に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル ¹⁵ Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

次の実験の全体的な目標は、可溶性タンパク質と膜タンパク質を含む細胞抽出物において、特定の標的タンパク質と特異的に相互作用するタンパク質を特定することです。まず、クラミドモナス細胞を窒素14および窒素15で完全代謝標識し、TPを含む細胞ライセートとTPを欠く細胞ライセートを生成します。オプションの架橋ステップは、一過性タンパク質タンパク質相互作用を安定化するのに役立ちます。次に、細胞溶解物を、標的タンパク質、その特異的相互作用がパートナーとなる高濃度の不溶性タンパク質および膜タンパク質に分離します。

コントロールタンパク質およびコンタミネーションタンパク質は、免疫沈降し、言及されています。次に、免疫沈降タンパク質を混合し、タンデムLCMSで三重に消化および分析します。結果は、異なる窒素、標的タンパク質と特異的に相互作用するタンパク質の14窒素15ペプチド比、および等しい窒素を示すことにより、真と偽の相互作用パートナーを区別しました。

14 標的タンパク質、制御タンパク質、および汚染タンパク質に対する窒素15ペプチド比。タンパク質タンパク質相互作用の解析方法として選択されるのは、選択したタンパク質をその相互作用で直接免疫沈降させることです。細胞抽出物からのパートナーは、両方ともネイティブの確認と濃度で発生します。

しかし、その際、現代の質量分析計として使用される抗体と相互作用するため、主に汚染タンパク質も沈殿します。彼らはまた、汚染されたタンパク質を明確に特定し、それによって欠陥と真の相互作用パートナーを区別することは不可能です。この問題は、A TP状態と定量的質量分析によって媒介される15 N代謝標識免疫沈降アフィニティー調節に基づく、ここに示す手法によって克服されます。

この手法は、私の研究室の博士課程の上級生であるStefan SCH Malingerによって示されます。10世代のための細胞を標識した後、窒素14と窒素15のクラミドモナス細胞のそれぞれ2つのアリコートを4G SAチューブに移し、遠心分離Resusによって収穫し、氷冷溶解緩衝液の2ミリリットルにペレットを懸濁し、懸濁液を15ミリリットルのFalconチューブに移すために、各Eloquaにそれぞれ溶解緩衝液の追加の1ミリリットルで残りの細胞を収集。50マイクロリットルの25 xプロテアーゼ阻害剤と12.5マイクロリットルの1モル塩化マグネシウム超音波処理サンプルを氷上で20秒4回追加して、完全なセルISISを冷却するために22番目のブレークを行います。

SW 41 TI薄肉チューブに6ミリリットルのショ糖クッションを4つ用意します。細胞溶解物の全量をスクロースクッションに慎重に置きます。溶解、バッファー、遠心分離機でバランスを取り、可溶性タンパク質複合体をメンブレンから分離します。

グラジエントの上部から可溶性タンパク質複合体を4本の15ミリリットルのファルコンチューブに移します。ショ糖クッションの一部を移さないように注意してください。次に、各サンプルに10%Triton X 100を最終濃度0.5%に添加し、慎重に混合し、溶解バッファーを総容量7ミリリットルまで加えます。

SDSページおよび免疫血液分析用。各可溶性細胞抽出物70マイクロリットルを新鮮な1.5ミリリットルのコニカルチューブに置き、70マイクロリットルの2つのXSDSサンプルバッファーを追加します。次に、SW 41 TI 薄肉チューブからショ糖クッションを廃棄し、各ペレットに 3 ミリリットルの溶解バッファーを追加します。

10%トリットン×100の1ミリリットルを最終濃度2%に加える超音波処理により各ペレットを溶解した後、溶解緩衝液を総容量5ミリリットルまで加えて遠心分離する。前回と同様に、膜タンパク質複合体の上部画分を15ミリリットルのファルコンチューブに採取します。2%トリットン×100を含む溶解バッファーを最終容量7ミリリットルまで加えます。

これらのサンプルの70マイクロリットルをSDSページおよび免疫血液分析に使用します。まず、抗体共役タンパク質を平衡化します。溶解緩衝液を4ミリリットルで洗浄した血清ビーズを8ミリリットルに希釈し、分注します。

TP充満およびTP枯渇窒素14および窒素15標識細胞からの可溶性または膜タンパク質複合体を含む8本の15ミリリットルファルコンチューブのそれぞれに懸濁液1ミリリットルをチューブローラー上で摂氏4度で2時間インキュベートし、タンパク質複合体を遠心分離によりビーズをペレット化し、 プラスチック壁に付着したタンパク質による汚染を防ぐために、ビーズの上に少量の液体を残して、上清を捨てます。サンプルを新鮮な1.5ミリリットルの円錐管に移し、ファルコンチューブに残っているすべてのビーズを収集します。各ボルテックスに0.1%トリットンを含有する溶解緩衝液の別の0.8ミリリットルを加え、穏やかに遠心分離し、残留ビーズを含む緩衝液をeinorチューブに移すためにいくつかの洗浄ステップの後、Gの16倍、100倍、摂氏4度で15秒間サンプルを遠心分離する。

