Name: に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する C.エレガンス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学ぶ連続流動式低酸素チャンバーの構築法。C. elegansを用いて低酸素環境下での胚致死性や生存率変化を観察し、神経科学や発生生物学における酸素応答メカニズムの解明に貢献する実験システムです。

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我々は議論や原稿の重要な読書のためにミラーラボのメンバーに感謝。この作品は、DLMとDLMの健康賞R00 AG030550の国立研究所に老化の基礎生物学の優秀なネイサンショックセンターからの新しい奨励賞によってサポートされていました。

1。環境チャンバーの建設<ol><li>プロジェクトのスコープのために必要な室の中で最小の合理的なボリュームを選択します。チャンバーは、ガス（O 2）不浸透性材料で作られている必要があります。パイレックスの結晶皿、Anaeropackボックス、または大規模なキャストアクリルボックス（Ellardインスツルメンテーション）は、使用することができます。我々は、9 50 mmプレートは100×50 Kimex結晶皿に収まることを発見した。ガラス板は、パイレックスの結晶皿の蓋として使用することができます。 </li><li>選択されたチャンバ内に穴を開けるとホースバーブフィッティング（コールパーマー）にルアープラスチック男性と合う。継手は、管継手、またはエポキシ樹脂で固定することができます。ガス室からの流れとすることを可能にするために容器の反対側に同様のフィッティングをインストールします。可能であれば、乱流混合を高めるために穴をオフセット。 </li><li> O 2、COのための標準を認定されて定義されているO 2濃度（N 2とのバランス）を使って圧縮ガスタンクを取得します。ntentまたは、酸素欠乏状態のために、（&lt;10 ppmのO 2）2 N純粋。チャンバ内の酸素濃度を中断することを避けるために自動スイッチオーバーの長期的研究のためのレギュレータを使用してください。 </li><li>低酸素に生物体の応答は温度依存性15であることが示されている。インキュベーターに室を配置することによって、様々な温度を維持することができる。インキュベータ内の温度が不均一となどかもしれないが、それは常にチャンバー内の温度を測定する温度データロガーを利用することが賢明です。 </li></ol> 2。環境室にガスを接続する<ol><li>すべての接続の場合は、スナップコネクタまたは圧縮継手のどちらかによって接続さ8分の1インチの外径のチューブを使用しています。チューブは、フッ素化エチレンプロピレン（FEP）またはナイロン（コールパーマー）として、O 2の不浸透性及び非反応性でなければなりません。完了したセットアップの概略については、 図1を参照してください。 </li><li> COMを接続するこのような質量流量コントローラ（シエラ·インスツルメンツ）またはロタメーター（オールボ​​ー）として、流量制御装置へのガスのタンクを押した。タンクから上流圧力、フローデバイスの範囲とホースバーブ継手内にあることを確認してください。二段階のレギュレータは、一般的に所望の圧力に設定して第二段階で使用され、[適切な流量を選択するためのセクション3を見る] </li><li> （ 図1を参照）の排気のためのオープン第2嵌合を残して、その後ガスを使用して蒸留水を介してバブリングによるガスフリットシリンダーでボトルを洗浄し、環境室の継手のうちのいずれかに直接水和物。短期試験では、ガスの水和は、プレートdessicationに対する保護が、湿度のモニタリングは、長期的な研究のために必要となる場合があります。 </li><li>ダウコーニングの真空用グリースは、チャンバを密閉するために使用することができます。気密シールを確保するため、チャンバーの蓋に重みを置きます。密封し、適切な流量を確認するには、yの手のひらに少量の水のプールを保持する私たちの手袋をしたチャンバーでアウトフィッティングに手や気泡を確認してください。 </li></ol> 3。フローレートを選択する<ol><li>完全混合を仮定し、気体の大気の90％のガス交換するたびに、チャンバの容積が（フィックの法則）に置き換えられますがあります。たとえば、100 cc /分の流量で100ccのチャンバー内に、チャンバー内の元の家の空気は、1分後に所望のガスの90％に置き換えられますし、漸近的に90パーセント分ごとにすることで、完全な交換に近づきますその後。 </li><li>高流量と小型コンテナは、より迅速に、ご希望の酸素濃度に到達します。 