に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル ¹⁵ Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

本実験の目的は、水溶性タンパク質および膜タンパク質を含む細胞抽出液中で、特定の標的タンパク質と特異的に相互作用するタンパク質を同定することです。まず、クロレラ（chlamydomonas）細胞を窒素14および窒素15を用いて完全に代謝標識し、TPを含む細胞溶解物と含まない細胞溶解物を調製します。オプションの架橋ステップを行うことで、一過性のタンパク質間相互作用を安定化させることができます。次に、細胞溶解物を分画し、不溶性タンパク質および膜タンパク質を濃縮し、そこから標的タンパク質およびその特異的な相互作用パートナーを分離します。

コントロールタンパク質および混入タンパク質を免疫沈降させ、エルートします。次に、免疫沈降させたタンパク質を混合して3重消化を行い、タンデムLCMSで分析します。その結果、標的タンパク質と特異的に相互作用するタンパク質では $^{14}\text{N}$ と $^{15}\text{N}$ のペプチド比が異なり、それ以外では等しくなるため、真の相互作用パートナーと偽の相互作用パートナーを区別することができました。

標的タンパク質、コントロールタンパク質、および混入タンパク質における14N/15Nペプチド比。タンパク質間相互作用を解析するための最適な手法は、細胞抽出液中で本来の立体構造と濃度で存在する標的タンパク質を、その相互作用パートナーと共に直接免疫沈降させることです。

しかしながら、その手法を用いると、現代の質量分析計は極めて感度が高いため、主に抗体と相互作用することで混入タンパク質までもが共沈してしまいます。その結果、混入タンパク質も明確に検出されてしまい、偽陽性と真の相互作用パートナーを区別することが不可能になります。この問題は、本手法によって解決されます。本手法は、¹⁵N代謝標識免疫沈降アフィニティー変調（ここではATP状態で媒介）および定量質量分析に基づいています。

この手法は、私の研究室のシニア博士課程学生であるStefan SCH Malingerによって実演されます。10世代にわたって細胞をラベル化した後、窒素14および窒素15でラベル化したChlamydomonas細胞を、それぞれ2つの分注量ずつ4G SAチューブに移し、遠心分離によって回収します。ペレットを2 mLの氷冷ライシスバッファーで再懸濁し、懸濁液を15 mLのFalconチューブに移します。さらに、各分注量に対して1 mLのライシスバッファーを追加して、残りの細胞を回収します。そこに50 µLの25xプロテアーゼインヒビターと12.5 µLの1 M塩化マグネシウムを加えます。細胞を完全に溶解させるため、冷却時間を設ける目的で20秒間の間隔を空けながら、氷上で20秒間の超音波処理を4回行います。

SW 41 TI薄壁チューブに、6 mLのスクロースクッションを4本分調製します。細胞溶解液の全量をスクロースクッションの上に慎重に重ねます。溶解バッファーでバランスを調整し、遠心分離して可溶性タンパク質複合体と膜分画を分離します。

勾配の上層にある可溶性タンパク質複合体を、4本の15 mLファルコンチューブに回収します。この際、スクロースクッションの一部が混入しないように注意してください。次に、各サンプルに10% Triton X 100を最終濃度0.5%になるように添加します。慎重に混合し、溶出バッファーを加えて全量を7 mLにします。

SDS-PAGEおよび免疫血液分析用として、各可溶性細胞抽出液から70 µLを新しい1.5 mLコニカルチューブに分注し、2×SDSサンプルバッファーを70 µL加えます。次に、SW 41 TI薄壁チューブからショ糖クッションを除去し、各ペレットに3 mLの溶解バッファーを加えます。

10% Triton X-100を1 mL加え、最終濃度を2%にします。超音波処理により各ペレットを溶解させた後、ライシスバッファーを加えて全量を5 mLとし、遠心分離を行います。前と同様に、膜タンパク質複合体の最上層画分を15 mLファルコンチューブに回収します。2% Triton X-100を含むライシスバッファーを加え、最終容量を7 mLにします。

これらのサンプルの70 µLを、SDS-PAGEおよび免疫学的血液分析に使用します。まず、抗体結合タンパク質を平衡化します。ライシスバッファーで2回（各4 mL）洗浄し、8 mLに希釈して分注したsero beadsを使用します。

TP充足およびTP欠乏の$^{14}\text{N}$および$^{15}\text{N}$標識細胞から得られた可溶性または膜タンパク質複合体を含む8本の15 mLファルコンチューブに、懸濁液を1 mLずつ分注する。チューブローラーを用いて4 °Cで2時間インキュベートし、タンパク質複合体を沈殿させる。遠心分離によりビーズをペレット化し、上澄みを除去する。この際、プラスチック壁面に付着したタンパク質による汚染を防ぐため、ビーズの上に少量の液体を残しておく。ファルコンチューブ内の残りのビーズをすべて回収するため、サンプルを新しい1.5 mLコニカルチューブに移す。0.1% Tritonを含む溶解バッファーをさらに0.8 mLずつ加え、ボルテックスした後に軽く遠心分離し、残留ビーズを含むバッファーをエッペンドルフチューブに移す。数回の洗浄ステップの後、サンプルを4 °C、16,100 $\times\text{g}$で15秒間遠心分離する。

