して、古いニワトリ胚への遺伝子導入 EX OVOエレクトロポレーション
July 27th, 2012
後のインキュベーション段階（ハンバーガーとハミルトンステージ（HH）22歳以上）でニワトリ胚への遺伝子導入方法が記載されています。このメソッドは次の欠点を克服するエレクトロポレーションは、古いニワトリ胚に適用され、古い発達の段階で遺伝子の機能と調節を研究するための便利なテクニックです。
この手順の全体的な目標は、in vivoで高齢のニワトリ胚に遺伝子導入を行い、高齢の発達段階での遺伝子機能と調節を研究することです。これは、最初に孵卵日2.5頃に卵を割って、全胚をペトリ皿システムに移すことによって達成されます。第2のステップは、目的の遺伝子をコードするプラスミドを胚の適切な部分に注入することです。
プラスミドを胚の横に配置してX ovoエレクトロポレーションを行った後、最終ステップはエレクトロポレーションされた胚を採取して分析することです。最終的に、免疫組織化学は、胚に導入された遺伝子の発現を検出するために使用されます。今日は、チキンBLを使用したXオーバルエレクトロポレーションの方法をご紹介します。
この技術の主な利点は、Xオーバーエレクトロポレーションが、古いニワトリ胚の遺伝子導入に使用されるオーバーエレクトロポレーションの問題を克服できることです。ニワトリ胚のX ovo培養を成功させるには、新鮮な受精卵を使用する必要があります。摂氏12度で保存した卵を1週間以上使用しないでください。
2.5日間のインキュベーション後、摂氏37.5度、湿度60%の強制ドラフトインキュベーターで卵を長辺に産みます。胚がハンバーガーとハミルトンについているとき。ステージ17、インキュベーターから卵を取り出します。
各卵の上部に鉛筆でラベルを付け、各卵の割れる方向を示します。直径145ミリメートルの清潔で大きなシャーレに約20ミリリットルの滅菌蒸留水を注ぎます。直径94ミリメートルの小さな滅菌ペトリ皿を大きなペトリ皿に入れます。
次に、鋭い金属のエッジに対して底の各卵を割ります。卵を慎重に開き、中身全体を小さなペトリ皿に移します。胚の良好な品質を確保するために、卵の全内容物は、ビリン膜に損傷を与えることなく、ペトリ皿システム内で通常は丸い形で保持する必要があります。
各卵の中身を小皿に移した後、大皿に蓋をします。X ovoエレクトロポレーションの前に、摂氏37.5度、湿度約60%でさらに培養するために、ペトリ皿システムを別のインキュベーターに入れます。極性微小電極を使用して、直径1.0mmのガラス管からガラスキャピラリーを引き抜きます。
ガラスキャピラリーの先端を適切な直径に折ります。次に、エレクトロポレーションの適切なパラメータ(異なる組織や胚のサイズに対する異なる電圧など)を設定します。標的組織と胚のサイズに応じて、適切な電極をエレクトロに接続します。
標的遺伝子とマーカー遺伝子をコードするプラスミドを含むプラスミド溶液を調製します。このデモンストレーションでは、カドヘリン7またはCAD 7をターゲットとし、緑色蛍光タンパク質またはGFPをマーカーとしています。最終濃度0.1%までファストグリーンを添加し、プラスミド溶液をグリーンに標識します。
最後に、マウスピペットを使用して、ガラスキャピラリーにプラスミド溶液をロードします。X ovo培養物から得られたニワトリ胚を6日間インキュベートした胚をX ovoエレクトロポレーションに用います。この手順を開始するには、細い鉗子を使用して視蓋上のタイレン膜と羊膜を慎重に引き裂き、蓋の表面に滅菌0.9%塩化ナトリウム溶液を3滴加えます。
マウスピペットを使用して、ガラスキャピラリーからプラスミド溶液をテクタムの空洞に注入します。タングステンニードルカソードと長方形のプレートアノードを備えた電極をテクタムの横に置きます。すぐにエレクトロを使用して、テクトゥムに電気パルスを印加します。
大きなシャーレを蓋で覆い、GFPおよびCAD 7をコードするプラスミドをE6のチキンテクタムにエレクトロポレーションしてから2、3日後にインキュベーターに戻します。テクタムを採取して免疫染色のために固定します。その結果は、この図の E 8 に示されています。GFPタンパク質は、ここにあるこれらの全マウント画像で示されているように、tum内で強く発現しています。
パネルAは明視野画像です。パネルBはA GFP画像で、パネルCが浮上しています。さらに、パネルDで緑色で可視化された9つのGFPタンパク質とパネルEで赤色で可視化されたCADの7タンパク質は、パネルFの黄色で表されるように共発現しています。正しく行われると、X ovoエレクトロポレーションの効率は60〜100%これらの結果は、X ovoエレクトロポレーションがin vivoで高齢のニワトリ胚への遺伝子導入に成功した方法であることを示唆しています。
このビデオを見れば、古いニワトリの胚に遺伝子導入を行う方法と、実験の幸運についてよく理解できるはずです。
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概要
この記事では、Hamburger and Hamilton stage 22以降の高齢鶏胚への遺伝子導入方法について説明しています。この技術は、後期の発育段階における遺伝子機能と調節の研究を容易にすることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 遺伝子導入技術
- 胚発生
- エレクトロポレーション法
背景
- 遺伝子導入は遺伝子機能の研究に不可欠です。
- 高齢の鶏胚は卵内での電極導入に独特の課題を提示します。
- 改良された方法により、研究成果を向上させることができます。
- この研究は、既存の制限を克服するための新しいアプローチに焦点を当てています。
研究目的
- 高齢鶏胚への体内遺伝子導入を行うこと。
- 後期の発育段階における遺伝子機能と調節を調査すること。
- 卵外電極導入の有効性を示すこと。
使用した方法
- 孵化2.5日目に卵を割ること。
- 胚をペトリ皿システムに移すこと。
- 対象遺伝子をコードするプラスミドを胚に注入すること。
- 電極を用いて卵外電極導入を行うこと。
主要な結果
- 高齢鶏胚への成功した遺伝子導入。
- 免疫組織化学法による遺伝子発現の検出。
- 卵外電極導入技術の実証。
- 遺伝子調節の研究における潜在的な応用。
結論
- この方法は高齢胚における遺伝子導入の有効な代替手段を提供します。
- 後期の発育段階における遺伝子機能の研究能力を向上させます。
