この手順は、無限に繰り返すことができます。私たちの研究室では、我々ひずみ特性は変わらずで、PMCA 15ラウンドまで行ってきた。 </li><li> PKはサンプルを消化。典型的なWBのために、サンプルを5μl（この溶液は、40μg/ mlの最終濃度のPKを持つことになります）にPKを80μg/ mlの5μlを混合し、37℃で1時間インキュベートする。ゲルローディング緩衝液10μlを追加します。 10分間この溶液を沸騰。解決策は冷えるとゲルに10μlをロードしましょう​​。 </li><li>増幅の成功を計算するには、どちらかにそれらを比較することによって増幅されたPrP Scの量を推定するために、PK-消化サンプル、unsonicatedコントロール20,21 図2、パネルCまたは組換えPK-消化されていない既知の量に上のWB分析を実行プリオン。 </li></ol> 5。クロスコンタミネーションの回避重要なステップは、クロスコンタミネーション及びプロテアーゼ耐性製品の de novo形成に起因する偽陽性の発生を最小限に抑えるように注意する必要があります。 </P&gt; <ol><li>各プリオン株のためのサンプル収集のための解剖ツール専用セット（ すなわち鉗子、ピンセット、はさみ）を使用します。 </li><li> PMCA基板として使用されるために感染していない脳を均質化する前に、1％の漂白剤でピペットを拭いてください。 10分間1％の漂白剤で超音波処理装置のPCRチューブラック、組織ホモジナイザー、及びPCRチューブの収納ラックを浸して、蒸留水で十分に洗い流してください。 </li><li>新しいサンプルをホモジナイズするたびに新鮮なVersi-ドライラボ浸すと作業領域をカバーする、新しいPMCA実験が準備されるとき、またはsPMCAのラウンドの間に小分け。 </li><li>新しい手袋に新しいサンプルが（sPMCAラウンド間のアリコートを転送する場合は特に）に処理されるたびに使用してください。 </li><li>各PMCAサイクルの短い超音波処理のバーストを使用しています。 10分間のインキュベーションを組み合わせる5秒の超音波処理のサイクルは 、de novo の PrP Sc 1,20,21,23,24を生成せずにプリオンを増幅するのに十分である。他の研究室が示したように、増加超音波処理時間は、超音波の振幅を増加させ、PMCAのサイクル数を拡張することはde novoの PrP Scの形成2の確率を増加させる。 </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+properties+of+the+prion+protein+from+two+strains+of+the+transmissible+mink+encephalopathy+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent.</a> J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+PrP+properties+suggest+the+molecular+basis+of+strain+variation+in+transmissible+mink+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy.</a> J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+biologically+distinct+strains+of+transmissible+mink+encephalopathy+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters.</a> J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).</li>
<li>Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134, 757-768 (2008).</li>
<li>Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+propagation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cell-free propagation of prion strains.</a> EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).</li>
<li>Caughey, B., Raymond, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrapie-associated+form+of+PrP+is+made+from+a+cell+surface+precursor+that+is+both+protease-+and+phospholipase-sensitive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive.</a> J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).</li>
<li>Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+native+prions+from+minimal+components+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation of native prions from minimal components in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+different+scrapie+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Competition between different scrapie agents in mice.</a> Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).</li>
<li>Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+prions+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious prions in urine.</a> FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).</li>
<li>Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high+fidelity+prion+amplification+within+and+across+prion+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers.</a> PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

感染性プリオンタンパク質を増幅するという課題は、長い潜伏期間および in vivo実験での経費です。 PMCA技術は感染性プリオンエージェントを増幅するための費用効果的な手段です。いくつかの研究室では、正確に試験管 7、9、12、14、19,24 のプリオン株を増幅するPMCAの能力を確認しています。 プリオン病は、種間で送信することができます。 Bessenとマーシュは効果的に二つの異なるハムスター由来のプリオン株5を生産伝染性ミンク脳症、とハムスターに接種した。エレガントな研究では、シカ科のPrP Cが点（Tg（CerPrP）1536 + / - ）を発現するトランスジェニックマウスを使用して、RML、占いや同僚マウス由来のプリオン株を増幅するsPMCAを使用PMCA基板としての。疾患の迅速な開始は、Tgの接種（CerPrP）後に観察された1536 + / - PMCA適応材料12と。同様に、クルトらが...