100×50 Kimexコンテナ（400 cc）で、120 cc /分の流量は10分（3取引所）で99.9％の交換に到達します。この流量は、ほとんどの酸素条件に適しています。我々の知識にO 2濃度の変化率は、Cの応答をどのように影響するかを系統的に調査がされていませんエレガンス 。 </li></ol><ol><li>低酸素状態にさらされたワームは、一般に寒天プレートの表面をエスケープします。これを防ぐために、プレートの縁の周りにパルミチン酸（エタノールでは10 mg / ml）のリングを配置します。パルミチン酸は、物理的なバリアを形成し、エタノールを蒸発させた溶液から出てくるでしょう。パルミチン酸の障壁は 、C言語の産卵率、産卵数や寿命に影響を与えません虫 16,17。穴掘りは、低酸素条件下でより頻繁に発生しないので、追加の予防措置は、一般的に必要ありません。 </li><li><ol><li>非シード線虫の成長培地（NGM）プレート18上にアルカリ性漂白溶液の小滴に妊娠大人の漂白によって同期集団を生成します。標準的な大規模バッチの次亜塩素酸漂白プロトコルとは対照的に、NGMプレートの表面に漂白剤溶液の液滴で1から100の動物を選択し、漂白剤溶液をプレートに吸収することができます<suP&gt; 18。少なくとも12時間後に、ライブOP50細菌を接種したプレートに同期したL1幼虫を転送します。また、1は、同期の開発または混合集団からL4幼虫を選ぶでしょうワームのグループを生成するために妊娠大人が2-3時間プレート上に卵を産むようにすることができます。 </li><li>これは生存率13を減らすことができるように、低酸素に漂白された胚を露出させることは避けてください。若い胚（2-4セル）を収集するために、妊娠、大人の酸素への後続の露出のために口のピペットでプレートに移動したかみそりの刃と胚の水の少量のみじん切りにすることができます。 </li></ol></li><li>環境チャンバー内でプレートをシールします。対照動物は、治療のワームと同じ温度で正常酸素（空気の家）に保持する必要があります。家の空気中に放置サンプルと家の空気がその上を流れると同一の​​チャンバー内に維持、それらの間に観察可能な違いはありません。ガスフローを開始し、希望の時間のために露出を維持しています。ランプの均一性を確保するため、必ず曝露前のガス洗浄瓶に水を交換してください。 </li><li>胚のアッセイの生存に、ワームは、室内の空気に復帰した後48時間開発することができ、彼らは1つ大人4段目の幼虫/日でなければなりませんその時点で。生存、検閲を占めていることはできませんいずれかのワームのスコア。 </li><li> 、低酸素に暴露した動物を視覚化する22ミリメートル2カバースリップ上でM9のドロップにワームを移動し、M9 18に、2％アガロースのパッド上に反転します。必要な場合は、レバミゾール（25 mm）またはアジ化ナトリウム（10 mM）を麻酔薬として使用することができます。アジ化ナトリウムとレバミゾールは、毒性のためにいくつかの観測を混乱させる可能性があり、慎重に19を使用する必要があります。 </li></ol> 5。低酸素に暴露されたワームの急速な収穫（例：HIF-1ウェスタン分析用サンプルの調製） 多くの低酸素誘導効果はすぐに卵の生産12、有糸分裂エピトープのリン酸化の再開など、室内の空気に戻った時に逆になっている胚13とHIF-1タンパク質の分解9,20インチ低酸素状態にさらされる動物の急速な分離は、これらの条件で再現性の効果を得るために必要とされています。 2分未満で、このセットアップでは、動物を収穫することができ、液体窒素で凍結。グローブボックスの低酸素室は無酸素条件下での試料の操作を可能にする一方で、無酸素以外の条件のために、コストと実用性は、その有用性を制限します。 <ol><li>ワームの大半は18歳妊娠成人になるまで4〜10センチの高成長（HG）プレート上にブリストルN2ワームを育てています。ワームは5分9以上ではなく、溶解し始めるまで回転で1:5アルカリ性漂白溶液とインキュベートを含む15 mLコニカルチューブにワームを洗ってください。ブレーキなしで各洗浄の間に1500 xgでスピンダウンし、M9とワームを3回洗浄します。 </li><li> 8 150 mmのNGMプレート上にプレートを漂白した胚およびL4幼虫（22時ブリストルN2の〜48時間°C）に発展することができます。環境チャンバーにプレートを移動し、4時間の低酸素（1,000 ppmで、5,000 ppm）と酸素（N2）の条件に公開します。露光時間は、実験デザインに応じて異なります。低酸素への曝露が産卵率に直接的な影響を持っていますが、2細胞期胚では、暴露12の16から18時間後に死亡しています。