Name: PDZ-依存性のCFTRの高分子シグナル伝達複合体のin vitroでの解析で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶ CFTR高分子シグナル伝達複合体のin vitro組み立て法。組換えタグ融合タンパク質を細菌で発現・精製し、CFTRと結合タンパク質を組み合わせて複合体を形成する。ウェスタンブロッティングで可視化できる。

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私たちの仕事は、米国心臓協会（グレーター東南アジアアフィリエイト）昭和·助成金の0765185B、エルザU.パーディー財団研究助成金、ウェイン州立大学の学内のスタートアップ資金と血管研究所イシスイニシアティブ賞からの助成金によってサポートされています。 in vitroで CFTRの高分子複合体のアセンブリ内のこのメソッドは、もともと博士AP Naren（テネシー大学ヘルスサイエンスセンター）によって開拓された。

1。細菌における組換えHisタグ融合タンパク質の発現および精製<ol><li> CFTR、LPA 2、MRP2、MRP4、β2 AR、そしてNHERFs（フルレングスまたはPDZ1またはPDZ2ドメインのC-テイル（C末端にPDZモチーフを含む最後の50から100アミノ酸）の定義された領域を増幅するPCR法による）。 </li><li>そのようなMBP-β2 AR CT、MBP-CFTR CTとしてMBP融合タンパク質（詳細については、GST-融合タンパク質のpGEX4T-1ベクター（例えば、GST-NHERFsとして、GST-MRP4 CT）やpMal-C2ベクターにPCR産物をクローニングし）、および彼の-S-融合タンパク質（例えば、彼の-S-CFTR CT、彼の-S-PDZK1など）のpET30。 </li><li>プロテアーゼ欠損E.に変換大腸菌株（BL21-DE3）可能な組換えタンパク質の分解を最小限に抑えます。 </li><li>適切な抗生物質（例えばアンピシリンまたはカナマイシンなど）を含むルリア - ベルターニ培地（pH7.0）に37°Cで一晩培養する。 1:10に一晩培養物を希釈し、37℃でさらに2時間のために育つ℃、で0.5〜1メートル、Mは 30℃で、次の4時間IPTGでduce 8000遠心分離によってペレットは、細胞×gで10分間4℃で</li><li> （50メートルMトリス-HCl、pH8.0で、1メートルM EDTA、1メートルM PMSF、10％ショ糖）がリゾチーム（1 mg / mL）は、0.2％トリトンX-100、およびプロテアーゼを含むショ糖バッファーで細胞を溶解阻害剤。細胞ペレットは、培養液1 Lに由来するための20mLを使用しています。 </li><li> 4℃で30分間ロータリーシェーカーに混ぜる</li><li> 4℃で30分間20,000×gで遠心透明な上清を収集します。 </li><li>透明な上清中には、以下の樹脂/アガロースビーズ（50％ショ糖バッファ内のスラリー）を1 mLを追加します。 <ul><li> GST融合タンパク質のグルタチオンアガロースビーズ。 </li><li>彼の-Sの融合タンパク質のタロンビーズ。 </li><li> MBP融合タンパク質のアミロース樹​​脂。 </li></ul></li><li> 4℃で4時間混合°回転シェーカー上でC。 </li><li> 2マイルのために混合し、1×PBS（15mL）に再懸濁することによりビーズを洗浄2分、および廃棄上清を800×gで回転するN、。 6回のためにこの手順を繰り返します。 </li><li>それぞれの溶出バッファー（ビーズを1mLあたり2 mLの溶出バッファー）を用いて、ビーズからタンパク質を溶出します。 <ul><li> GST融合タンパク質の溶出バッファー：25メートルMのTris-HCl（pH 8.0）で、140メートルM NaCl、および20メートルMは、グルタチオンを減少させた。 </li><li>彼の融合タンパク質の溶出バッファー：20メートルMのTris-HCl（pH 8.0）で、500メートルM NaCl、および200メートルMイミダゾール。 </li><li> MBP融合タンパク質の溶出バッファー：20メートルMのTris-HCl（pH 8.0）で、200メートルMのNaCl、1メートルM EDTA、1メートルM DTT、10 M Mマルトース。 </li></ul></li><li> 4℃（可能なタンパク質の分解を避けるため）での1X PBSを2 Lに対して溶出したタンパク質を透析。 PBSを4回4時間毎に変更します。 -80℃で小分けとしてセントリコンフィルタ（10,000 MWカットオフ、ミリポア）とストアを使用してタンパク質を濃縮℃に</li><li> DETブラッドフォード法によるタンパク質濃度オコジョ。 SDS-PAGEは、標準としてBSAを用いてタンパク質の品質を評価します。タンパク質の整合性が十分でない場合は、そのようなゲルろ過やイオン交換などの二次精製手順を使用することができます。 （例えば、我々はさらにGST-融合タンパク質を精製するためにG-75セファロースカラムを使用している）。 </li></ol> 2。細胞培養と細胞ライセートの調製<ol><li>安定的に過剰発現CFTR-WTおよびCFTR-his10またはBHK細胞の一過性過剰発現フラグ-LPA 2重量またはフラグ-LPA 2ΔSTL、およびMadin-Darbyイヌ腎その文化ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞（MDCK 37℃でポリスチレンフラスコ内で10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むイーグル最小必須培地（MEM）°5％CO 2とCの安定過剰発現MRP2た）細胞である。 </li><li>文化、ヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞が安定的に過剰発現CFTR-WT及びダルベッコのCFTR-his10&#39;、5％CO 2で37℃、10％ウシ胎児血清およびペニシリン/ポリスチレンフラスコ中のストレプトマイシンを補充したの改変イーグル培地（DMEM）。 </li><li> Lysis Bufferで細胞を溶解（PBS -トリトン-X-100は1メートルMのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含むプロテアーゼ阻害剤の混合物を添加した0.2％、1μg/ mLのアプロチニン、1μg/ mLのロイペプチン、1μg/ mLのペプスタチン）の使用各60 mmのペトリ皿、各100 mmのペトリ皿1000μL溶解バッファー500μL溶解バッファー。 </li><li>細胞は℃、4℃で15分間16,000遠心により不溶性物質×gを削除し4℃で20分間ライセートロックブラッドフォードアッセイによりタンパク質濃度を決定します。 </li></ol> 3 CFTR含有高分子複合体の in vitro総会で （CFTR-PDZK1-MRP4） <ol><li>溶解バッファー200μLのPBS（ - 0.2％トリトンX-100 +プロテアーゼ阻害剤）に、20μgの精製したGST-MRP4-C端子を追加する50 AA（CT50）の融合タンパク質。 </li><li>彼の-S-PDZK1融合タンパク質を精製した種々の量（0-40μg）を追加します。 </li><li> 22 1-2°C hのロータリーミキサーの2つのタンパク質を混ぜ合わせます。 </li><li>タンパク質混合物に20μLグルタチオンビーズ（50％スラリー）を追加し、別の1時間ミックスを続けています。この手順は、ペアワイズ結合と呼ばれています。 </li><li>この間、HEK293細胞ライセートを調製する、上記ステップ2で説明したように過剰発現したFlag-CFTR（WT））。 </li><li>溶解緩衝液で2回の複合体を洗ってください。各洗浄のために1分間800×gで遠心し、慎重にそれぞれの洗浄後の上清を吸引除去する。底にビーズを吸うしないように細心の注意を払ってください。 </li><li>ビーズに上記調製したHEK293細胞ライセートを追加し、軽く3時間（または一晩）を4℃で混合します。 </li><li>ステップ3.6）で説明したように溶解緩衝液で広範囲に三回ビーズを洗浄する。 </li><li> 30μLサンプルバッファー（5×）を使用してタンパク質を溶出：0.6 M<html>トリス-HCl（pH6.8）を、50％グリセロール、2％SDS、および青ブロモフェノール0.1パーセント、5％β-メルカプトエタノールを含む。 </li><li> 5000 10〜15分、スピン℃の水浴×gで30秒間ビーズを沈殿させた37にインキュベートします。 </li><li> 4から15までパーセントゲル上にすべての溶出液をロードします。 </li><li>約30〜40分間SDS-PAGEを実行します。 </li><li> 1.5時間、PVDF膜にタンパク質のバンドを転送します。 </li><li> 5％無脂肪牛乳を含むTBS-Tweenでの膜をブロックします。 </li><li> 4の一次抗体（例えば抗CFTR抗体、R1104など）の膜℃、一晩インキュベートします。 </li><li> 5分、6回TBS-Tweenで膜を洗浄します。 </li><li> 22℃で45分間二次抗体（例えば、ヤギ抗マウスHRP標識第2抗体など）で膜をインキュベート</li><li> 5分、6回TBS-Tweenで膜を洗浄します。 </li><li> ECLを介してタンパク質バンドを可視化することができます。 </li><li>代表的なデータは、 図1に示されています。 </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4。代表的な結果 in vitroで組み立てられたCFTR含有高分子のシグナル伝達複合体の例を図1に示されています。高分子複合体は、MRP4 C末端50アミノ酸（MRP4-CT50）PDZK1と、フルレングスCFTR（ 図1 下 ）の間に形成されました。複合体形成は、仲介蛋白質PDZK1（ 図1、 下 ）18の増加量の用量依存的に増加した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4091/4091fig1.jpg" /> 図1：高分子複合体アッセイの絵画表現（ 上 ）。高分子複合体は、用量依存的に三つのタンパク質（GST-MRP4-CT50、彼の-S-PDZK1と、フラグ-CFTRwt）（ 底部 ）18を用いてin vitro で検出されました。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; CFTR-NHERF1-β2 AR（文献14） </td><td> CFTR-NHERF2-LPA 2（参考文献15） </td><td> CFTR-PDZタンパク質-MRP 2（参考文献17） </td><td> CFTR-PDZK1-MRP4（文献16） </td></tr><tr><td> アフィニティービーズ </td><td>アミロース樹​​脂</td><td> S-タンパク質アガロース</td><td>アミロース樹​​脂</td><td>グルタチオンアガロース</td></tr><tr><td> タンパク質-1を精製した </td><td> MBP-β2 AR CT </td><td>彼の-S-CFTR CT </td><td> MBP-CFTR CT </td><td> GST-MRP4 CT </td></tr><tr><td> タンパク質-2を精製した </td><td> GST-NHERF1 </td><td> GST-NHERF2 </td><td> GST-PDZタンパク質</td><td>彼の-S-PDZK1 </td></tr><tr><td> （または細胞溶解液）タンパク質A-3を精製 </td><td> CFTR-WTまたはCFTR-his10（BHKまたはHEK細胞溶解物） </td><td>フラグ-LPA 2重量またはフラグ-LPA 2ΔSTL（BHK細胞ライセート） </td><td> MRP2（MDCK細胞溶解液） </td><td>フラグ-CFTR-WTまたはCFTR-his10（または細胞ライセート）を精製した</td></tr><tr><td> 抗体 </td><td>抗CFTR抗体</td><td>抗Flag HRP </td><td>抗IgG抗体MRP2 </td><td>抗Flag HRP </td></tr></tbody></table> in vitroで組み立てられた様々なCFTR含有高分子複合体の表1にまとめ。