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬/機器</td><td>メーカー</td><td>猫。数</td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeckティッシュグラインダー</td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab EX-7ウォーターバス</td><td>サーモエレクトロン</td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> 0.2ミリリットルのPCRチューブストリップ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td>コンプリートプロテアーゼインヒビター</td><td>ロッシュ</td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTAを</td><td> JTベーカー</td><td> 4040から00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>マリンクロット·ベイカーメディアテック</td><td> 21から031-CV </td></tr><tr><td> Versi-ドライラボSoakers </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> REPTIサームヒーター</td><td>動物園メッド·ラボラトリーズ社</td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

プリオンは、動物とヒト9,18で必然的に致命的な伝達性 ​​海綿状脳症（TSE）を引き起こす感染性病原体である。プリオンタンパク質は、2つの異なるアイソフォームは、非感染性宿主でエンコードされたタンパク質（PrP C）および感染質（PrP Sc）は、PrP Cの8の異常に折り畳まれたアイソフォームを持っています。 プリオン剤での作業の課題の1つは、ホスト13接種後の臨床徴候の開発の前に長い潜伏期間があります。これは、伝統的に長く、高価な動物のバイオアッセイ研究を命じた。さらに、PrP Scの生化学的および生物物理学的特性はあまり彼らの異常なコンフォメーションと凝集状態に起因する特徴がある。 PrP Sc は 試験管 14 内 の PrP ScへのPrP Cの種子変換することができます。 PMCAはアドバを取るのin vitro手法ですのPrP CとPrP Scの種子19微量の過剰な量を含んでいるシステムから、加速度的に、PrP Scのを大量に生成するために超音波処理およびインキュベーションサイクルを使用してこの能力のntage。この手法は、効果的にプリオン株の干渉をエミュレートするためには、PrP CからPrP Scの変換の種および株特異性を再現するために、感染した組織、体液、および環境試料6,7,16からPrP Scの非常に低いレベルを増幅することが証明されています23。 一貫性のある結果を生成し、それらの結果を定量化、汚染を最小限にするための提言を含め、本稿では詳細PMCAプロトコルを、。我々はまた、感染性プリオン株、プリオン株の干渉、及び環境中のプリオンの検出の発生と特性化など、いくつかのPMCAアプリケーションを、議論する。

タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はin vitroで 7 におけるPrP Scは、12、14、19、24を増幅するために使用されます。 図3に示すように、成功したPrP Scの増幅が PK耐性プリオンタンパク質（ハムスター由来のプリオン株の19および30kDaの間の移行）のウエスタンブロットのバンド強度の増加によって示されている。後のバンド強度の増加PMCAはPK耐性PrP Scの物質の増幅を示しています。ハムスター由来のプリオンタンパク質、HaCWDとDY TMEの成功は、PMCA増幅前（レーン5および7）、（レーン4,6）後のバンド強度を比較することにより、 図3のWB分析に示されている。 PrP ScのPK消化は、それぞれジ、モノ、および非グリコシル化型プリオン蛋白質に対応する、ア...

タンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅（PMCA）はプリオン変換とひずみと種の壁の研究のためのin vitroアッセイである。また、プリオン検出アッセイとして使用することができます。

プリオンは、動物およびヒトにおいて不可避的に致死的な伝達性海綿状脳症（TSE）を引き起こす感染性因子である9,18。プリオンタンパク質は...