この低酸素室での設定は、曝露の下限は平衡に達するために必要な雰囲気の為替レートによって制限されます。 </li><li>ラベル1 1.5mlマイクロチューブと各実験サンプルの1つの15 mLコニカルチューブ。低酸素状態にさらされたワームは、収穫時のチューブの側面に付着する可能性が高くなります。これを防ぐために、場所ごとに15 mLのコニカルチューブに1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の100μL。 SDSは、下流のアプリケーションを阻害する場合、（BSA）ウシ血清アルブミンは、付着を防止するために使用することができます。 SDSまたはBSAの日常的な使用が明らかに違いを持っ​​ていないようです。 2倍のタンパク質をローディング色素（4％SDS、10％2 - メルカプトエタノールと50μlを加える1.5mlマイクロチューブに30％グリセロール（w / v）の）のブロモフェノールブルーのトレース。液体窒素デュワーの準備ができている。 </li><li>低酸素症およびレコードからワームを除去した後、時間ステップを。 、低酸素室に蓋を取り外しつのサンプルプレートを取得し、チャンバーを封印。 15 mLのコニカルチューブに注ぎ、次にナイロンフィルター上にワームを洗浄し、蒸留水を使用しています。ブレーキ付15〜20秒の場合は1500×gで遠心分離し、デスクトップにワームをスピンダウンします。 </li><li>手付かずのワームペレットを残して、チューブから上清の大部分を削除するには、真空を使用しています。 </li><li>ピペットを用いて、1.5mlマイクロチューブに50μLのワームペレットを移動します。液体窒素中でチューブと浸漬をシールします。 </li><li>すべてのサンプルが分離されているまで繰り返します。一貫性を保つために家の空気のコントロールサンプルのためにこれらの手順に従ってください。サンプルは-20℃で保存することができます</li></ol> 6。代表的な結果低酸素症の生物体の効果を見ることができますCの成人に可能性を調べることによって、 線虫 （ 図2）。野生型ブリストル（N2）とHIF-1（ia04）の欠失変異体によって築かれた胚は、すべての家エアO 2濃度（210,000 ppmのO 2）の中で生き残るされています。 HIF-1胚が実行可能ではないながら、N 2のワームは、5,000 ppmのO 2の成人に適応し、生き残ることができます。これは、HIF-1は、環境10で利用可能な酸素レベルの変化に適応するために不可欠であることを示している。いずれもN2もHIF-1の動物は、1,000 ppmのO 2への暴露に耐えることができます。 低酸素に直接ワームを視覚化することは解剖の範囲と透明容器（ 図3）の使用で可能である。直接解剖スコープの低酸素室を配置することによって、生物体の反応を観察するために低酸素状態からワームを削除する必要はありません。範囲は（ 図3のように蛍光illumationを取り付けることができます。 </stronG&gt;）、さらに可能な低酸素状態の観測値の型を拡張する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> 図1。低酸素室の一例。ガス流の方向が矢印で示されています。ガスが定義されているO 2濃度（1）と2つの段階のレギュレータに圧縮ガスタンクに格納されている（2）接続されています。ガスは、適切な流量でトップを終了し、フローチューブの底に（3）に入ります。ガスは、ガス（気泡を観察することによって、バブルフラスコの正しい接続を確保するため）水和、バブルフラスコ（4）に流れ込みます。和ガスは、低酸素症にサンプルを公開し、流入弁（5）で低酸素室に渡します。チャンバー内で掘削し、排気孔を介して部屋にガスがようやく口。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> 図2。 1,000 ppmのO 2にさらされた胚の生存率、5,000 ppmのO <sub&gt; 2と正常酸素（〜210,000 ppmのO 2）。胚は連続フロー酸素室で24時間の胚のように各酸素状態にさらされた。 ワームは、正常酸素条件に移動し48時間大人に開発することができ、その後成人期への生存率を評価した。 N&gt; 50、N = 5。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> 図3。 C.の可視化顕微鏡による低酸素状態でエレガンス 。ワームは、概説の方法を用いて低酸素状態にさらされています。透明な環境室（パイレックス結晶皿とガラス板で構成）解剖範囲のステージ上に直接配置されています。 2つのビューは、全体のガスの流れを含むいずれかの顕微鏡のステージ上だけチャンバと、他のを設定し、表示されます。