<ol><li>Anderson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+CFTR+is+a+chloride+channel+by+alteration+of+its+anion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity.</a> Science. 253, 202-205 (1991).</li>
<li>Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR.</a> Cell. 68, 809-818 (1992).</li>
<li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+impermeability+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chloride impermeability in cystic fibrosis.</a> Nature. 301, 421-422 (1983).</li>
<li>Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+intracellular+transport+and+processing+of+CFTR+is+the+molecular+basis+of+most+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis.</a> Cell. 63, 827-834 (1990).</li>
<li>Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+heterozygote+resistance+to+cholera+toxin+in+the+cystic+fibrosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model.</a> Science. 266, 107-109 (1994).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+chloride+channel+in+the+apical+compartments%3A+spatiotemporal+coupling+to+its+interacting+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners.</a> Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).</li>
<li>Chao, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+intestinal+CFTR+Cl-+channel+by+heat-stable+enterotoxin+and+guanylin+via+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase.</a> Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+and+outward+rectifying+chloride+channels+are+distinct+proteins+with+a+regulatory+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship.</a> Nature. 363, 263-268 (1993).</li>
<li>McNicholas, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+a+renal+K%2B+channel+%28ROMK2%29+to+the+inhibitory+sulfonylurea+compound+glibenclamide+is+enhanced+by+coexpression+with+the+ATP-binding+cassette+transporter+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).</li>
<li>Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+activates+aquaporin+3+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).</li>
<li>Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+drives+Na%2B-nHCO-3+cotransport+in+pancreatic+duct+cells%3A+a+basis+for+defective+HCO-3+secretion+in+CF%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF.</a> Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).</li>
<li>Ahn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interaction+between+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+HCO3-+salvage+mechanisms+in+model+systems+and+the+mouse+pancreatic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct.</a> J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).</li>
<li>Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Cl-+channel+and+CFTR-associated+ATP+channel%3A+distinct+pores+regulated+by+common+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates.</a> Embo. J. 17, 898-908 (1998).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+chloride+channels+by+syntaxin+and+Munc18+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms.</a> Nature. 390, 302-305 (1997).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+1A+is+expressed+in+airway+epithelial+cells%2C+where+it+modulates+CFTR+Cl%28-%29+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents.</a> J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+complex+of+beta+2+adrenergic+receptor%2C+CFTR%2C+and+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin-binding+phosphoprotein+50+is+regulated+by+PKA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+inhibits+cholera+toxin-induced+secretory+diarrhea+through+CFTR-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions.</a> J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+coupling+of+cAMP+transporter+to+CFTR+chloride+channel+function+in+the+gut+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia.</a> Cell. 131, 940-951 (2007).</li>
<li>Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+carcinogen+NNK+transporter+MRP2+regulates+CFTR+function+in+lung+epithelia%3A+implications+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer.</a> Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).</li>
<li>Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+motif+found+in+the+beta2-adrenergic+receptor%2C+P2Y1+receptor+and+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+determines+binding+to+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger+regulatory+factor+family+of+PDZ+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).</li>
<li>Short, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apical+PDZ+protein+anchors+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+to+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton.</a> J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).</li>
<li>Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessory+protein+facilitated+CFTR-CFTR+interaction%2C+a+molecular+mechanism+to+potentiate+the+chloride+channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity.</a> Cell. 103, 169-179 (2000).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3KARP+mediates+the+association+of+ezrin+and+protein+kinase+A+with+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+airway+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells.</a> J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golgi-associated+PDZ+domain+protein+modulates+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+plasma+membrane+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression.</a> J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).</li>
<li>Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+PDZ+protein+regulates+the+activity+of+guanylyl+cyclase+C%2C+the+heat-stable+enterotoxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).</li>
<li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+by+competitive+interactions+of+molecular+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).</li>
<li>Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+DeltaF508-CFTR+trafficking+via+a+GRASP-dependent+unconventional+secretion+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway.</a> Cell. 146, 746-760 (2011).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+intermolecular+and+intramolecular+interactions+regulating+CFTR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function.</a> Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).</li>
<li>Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CFTR+Interactome+in+the+Macromolecular+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes.</a> Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine+receptor+CXCR2+macromolecular+complex+regulates+neutrophil+functions+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

