に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する C.エレガンス

次の実験では、連続流法を用いて低酸素チャンバーを設置・維持することを目的としています。これは、手順に必要なチューブ、フラスコ、およびチャンバーを入手し、製造することによって達成されます。2番目のステップとして、酸素ボンベを接続し、流量を選択して、目的のレベルの低酸素状態を作成します。

脱イオン水で満たされたバブルフラスコにガスを通して、ガスを水和させます。水和ガスを低酸素チャンバーに接続し、テストサンプルをチャンバーに入れて低酸素条件にさらします。成人期までの生存率の観察に基づいて、低酸素症におけるHi F1依存性の胚致死を示す結果が得られました。

グローブボックスなどの既存の方法と比較した場合のこの技術の主な利点は、実験室での製造が簡単で安価であり、環境チャンバー内のガスの正確で再現性のある濃度を提供することです。この方法は、線虫Cエレガンスの低酸素応答に関する洞察を提供しますが、より大きなモデル生物や細胞培養などの他のシステムにも適応できます。さらに、二酸化炭素や硫化水素などの他のガスの研究にも使用できます。

このプロトコルは、低酸素チャンバーの構築方法を示しています。ガスは、酸素濃度が定義された圧縮ガスタンクに貯蔵され、2段のレギュレーターが取り付けられています。ガスはフローチューブの底部に入り、正しい流量で上部から出ます。

その後、ガスはバブルフラスコに流れ込み、ガスを水和します。その後、ハイドロガスは流入バルブの低酸素チャンバーに入り、サンプルを低酸素にさらします。ガスは最終的に、チャンバーに開けられた排気穴から部屋に排出されます。

Pyrexの結晶化皿または矢のパックボックスは、環境チャンバーの本体として使用できます。容器の容量は最小限に抑え、材料はガスを通さないものでなければなりません。コンテナの片側にカーボンまたはダイヤモンドの先端で穴を開け、プラスチック製のホースバーブフィッティングでドリルして取り付けます。

エポキシを混ぜてから、ボックスとフィッティングに塗布してください。次に、コンテナの反対側で同じ手順を繰り返し、2番目の穴を最初の穴からオフセットします。乱流混合を増やすには、1つの8分の1インチ外径、FEP、またはナイロンチューブを使用して、圧縮ガスタンクをマスフローコントローラーやローターメーターなどのフロー制御デバイスに接続します。

ガスタンクは、酸素含有量または無酸素状態の認定基準である窒素とバランスの取れた酸素濃度を定義する必要があります。純粋な窒素は、2段目のレギュレーターを使用し、2段目を希望の圧力に設定します。適切な流量を選択するには、書面によるプロトコルの指示を参照してください。

次に、2段レギュレーターからのチューブを、チャンバーに入るガスの流量を制御するフローチューブに接続します。フローチューブの出口は、蒸留水が入ったフリットシリンダー付きのガスウォッシュボトルに接続されています。次に、ウォッシュボトルの反対側にあるチューブを環境チャンバーのフィッティングの1つに接続します。

これにより、環境チャンバーに入るガスが水和します。真空グリースを使用してチャンバーを密閉します。次に、チャンバーの蓋に重りを置き、気密シールを確保します。

手のひらに少量の水を持ち、チャンバーのガス排気フィッティングに当ててシールをテストし、気泡がないか確認します。まず、海のエルガンの同期した個体群を生成します。1〜100GRの成虫をアルカリ性漂白剤溶液の滴に、播種していない線虫成長培地プレートの表面に置きます。

漂白剤溶液がプレートに吸収されるのを待ちます 少なくとも8時間のインキュベーション期間後。同期したL oneの幼虫を、生きたOP 50バクテリアを播種したプレートに移します。あるいは、GRAの成虫をプレートに2〜3時間産ませて、同期して成長するワームのグループを生成するか、混合集団からL個の幼虫を選んで若い胚を収集します。