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利害の衝突が宣言されません。

このメソッドは、実験室で維持される酸素の正確な濃度の環境を可能にする低酸素環境を構築するための戦略を提示します。これらのチャンバは、O 2、特定の低濃度に生物を暴露し、分子および生理学の出力を監視するための簡単な方法を提供しています。説明した環境室は、ラボの代わりに市販品を購入することによって作成されたため、実験のニーズに合わせて変更することができます。 この方法の一つの明確な利点は、連続フロー設計になっています。これは通常、外部のO 2濃度がはるかに高い場合（室内空気21万ppmのO 2）チャンバー内でO 2の低濃度を維持することで発生する困難を排除します。代わりに、低酸素環境は、密閉チャンバ内で維持されているストップトフロー法である。検出が困難になる可能性が少しでも漏れ、プリストップトフロー法を用いて低酸素状態の維持を発散。圧縮空気タンク内の定義されている酸素濃度の連続フロー法継続的に交流室内の空気と低酸素状態を中断することから、リークを防ぎ正圧を維持しています。 <p class=...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>チューブ（FEPとPTFE） </td><td>コー​​ルパーマー タイゴン</td><td> YO-95821から00（1/8 &quot;FEP） 06605から27（1/16×1/8 &quot;PTFE） &#39;R-3603 </td></tr><tr><td>コンプレッション·フィッティング</td><td>シアトル流体システム</td><td> 06363から58（Mカプラー1/16 &quot;） 06363から62（F.カプラ1/16 &quot;） 06363から60（Mカプラー1/8 &quot;） 06363から61（F.カプラ1/8 &quot;） </td></tr><tr><td>流管</td><td>オールボルグ</td><td> PMR3-010073（3出力） PMR1-013520（1出力） </td></tr><tr><td>マスフローコントローラ</td><td>シエラ·インスツルメンツ</td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1（マスTrakの） C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10（スマートTrakの2） </td></tr><tr><td>圧縮ガスタンク</td><td> Airgasの</td><td>オーダーメイド&lt;/ TD&gt; </tr><tr><td>ホースバーブフィッティングにルアープラスチック男性</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> 45505から41（500シリーズ1/16 &quot;） </td></tr><tr><td>アクリルボックスをキャスト</td><td> Ellard装</td><td>オーダーメイド</td></tr><tr><td>管継手（黄銅またはステンレス鋼） </td><td>シアトル流体システム</td><td> B-402-1（1/4 &quot;ナット） B-200-3（1/8 &quot;ユニオンティー） B-400セット（1/4 &quot;フェルール） B-QM2-B1-200（QMボディQC） B-200-1-2（1/8×1/8 &quot;オスCONN） </td></tr><tr><td>ダウコーニングの真空用グリース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> AnaeroPackボックス</td><td> Misubishiガス·ケミカル·カンパニー</td><td> R684004（0.4リットル） R685025（2.5リットル） R685070（7.0リットル） </td></tr><tr><td>パイレックスガス洗浄瓶</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> CLS31770500C（500 mL）を CLS31770250C（250 mL）を CLS31770125C（125 mL）を&lt;/ TD&gt; </tr><tr><td>パルミチン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P0500 </td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ</td><td>サザンバイオテクノロジーアソシエイツ</td><td> 1032年から1005年</td></tr><tr><td> SuperSignal西ピコChemiluminsecent基板</td><td>ピアスケミカル</td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100×50ガラスの結晶皿</td><td> Kimaxキンブル</td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する<em&gt; c.エレガンス</em