まず、通常のピペットでサンプルの上清を除去します。次に、50 µLのハミルトンシリンジを用いて、残っている上清を完全に除去します。各サンプルに、調製したばかりの溶出バッファーを100 µL加え、サーモミキサーで800 RPM、25 °Cでインキュベートし、16,100 ×gで15秒間遠心分離します。

次に、清潔な50 µLのHamiltonシリンジを用いて、各上清を新しいチューブに移します。また、以前のサンプルと同様に、ビーズの工程に50 µLの溶出バッファーを加え、それぞれの溶出液を回収してまとめます。すべてのサンプルEITのうち、30 µLをSDS-PAGEおよび免疫学的血液分析用に保存しておくことを忘れないでください。

次に、A TP処理を行った窒素14および窒素15で標識された可溶性タンパク質および膜タンパク質の、プラスおよびマイナスの溶出沈殿物を混合します。その後、付属の論文に記載されている通り、還元アルキル化および初期の高尿素消化を行います。続いて、ローテーションホイールを用いて、少なくとも16時間のトリプシン消化を行います。

37 °Cで反応させます。16,100 ×g、4 °Cで5分間遠心分離し、トリプシンビーズをペレット化します。上清を新しい2 mLのエッペンドルフチューブに移します。

使用済みのチューブを 50 µL の 20 mM 重炭酸アンモニウムおよび 0.5% 酢酸で洗浄し、最初の上清と合わせて回収します。サンプルの脱塩用自家製 C 18 チップを準備するため、シリンジ針を用いて Emcor C 18 素材からディスクを 2 枚切り出し、200 µL ピペットチップに挿入します。次に、2 mL Eppendorf チューブ 4 本の蓋に穴を開けてチップを挿入し、C 18 ステージチップを 50 µL の溶液 B でプレコンディショニングします。その後、800 ×g、25 °C で 3 分間遠心分離します。

次に、C 18ステージチップを100 µLの溶液で平衡化し、800 G、25 °Cで3分間遠心分離します。この平衡化ステップをもう一度繰り返します。続いて、トリプシン消化後のサンプル上清100 µLをC 18ステージチップにロードし、800 G、25 °Cで3分間遠心分離します。

サンプル上清を完全に適用させるため、カラムへのロードを繰り返します。C 18 ステージチップを洗浄後、50 µL の溶液 B を用いてトリプシン消化ペプチドを新しい 1.5 mL エッペンドルフチューブに溶出させ、800 G、25 °C で 3 分間遠心分離します。この溶出ステップをもう一度繰り返し、その後、迅速真空濃縮機（speed VAC）を用いてペプチドを完全に乾燥させます。

乾燥させたペプチドを20 µLの溶液Aに懸濁し、氷上で少なくとも1時間インキュベートします。その間、超音波バス遠心機を用いて16,100 ×g、4 °Cで20分間のインキュベーションを2回、それぞれ15分間隔で行い、Sennaをnano C-M-S-M-S HSP 70に適用します。熱衝撃タンパク質は、ATPが存在しない場合にのみ、特定の共シャペロンおよび基質と相互作用することが知られています。これらの窒素14標識細胞抽出物において、hsp 70 BおよびCGE 1は、ATPの状態にかかわらず、ほぼ排他的に可溶性画分に局在しています。対照的に、CF 1 betaは、可溶性画分と膜濃縮画分の両方に局在しています。

ソニケーションにより、ATP合成酵素に位置する膜からCF1βの一部がせん断されるため、これは両画分のローディングコントロールとして機能します。ATPの状態に関わらず、窒素14および窒素15で標識された可溶性抽出液から、抗HSP70B抗体によって同程度の量のHSP70Bが沈殿しました。対照的に、膜画分から沈殿したHSP70Bタンパク質のレベルは低く、CGE1のHSP70Bに対する期待される親和性と同様に、ATP十分な膜画分と比較してATP枯渇膜画分由来の量がわずかに多くなりました。

HSP70Bはコンテキスト依存的です。TPが十分にある可溶性画分または膜画分では、CGE1はHSP70Bと共に共沈しませんでした。一方、TP欠損の可溶性画分およびTP欠損の膜画分においてHSP70Bと共に共沈したCGE1タンパク質の量は、沈殿したHSP70Bの量と定量的に相関しています。CGE1がADP結合状態でのみHSP70Bと相互作用することは、質量分析による解析でも観察されています。

この実験では、TPを欠いた窒素14標識抽出液と、A TPを含む窒素15標識抽出液の混合物を用いて沈殿物を調製しました。HS P 70 Bペプチドの重標識体と軽標識体は等しい強度で検出されましたが、A TP欠損抽出液由来のCGE oneペプチドは軽標識体のみが検出されました。相互に標識された可溶性細胞抽出液の混合物から得られたanti HS P 70 D DB沈殿物中の同様のペプチドをここに示します。その結果、TP欠損抽出液中のCGE oneペプチドは重標識体のみが検出され、HSP 70 Bペプチドは軽標識体と重標識体の両方が検出されました。

このビデオを視聴することで、質量分析のためのサンプル調製を含む共沈殿実験の実施方法について、十分な理解を得ることができます。ヒトタンパク質、特にケラチンによる汚染は、質量分析計でのプロファイル測定を妨げるため、この手順を行う際は、手袋の着用、清潔な環境の維持、およびLCMSグレードの試薬の使用といった安全対策が極めて重要であることに留意してください。