まず、通常のピペットでサンプル上清を取り除きます。次に、50マイクロリットルのハミルトンシリンジで残りの上清を完全に取り除きます。各サンプルに、調製したばかりの溶出バッファー100マイクロリットルを加え、サーモミキサーで800 RPMでインキュベートし、サンプルを16倍、100倍G、摂氏25度で15秒間遠心分離します。

次に、きれいな50マイクロリットルのハミルトン注射器を使用して、各上清を新しいチューブに移します。また、以前のサンプルと同様に50マイクロリットルの溶出バッファーをビーズプロセスに追加し、それぞれのエラをプールします。SDSページと免疫血液分析のために、すべてのサンプルEITの30マイクロリットルを予約することを忘れないでください。

次に、プラスとマイナスのA TP処理窒素14と窒素15で標識された可溶性および膜タンパク質からの逃れた沈殿物を組み合わせます。次に、添付の原稿に記載されているように、還元アルキル化と初期高尿素消化を行います。回転ホイールで少なくとも16時間トリプティクダイジェストに進みます。

摂氏37度で。トリプシンビーズを16、100倍、摂氏4度で5分間遠心分離してペレット化します。上清を新しい2ミリリットルのeinorチューブに移します。

古いチューブを50マイクロリットルの20ミリモル重炭酸アンモニウム、0.5%酢酸で洗い、最初の上清でプールします。サンプルを脱塩するための自家製のC 18チップを準備するには、シリンジ針でemcor C 18材料から2枚のディスクを切り取り、200マイクロリットルのピペットチップに挿入します。次に、4つの2ミリリットルのeinorチューブの蓋に穴を開け、50マイクロリットルの溶液BでC 18ステージチップをプレコンディショニングし、800Gと25°Cで3分間遠心分離します。

次に、C 18ステージチップを100マイクロリットルの溶液で平衡化し、800Gおよび25°Cで3分間遠心分離します。この平衡化ステップをもう一度繰り返します。C 18ステージチップのトリプティッション消化から100マイクロリットルのサンプル上清をロードし、800Gと25°Cで3分間遠心分離します。

サンプル上清を完全に適用するために、カラムのロードを繰り返します。C 18ステージチップを洗浄した後、トリプシンペプチドを新鮮な1.5ミリリットルのエイノアチューブに溶出し、50マイクロリットルの溶液Bを800 G、25°Cで3分間遠心分離します。elucianステップを一度繰り返してから、ペプチドを速度VACレウスで乾燥させて完成させます。

乾燥ペプチドを溶液Aの20マイクロリットルに懸濁し、氷上で少なくとも1時間インキュベートし、15分間の超音波浴遠心分離機で20分間16、100倍G、摂氏4度で2回のインキュベーションで中断し、SennaをナノC-M-S-M-S HSP 70に適用します。熱ショックタンパク質は、これらの窒素14標識細胞抽出物hs、P、70、B、およびCGEにTPがない場合にのみ、特定のcosシャペロンおよび基質と相互作用することが知られています。これらは、A TP状態とは無関係に、ほぼ独占的に可溶性画分に局在しています。対照的に、CF 1つのベータは、可溶性画分と膜富化画分の両方に局在しています。

超音波処理は、TP合成に位置する膜からCFの一部を1ベータにせん断するので、それは両方の画分のローディング制御として機能します。同量のH HSP 70 Bを、窒素14および窒素15標識可溶性抽出物からの抗HSP 70 B抗体とともに、A TP状態とは無関係に沈殿させた。対照的に、TPが枯渇した膜画分に由来するわずかに多い量で、膜画分から沈殿したHS P 70 Bタンパク質の低レベルは、TPが充満した画分と比較して、CGE Eの親和性がhsに対して期待されました。

P 70 B はコンテキストに依存します。HS P 70 B.In TP 充分可溶性または膜画分と共沈した CGE はありませんでした。TP枯渇した可溶性画分およびTP枯渇膜画分からHS P 70 Bで共沈したCGE 1タンパク質の量は、沈殿したHSP 70 Bの量と定量的に相関します。

この実験では、TPを欠く窒素14標識抽出物と窒素、A TPを含有する15標識抽出物の混合物に対して沈殿物を調製した。HS P 70 B ペプチドの重標識型と軽度標識型は同じ強度で検出されましたが、A TP 枯渇抽出物からは、CGE One ペプチドの光標識型のみが検出されました。ここでは、相互に標識された可溶性細胞抽出物の混合物に由来する抗 HS P 70 D DB 沈殿物由来の同じペプチドを示します。したがって、TP枯渇抽出物中のCGE oneペプチドの重標識型のみが検出され、軽度および重度標識HSP 70 Bペプチドの両方も検出されました。

このビデオを見た後、質量分析のためのサンプル調製によるカウン沈殿実験の実施方法について良い印象を持っているはずです。ヒトタンパク質、特にケラチンによる汚染は、質量分析計でのプロフィ測定を妨げるため、この手順を実行する際には、手袋、清潔な環境、LCMSグレード領域などの安全対策が重要であることを忘れないでください。