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

酸素は、既知の例外の1つ1で、すべての後生動物が生き残るために不可欠である。減少したO 2可用性（低酸素）は、環境条件2-5の病気、通常の開発や変更の状態の間に発生する可能性があります。低酸素への応答に関与する細胞内シグナル伝達経路を理解することが脳卒中からがんまで、多様な人間の病態の治療戦略に新たな洞察を提供することができます。この目標は、遺伝的影響を受けやすいモデル生物で制御された低酸素曝露に伴う技術的困難により、少なくとも部分的に妨げられてきた。 線虫 Caenorhabditis elegans は、理想的にはそれが文 ​​化に容易であり、遺伝的操作として、低酸素応答の研究のためのモデル生物として適しています。また、C.以降の交絡影響を及ぼすことなく特定の酸素O 2濃度に対する細胞応答を研究することが可能ですelegansは O 2を得る（容易に呼吸器系6とは対照的に、拡散による）ガスや他の。低酸素に対する応答に関与することが知られている要因は、Cで保存されているエレガンス 。低酸素状態への実際の応答が可能ですO 2の特定の濃度に依存する。 C.でelegansは 、低酸素症を緩和するための露出がHIF-1によって主として媒介転写応答を誘発する、高度に保存され低酸素誘導転写因子6-9。C。elegansの初期胚では、O 2 7,10 5,000-20,000 ppmで生き残るためにはHIF-1を必要とする。低酸素状態は&quot;通常のO 2未満&quot;のための一般的な用語です。正常酸素（通常のO 2）も定義することが困難な場合があります。我々は一般的に正常酸素であることが21万ppmのO 2であり、室内の空気を、検討してください。しかし、それは示されているC. elegansは 5から12パーセントからO 2濃度（50,000-120,000 ppmのO 2）11の行動の優先順位を持っています。 lのarvaeと大人、5,000 ppmのO 2 12に低酸素誘導休眠を防止するために、HIF-1として機能します。しかし、HIF-1は、O 2の低濃度（酸素欠乏、操作的定義&lt;10 ppmのO 2）13に対応して役割を果たしていない。無酸素症、Cの虫はすべて微視的に観察活動が10を停止した仮死状態の可逆的な状態に入る。異なる生理的応答は、さまざまな条件で発生するという事実は、O 2の酸素濃度以上の実験的なコントロールを持つことの重要性を強調しています。 ここでは、O 2の濃度と定義された信頼性と再現性の低酸素状態を作り出す環境槽の建設と実施のための手法を提案する。継続的なフロー法は、チャンバーの急速な平衡を保証し、システムの安定性を向上させます。さらに、透明性とチャンバーのアクセシビリティは、低酸素状態にさらされる動物の直接可視化を可能にします。我々はさらにCを収穫する効果的な方法を実証虫のサンプル急速に低酸素に曝露した後、これは低酸素症10,14で発生し、急速に逆の変化の多くを観察する必要があります。このメソッドは、簡単に別のモデルシステムとガスの多様など、個々の研究室のニーズに合わせて修正することができる基本的な基盤を提供します。

Oの定義された濃度の雰囲気を生成するために、連続フロー酸素チャンバーを使用する方法を本論文の詳細<sub&gt; 2</sub&gt;生物学的応答を理解するためにOを減少する<sub&gt; 2</sub&gt;。このシステムは、セットアップと保守が容易で、Oの広い範囲に合わせて十分な柔軟性があり<sub&gt; 2</sub&gt;濃度とモデルシステム

に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する<em&gt; C.エレガンス</em

酸素は、1つの既知の例外を除いて、すべての後生動物が生きていくために不可欠である1。酸素供給の低下（低酸素状態）は、疾患状態で起こり得るとともに、...