このプロトコルでは、前述の16-19,29,30を報告した in vitroで組み立て、精製タンパク質（またはタンパク質断片）および/ ​​または細胞ライセートを用いて高分子シグナル伝達複合体を含むCFTRの検出方法を示した。最良の結果を達成するための準備プロセス中に次の重要なポイントは、特別な注意が必要です。 <ul><li>これは、溶出緩衝液のpHは、ステップ1）で説明したように、GST-融合タンパク質を精製する際に還元型グルタチオンを添加した後8.0に調整することが重要です。 pHは、還元型グルタチオンを添加した後3.0などのように低くなることができます。 pHが溶出する前に調整されていない場合は、溶出の効率が大幅に削減されます。 </li><li>タンパク質がビーズから溶出されたとき、彼らはすぐに透析する必要があり、それ以外の場合は、精製タンパク質が溶液から出てくるかもしれません。蛋白質の透析は、右の溶出プロセスの後に可能でない場合は、タンパク質を溶出し、目でそれらを残していない電子アガロース/ビーズ。 </li><li>それは強くCFTR凝集が共通の問題とし...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> pGEX4T-1ベクトル</td><td> GEヘルスケア</td><td> 28-9545-49 </td><td>旧アマシャムバイオサイエンス</td></tr><tr><td>やpMal-C2ベクトル</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pET30ベクトル</td><td> EMDケミカルズ</td><td> 69077から3 </td><td>以前はNovagen社</td></tr><tr><td>グルタチオンアガロースビーズ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 554780 </td><td></td></tr><tr><td>アミロース樹​​脂</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> E8021S </td><td></td></tr><tr><td>タロンビーズ</td><td>クロンテック</td><td> 635501 </td><td></td></tr><tr><td>還元グルタチオン</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 554782 </td><td></tD&gt; </tr><tr><td>イミダゾール</td><td>フィッシャー</td><td> BP305-50 </td><td></td></tr><tr><td>マルトース</td><td>フィッシャー</td><td> BP684-500 </td><td></td></tr><tr><td> S-タンパク質アガロース</td><td> EMDケミカルズ</td><td> 69704から3 </td><td>以前はNovagen社</td></tr><tr><td>抗Flag HRP </td><td>シグマ</td><td> A8592 </td><td></td></tr><tr><td>抗CFTR抗体</td><td>カスタムメード</td><td> R1104 </td><td> AA 722から734でCFTRのエピトープを認識するモノクローナル抗体</td></tr><tr><td>抗IgG抗体MRP2 </td><td>ケミコンインターナショナル</td><td> MAB4148 </td><td>ミリポアの今一部</td></tr></tbody></table> 表2特異的試薬および装置。