- 将来の研究では、この技術を様々な応用に活用することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Studying gene function in later developmental stages is critical for target validation in developmental biology and disease modeling. The ex ovo electroporation method enables mechanistic de-risking by overcoming limitations of in ovo approaches in older embryos, supporting predictive confidence in gene regulation studies. This approach enhances translational continuity from discovery to preclinical validation in vertebrate systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses and pathway clarification in older chicken embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation at advanced developmental stages.
- Strategic Value: Improves predictive confidence and portfolio triage by allowing gene transfer when in ovo methods fail.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling plasmid transfection in specific embryonic regions.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through controlled ex ovo culture and electroporation parameters.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and scalability for compound evaluation in later-stage embryonic models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment through gene expression detection in developing tissues.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation via immunohistochemistry-based readouts.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by demonstrating successful gene transfer and expression in older embryos.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification, supporting hypothesis testing and biological de-risking in vertebrate models.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in older embryos.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs via plasmid injection and electroporation in cultured embryos.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including immunohistochemistry for gene expression detection.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment through co-expression analysis of target and marker genes.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable across developmental timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of gene transfer in older embryos.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on successful gene expression data.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in embryology, microsurgery, and electroporation techniques.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include electrodes, pulse generators, and immunohistochemistry systems.
- Cross-team standardization requirements for embryo staging, plasmid preparation, and electroporation parameters.
- Adaptation considerations across model systems, including tissue-specific targeting and embryo age optimization.
- Practical limitations supported by source material: dependence on fresh fertilized eggs and precise staging for successful ex ovo culture.