本実験の目的は、連続フロー法を用いて低酸素チャンバーを設置し、維持することです。これは、手順に必要なチューブ、フラスコ、およびチャンバーを入手し、作製することで達成されます。次に、酸素タンクを接続し、流量を選択して目的の低酸素レベルを作り出します。脱イオン水を満たしたバブリングフラスコにガスを通過させ、ガスを加湿します。加湿したガスを低酸素チャンバーに接続し、試験サンプルをチャンバーに入れて低酸素条件下に曝露させます。成体までの生存率を観察することにより、低酸素下におけるHi F1依存的な胚致死の結果が得られます。グローブボックスなどの既存の手法と比較した本技術の主な利点は、研究室で容易かつ安価に作製でき、環境チャンバー内のガス濃度を正確かつ再現性高く制御できることです。この手法は線虫 C elegance における低酸素応答の解明に有用ですが、より大型のモデル生物や細胞培養を含む他の系にも応用可能です。さらに、二酸化炭素や硫化水素などの他のガスを用いた研究にも利用できます。本プロトコルでは、低酸素チャンバーの構築方法について解説します。ガスは酸素濃度が規定された圧縮ガスボンベに貯蔵され、2段式レギュレーターが取り付けられています。ガスはフローチューブの底部から導入され、適切な流量で上部から排出されます。その後、ガスはバブルフラスコに流れ込み、ガスが加湿されます。加湿されたガスは流入バルブを通って低酸素チャンバーに入り、サンプルを低酸素状態にさらします。最終的にガスは、チャンバーに開けられた排気孔を通じて室内に放出されます。環境チャンバーの本体として、Pyrex製結晶化皿またはアローパックボックスを使用できます。容器の容量は最小限に抑え、材質はガス不透過性である必要があります。容器の側面にカーボンまたはダイヤモンドチップドリルで穴を開け、プラスチック製のホースバーブフィッティングを取り付けます。ボックスおよびフィッティングに塗布する前に、エポキシ樹脂を混合します。次に、容器の反対側で同様の手順を繰り返し、1つ目の穴からオフセットした位置に2つ目の穴を開けます。乱流混合を高めるには、外径1/8インチのFEPまたはナイロンチューブを使用して、圧縮ガスボンベをマスフローコントローラやロトメータなどの流量制御装置に接続してください。ガスボンベは、酸素含有量の認定標準物質または無酸素条件に基づいた、窒素でバランス調整済みの規定の酸素濃度である必要があります。純窒素を使用する場合は、2段式レギュレーターを使用し、2段目を希望の圧力に設定してください。適切な流量の選択については、書面によるプロトコルの指示を参照してください。次に、2段式レギュレーターからのチューブを、チャンバーに導入されるガスの流量を制御するフローチューブに接続します。フローチューブの出口は、蒸留水を入れたフリット付きシリンダーを備えたガス洗浄ボトルに接続します。その後、洗浄ボトルの反対側のチューブを環境チャンバーのフィッティングのいずれかに接続します。これにより、環境チャンバーに導入されるガスが加湿されます。真空グリースを使用してチャンバーを密閉してください。その後、チャンバーの蓋に重りを置き、気密性を確保します。手袋を着用した手のひらに少量の水を溜め、チャンバーのガス排気口に当てて気泡が発生しないかを確認し、密閉性をテストします。まず、同期させた海生Elganの個体群を作製します。1〜100匹のGR成体を、播種していない線虫増殖培地プレートの表面にあるアルカリ性漂白剤溶液の一滴の中に配置します。少なくとも8時間のインキュベーション後、漂白溶液をプレートに吸収させます。同期化したL1幼虫を、生きたOP 50細菌を播種したプレートに移します。あるいは、GRA成虫をプレート上で2～3時間産卵させ、同期的に発生する個体群を形成させるか、混在した個体群からL4幼虫をピックアップして若い胚を回収します。2～4細胞期に、少量の水中でカミソリの刃を用いてGR成虫を細断し、マウスピペットで胚を回収した後、低酸素条件にさらすためにプレートにワームを移します。