本手順の目的は、ハムスター適応PreOn株をin vitroで効率的に増幅させることです。まず、基質として使用する非感染ハムスター脳をホモジナイズし、次にシードとして使用する感染組織を調製します。次に、PCRチューブ内で基質とシードを混合し、超音波処理とインキュベーションサイクルによるタンパク質不適切折り畳み周期増幅法（PMCA）を行います。次に、増幅された物質を新鮮な基質で希釈してin vitroで連続増幅させ、PMCAを行います。最後に、サンプルをプロテアーゼKで消化し、ウェスタンブロットで分析します。最終的に、ウェスタンブロットにおけるバンド強度の増加によって、プリオン株のin vitro増幅を判定することができます。この手法は、PreOn増幅に関与する重要な共因子は何かといった、PreOn分野における主要な疑問への回答に役立ちます。一般的に、この手法を初めて行う方は、テクニックに関する些細ながら重要な詳細事項や、サンプルのクロスコンタミネーションの回避に苦労することがあります。ホモジナイズを行う前に、ピペットを1% bleachで拭き取り、超音波処理用PCRチューブラック、組織ホモジナイザー、およびPCRチューブ保管ラックも同様にbleachで十分に浸してください。10分後、各器具を蒸留水で十分にすすぎ、作業エリアを新しいVerly dry lab Soakerで覆います。次に、10 buric組織粉砕機と、新しく調製した氷冷コンバージョンバッファーを用いて、非感染ハムスター脳を10%重量対容量溶液になるまでホモジナイズします。PMCA基質溶液を使用し、ホモジナイズ液を15 milliliterコニカルチューブに入れ、500 ×gで30秒間遠心分離してホモジナイズ溶液を清澄化します。次に、大きなペレットの分注分を避けるように注意しながら、得られた上清を1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに分注します。PMCAシード溶液を調製するには、先ほど実演した方法と同様に、回収した感染性物質を10%重量対容量溶液にホモジナイズしますが、変換バッファーの代わりにデュロスリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を使用し、その後、溶液を0.6 millilitersのマイクロ遠心チューブに分注します。増幅手順を開始する前に、作業エリアを新しく滅菌済みのドライラボソーカーで覆い、PMCA基質を200 microliterの薄壁PCRチューブストリップに分注し、そこにPMCAシードを1対20の比率で希釈します。計4つの繰り返しサンプルを赤色のラベル付きチューブに入れます。各サンプルの15 µL分注液を2回分ずつ、青色のラベルが付いたPCRチューブに入れ、-80 °Cの未処理コントロールとして使用します。さらに、各サンプルから15 µL分注液を2回分ずつPCRチューブに入れ、追加の未処理コントロールとして37 °Cで保存します。その後、-80 °Cの未処理コントロールを-80 °Cのフリーザーに、もう一方の未処理コントロールを37 °Cのインキュベーターに入れ、PMCA反応の間保持します。各サンプルの残りの70 µLが入ったPCRチューブストリップを、37 °Cの恒温に設定された循環水槽に接続した超音波処理装置に入れ、最初のPMCA増幅ラウンドを開始します。交差汚染を確認するための模擬コントロールとして、PMCA基質のみを含むPCRチューブを含めることができます。PCRチューブをマイクロプレートホーン全体に分散させ、ソニケーターのチューブラックの30%以下を充填してください。PCRチューブストリップの間には少なくとも1列の空きスペースを設け、1ストリップあたり4本以上のチューブを連結させないでください。P-R-P-S-Cの増幅は、マイクロプレートホーン全体で異なります。最高のP-R-P-S-C増幅効率は、マイクロプレートホーンの中心から半径5 cm以内で得られます。1ラウンドのPMCAは144サイクルで構成され、1サイクルあたり5秒間の超音波処理と10分間のインキュベーションを行い、1ラウンドのPMCAにつき約24時間かかります。超音波処理中は、出力が155～170 Wの範囲になるように振幅を調整してください。サンプルの相互汚染につながる可能性がある結露を防ぐため、ソニケートの蓋にアクアリウム用ヒーターパッドを設置します。ラウンド完了後、PCRチューブのドーム型キャップに水滴が結露するのを防ぐため、5時間ごとにチューブを振ってください。チューブストリップをサーマルサイクラーから取り出し、サンプルをスピンダウンさせます。次に、チューブを軽くボルテックスしますが、キャップを開けた際の汚染をさらに最小限に抑えるため、溶液がキャップに触れないようにしてください。縁に触れないように注意し、キャップは清潔なキムワイプの上に置きます。その後、PreOn株の連続PMCAを行うため、超音波処理したサンプル5 µLを、新鮮なPMCA基質95 µLに転送します。サンプルごとに新しい手袋を使用してください。次に、超音波処理した各サンプルから15 µLずつ2回分分注し、一方を-80 °Cで、もう一方を37 °Cで保存します。PMCA第2ラウンドの未処理コントロール溶液については、残液を先ほど示した方法で第2ラウンドのPMCAに供します。この工程は、必要に応じて何度でも繰り返すことができます。非感染脳のPMCA基質のみを含むPCRチューブを組み込むことで、クロスコンタミネーションを確認できます。所定のラウンド数のソニケーションを行った後、18 µg/mLのproteinase K 5 µLを、ソニケーション済みサンプル、-80 °Cコントロール、および37 °Cコントロールのそれぞれが入った別々のPCRチューブに5 µLずつ加え、37 °Cで1時間消化させます。次に、消化したサンプルにゲルローディングバッファーを10 µL加え、溶液を10分間加熱します。冷却後、サンプルとゲルローディングバッファーの混合液を10 µL、ウェスタンブロット用ゲルにロードします。増幅されたP-R-P-S-Cの量を決定するために、ウェスタンブロットにおけるプロテアーゼK消化サンプルの量を、未処理のコントロールまたは既知量のプロテアーゼと比較します。未消化の組換えPrPC。PrPCおよびPMCAを用いてPrPScをin vitroで増幅させます。ハムスター適応Prionタンパク質、ハムスターCWD、およびdrowsy TMEの増幅成功は、PMCA前後でのバンド強度を比較したこのウェスタンブロット解析で確認できます。PrPScのプロテイナーゼK消化後のウェスタンブロット解析では、それぞれ非糖鎖付加、単糖鎖付加、および多糖鎖付加プリオンタンパク質に対応する上段、中段、下段のバンドが示されます。一部のプリオン株は、その電気泳動移動度によって区別することが可能です。例えば、ハムスターCWD株とdrowsy TME PreOn株の間には、電気泳動における移動度に2kDaの差があります。この高精度の増幅は、PMCAで増幅したPreOnハムスターCWD株が対応するハムスターCWDシードと同様の電気泳動移動度を示すこと、およびdrowsy TME株がそのdrowsy TMEシードと同様の移動度を示すことによって確認されます。交差汚染やde novoなPrPSc形成が起こっていない場合、ウェスタンブロット分析において、OFMコントロールPMCAサンプルはプロテアーゼK消化後にブランクのままであるはずです。この手順を行う際は、相互汚染を防ぐため、新しいサンプルを使用する前にすべての器具を洗浄することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