2〜4細胞の段階では、かみそりの刃を使用してGR成虫を少量の水で切り刻み、次にマウスピペットで胚を移してから、ワームをプレートに移して低酸素状態にさらします。プレートの端の周りにエタノールに1ミリグラム/ミリグラムのパルミチン酸のリングを置きます。ワームが寒天プレートの表面から逃げるのを防ぐため。

パルミチン酸は溶液から出てきます。エタノールが蒸発して物理的なバリアを形成して均一性を確保するため、環境チャンバーで暴露する前に、必ずガス洗浄ボトル内の水を交換してください。ワームをプレートに移した後、プレートを環境チャンバーに密封し、ガスの流れを開始し、アッセイに必要な時間曝露を維持します。

胚が成体になるまで生存率を上げるためには、線虫が室内の空気に戻ってから48時間後に発達するのを待ちます。第4段階の幼虫または1日の成虫は、成虫期までの生存率についてスコアを付けます。線虫が低酸素曝露を引き起こすことを視覚化するには、線虫を22ミリメートル四方のカバースリップ上のM nineの滴に移し、必要に応じてM nineの2%arosのパッドに反転させます。

25ミリモルのアモールまたは10ミリモルのアジ化ナトリウムを麻酔薬として使用できます。あるいは、低酸素症に曝露した後、透明な環境チャンバーを解剖スコープのステージに直接配置することができます。2つのビューが表示され、1つはガスフロー設定全体を含むものです。

もう1つは、顕微鏡ステージ上のチャンバーだけです。ブリストルNの2つのワームを4つの10センチメートルの高さの成長プレートで育て、ワームの大部分がGR成虫になるまで育てます。ワームを1〜5個のアルカリ性漂白剤溶液で15ミリリットルの円錐形チューブに洗浄し、ワームが溶解し始めるまで回転させてインキュベートします。

5分以内。Mナインが1、500倍のGでスピンダウンしてワームを3回洗浄し、各洗浄の間にプレートを壊さないようにします。漂白された胚を8つの150ミリメートルNGMプレートに載せ、胚が約48時間L個の幼虫に成長するのを待ちます。

摂氏22度で、プレートを環境チャンバーに移動し、4時間または実験計画で指定された時間、低酸素および無酸素条件にさらします。サンプルを採取するには、低酸素チャンバーの蓋をすばやく取り外します。サンプルプレートを1枚取り、チャンバー時間を再シールし、ステップを記録します。

低酸素症からワームを取り除いた後、このプロセス全体は2分未満で完了します。ディス蒸留水を使用してワームをナイロンフィルターに洗浄し、100マイクロリットルの1%SDS遠心分離機を含むラベル付きの15ミリリットルの円錐管に注ぎます。デスクトップ遠心分離機のSDSのワームは、15〜20秒間でGの1,500倍です。

ブレークする場合は、真空を使用してチューブからほとんどのサピネートを取り除き、ワームペレットをそのままにします。ピペットを使用して、あらかじめ決められた量の液体を含むウォームペレットを標識された1.5マイクロゴミチューブに移します。サンプルをSDSページに使用する場合、このチューブには、タンパク質ローディング染料の2倍の等量をチューブに含み、チューブを密封し、液体窒素に浸すことができます。

すべてのサンプルが分離されるまで繰り返します。一貫性のサンプルは摂氏マイナス20度で保存することができる一貫性のための家の空気制御サンプルのためのこれらの手順に従ってください。この図は、1000ppmの酸素、5, 000ppmの酸素、および約210, 000ppmの酸素に曝露された胚の生存率を示しています。

胚は、連続流酸素チャンバー内で24時間各条件に曝露されます。線虫を正常酸素状態に移し、48時間成体になるまで発育させた後、成体になるまでの生存率を採点しました。この手順に続いて、ウェスタンブロットQPCRまたは寿命や子孫生産などの生理学的アッセイによるその後の分析のためにサンプルを収集できます。

このビデオを見れば、自分の研究室で連続フロー低酸素チャンバーを設定する方法がよくわかるはずです。