プレートの縁に10 mg/mLのパルミチン酸エタノール溶液をリング状に塗布します。これは、ワームがアガープレートの表面から脱出するのを防ぐためです。パルミチン酸が溶液から析出します。エタノールが蒸発して均一性を確保するための物理的なバリアを形成させるため、環境チャンバーに設置する前にガス洗浄瓶の水を必ず交換してください。虫をプレートに移した後、プレートを環境チャンバー内で密封し、ガスの流量を開始して、アッセイに必要な時間だけ曝露を維持します。胚から成体までの生存率を確認するため、室温の空気に戻した後、線虫を48時間育成させます。この時点で線虫は第4段階幼虫または成体1日目となっているはずであり、成体までの生存率を算出します。低酸素曝露を受けた線虫を可視化するには、線虫を22 mm四方のカバーガラス上のM9緩衝液の一滴に移動させ、必要に応じてM9緩衝液中の2%アガロースパッドの上に反転させて置きます。麻酔剤として、25 millimolarのamolまたは10 millimolarのアジ化ナトリウムを使用できます。あるいは、低酸素状態にさらした後、透明な環境チャンバーを解剖顕微鏡のステージに直接置くことも可能です。ここでは2つの視点を示しており、1つはガスフロー装置全体を含んでいます。もう一方は、顕微鏡ステージ上にチャンバーのみを置いた状態にします。Bristol N2系統の線虫を10 cmの高成長プレート4枚で、大半の線虫がGR成体になるまで培養します。線虫を1:5のアルカリ性漂白剤溶液で15 mLコニカルチューブに洗い出し、線虫が溶解し始めるまで回転させながらインキュベートします。5分以内で行ってください。M9バッファーで線虫を3回洗浄し、各洗浄の間に1,500 ×gで遠心分離します。この際、プレートを振らないようにしてください。漂白した胚を8枚の150 mm NGMプレートに分配し、約48時間かけて胚をL4幼虫まで成長させます。22 °Cで、プレートを環境チャンバーに移動させ、低酸素または無酸素条件下に4時間、あるいは実験計画で指定された時間だけ曝露させます。サンプルを回収するには、低酸素チャンバーの蓋を素早く取り除きます。サンプルプレートを1枚取り出し、速やかにチャンバーを再密封して、その手順を記録してください。低酸素状態から線虫を取り出した後、この一連の工程は2分以内に完了させる必要があります。蒸留水を用いて線虫をナイロンフィルター上に洗浄し、1% SDS 100 µLを入れたラベル付きの15 mLコニカルチューブに注ぎます。デスクトップ遠心機を用い、SDS中の線虫を1,500 ×gで15～20秒間遠心分離します。吸引装置を用いて、チューブから上清の大部分を除去し、線虫ペレットには触れないようにします。ピペットを使用して、規定量の液体とともに線虫ペレットをラベル付きの1.5 µL マイクロチューブに移します。サンプルをSDS-PAGEに使用する場合は、このチューブに2倍濃度のタンパク質ローディングダイと同量の液体を入れ、チューブを密閉して液体窒素に浸します。すべてのサンプルが分離されるまでこの操作を繰り返します。一貫性を保つため、ハウスエアコントロールサンプルについても同様の手順に従ってください。サンプルは-20 °Cで保存可能です。この図は、1000 ppmの酸素、5,000 ppmの酸素、および約210,000 ppmの酸素である常酸素状態に曝露した胚の生存率を示しています。胚を連続フロー酸素チャンバー内で、各条件下に24時間曝露させます。その後、虫を常酸素条件に移して成体になるまで48時間発生させ、成体への生存率をスコアリングします。この手順の後、ウェスタンブロット、QPCR、または寿命や子孫産生などの生理学的アッセイによる後続の解析のためにサンプルを回収することができます。このビデオを視聴することで、ご自身の研究室で連続フロー低酸素チャンバーをどのように構築すればよいか、十分な理解を得ることができるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; Cエレガンス</em&gt;胚