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ウェスタンブロッティングを用いたマウス脳組織におけるミスフォールドプリオンタンパク質凝集体の検出

このビデオでは、シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質の分解アッセイについて説明しています。この方法は、誤って折り畳まれたタンパク質のダイナミクスを研究し、タンパク質の代謝回転の詳細なメカニズムを明らかにするのに役立ちます。...

ミスフォールディング傾向タンパク質分解アッセイ:シクロヘキシミド処理と界面活性剤分画を用いたミスフォールドタンパク質分解のモニタリング技術

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拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

このレポートは、ウェスタンブロットまたは蛍光ベースのアッセイによって、誤って折り畳まれたタンパク質の分解速度を測定するためのプロトコルを説明しています。この方法は、他のミスフォールドタンパク質の分析やハイスループットスクリーニングに適用できます。...

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このプロトコルでは、出芽酵母でタンパク質に基づく継承のため画面の機能的に高スループット方法論について説明します。...

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リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

病原性タンパク質凝集体がプリオンのようなプロパティを持つセルの間に広がって神経変性疾患に関連する考えを支持する証拠を蓄積します。ここでは、モデル生物、ショウジョウバエのプリオンのような骨材の細胞-細胞拡散の可視化を可能にする手法について述べる。...

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スカベンジャーは無病領域に糞中の感染伝達性海綿状脳症プリオンを移動させる可能性を持っている。私たちはマウス適応スクレイピープリオンはアメリカのカラスの消化管（ アメリカガラス ）、死んだ動物の共通の消費者も通過した後、感染のままかどうかを判断するために使用される詳細な方法。...

鳥類の消化器系を通過した後の感染プリオンを識別するための手順

学ぶプリオンのタンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅法（PMCA）を用いて、ハムスター適応プリオン株をin vitroで増幅する方法。ソニケーションとインキュベーションサイクルにより、プリオン変換メカニズムと検出法の開発に貢献します。

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

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