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫の穴を掘る能力とトンネル能力を評価することにより、低酸素症をテストする方法を示しています。この技術を使用すると、研究者は酸素欠乏を経験している幼虫と発達障害のある幼虫を区別することができます。このプロトコル例は、このアッセイのセットアップを示しています。...

ショウジョウバエ穴を掘るおよびトンネリングの試金術:ハエの幼虫のティッシュ低酸素率を評価する方法

プロトコルは、Cで酸素欠乏症/飢餓を使用していますことが記載されている虚血/再灌流をモデル化するエレガンス 。機能的転帰は、死亡率の増加、GFP標識神経突起で見える異常、および神経機能を必要とする障害のある行動反応が含まれています。...

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

線虫は通常、固形寒天プレート上で増殖させ、または液体培養で大腸菌を接種されている大腸菌 。毒物および栄養研究交絡からの細菌の副生成物を防ぐために、我々はダウンストリームのアプリケーションの範囲のためのワームを大量に成長し、同期させるために、無菌液体培地、CeHRを利用した。...

培養線虫（Caenorhabditis elegans）微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

新規メトリックは、線虫の胚伸びを特徴づけるために、<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

我々は、カエルやゼブラフィッシュの胚などの水生生物に使用するための新しい低酸素チャンバーシステムを紹介します。私たちのシステムはシンプルで頑丈で、費用効果が高く、インビボで48時間まで低酸素症の誘導と持続が可能です。低酸素症の有効性をモニターする2つの再現可能な方法を提示する。...

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

プロトコルでは、通常の大気酸素濃度下での低酸素症が発生しているショウジョウバエ幼虫を識別する簡易測定法について説明します。このプロトコルでは、低迷や低成長などの重複する表現型を示す他の変異体と区別される低酸素の幼虫をことができます。...

潜入/トンネル用キイロショウジョウバエ幼虫における低酸素の検出

ミトコンドリアの呼吸は生物の生存にとって重要ですしたがって、酸素消費量は、ミトコンドリアの健康の優れた指標です。このプロトコルでは基底を測定する市販の呼吸の使用を述べるし、最大酸素消費量のライブ、線虫そのまま・自由に運動。...

そのまま線虫の酸素消費量の測定

永続的な化学物質のトランスおよび多世代の影響は、環境と人間の健康に対する長期的な影響を判断する上で不可欠です。我々は、自由に生きている線虫カエノルハブ炎エレガンスを用いて、トランスおよび多世代の効果を研究するための新しい詳細な方法を提供する。...

毒性物質のトランスおよび多世代効果の研究のためのカエナルハブ炎エレガンスの使用

ここでは、線虫C.エレガンスにおける細胞タンパク質毒性ストレス応答を、蛍光転写レポーターの活性化を測定し、生理学的ストレスに対する感受性をアッテルすることによって特徴付ける。...

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

本研究は、C.エレガン複合体I病ガス-1(fc21)ワーム、すなわちZebraLab(中スループットアッセイ)とWormScan(ハイスループットアッセイ)における2つの半自動運動活動分析アプローチのプロトコルを提示し、ネマトデ挙動と統合神経筋機能を定量化するための広範な研究方法の間で比較分析を提供する。...

ミトコンドリア病の ケノハブディティス・エレガンス モデルにおける動物活動量の定量化に関する実験法の比較分析

学ぶ連続流動式低酸素チャンバーの構築法。C. elegansを用いて低酸素環境下での胚致死性や生存率変化を観察し、神経科学や発生生物学における酸素応答メカニズムの解明に貢献する実験システムです。

に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する

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