pdz-依存性のcftrの高分子シグナル伝達複合体のin vitroでの解析で

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）、主に上皮細胞の頂端膜に位置するクロライドチャネルは、1〜3上皮液の恒常性に重要な役割を果たしている。嚢胞性線維症（CF 4）及び分泌性下痢5：CFTRは、二つの主要な疾患に関与している。 CFでは、CFTRのCl-チャネルの合成または機能活性が低下します。この疾患は、米国6の約1 2500の白人に影響を与えます。過度のCFTR活性はまた、腸内7でcAMPまたはcGMP産生を刺激する毒素によって誘導される分泌性下痢（例えば、コレラ毒素と熱安定性大腸菌エンテロトキシンによる）の症例に関与している。 証拠を蓄積すると、CFTRとトランスポーター、イオンチャネル、受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、信号を含む他のタンパク質の増加との間の物理的および機能的相互作用の存在を示唆る分子および細胞骨格要素、およびCFTRとその結合蛋白質との間でこれらの相互作用が非常にin vitroおよびin vivoでも8-19に CFTR媒介上皮イオン輸送の調節に関与していることが示されている。このプロトコルでは、メソッドだけに焦点を当て、そのタンパク質結合モチーフを持っているCFTRカルボキシル末端尾部の間の相互作用の研究を支援し、[モチーフPSD95/Dlg1/ZO-1（PDZ）と呼ばれる] PDZドメインと呼ばれる特定の結合モジュールが含まれている足場タンパク質のグループ。これまでのところ、いくつかの異なるPDZ足場タンパク質は、そのようなNHERF1などの様々な親和性、NHERF2、PDZK1、PDZK2、CAL（CFTR関連リガンド）、Shank2とCFTRのカルボキシル末端尾部に結合し、20から27を把握することが報告されている。 PDZ足場タンパク質によって認識されているCFTR内PDZモチーフはC末端（すなわち、ヒトCFTRの1477-DTRL-1480）20最後の4つのアミノ酸である。興味深いことに、CFTRは、様々な親和性を22とはいえ、NHERFsとPDZK1両方の複数のPDZドメインをバインドすることができます。 CFTRの結合に関しては、この多価は、PDZ足場タンパク質は、細胞16から18の特定/選択的かつ効率的なシグナリングのためのシグナル伝達複合体CFTRの高分子の形成を促進する可能性が示唆された、機能的意義のあることが示されている。 複数の生化学的なアッセイは、CFTR-含むそのような共免疫沈降、プルダウンアッセイでは、ペアワイズ結合アッセイ、ペアワイズ結合アッセイ比色し、高分子の複雑なアセンブリアッセイ16-19,28,29としてタンパク質相互作用を研究するために開発されている。ここでは、CFTR 16-19,28,29を含むタンパク質-タンパク質またはドメインドメインの相互作用を研究する我々の研究室で広く使用され、in vitroでのPDZモチーフに依存したCFTR含有高分子複合体を組み立てるの詳細な手順に焦点を当てています。

嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）、上皮クロライドチャネルは、様々なタンパク質と相互作用し、重要な細胞プロセスを調節することが報告されているそれらの間でCFTR PDZモチーフを介する相互作用は十分に文書化されています。このプロトコルは、我々は複雑なシグナル伝達PDZ-依存性のCFTRの高分子を組み立てるために開発された方法について説明します。<em&gt; in vitroで</em&gt;。

PDZ-依存性のCFTRの高分子シグナル伝達複合体のin vitroでの解析で

主に上皮細胞の頂端膜に位置するクロライドチャネルである嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（CFTR）は、...

この手順の全体的な目的は、PDZ依存的な嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（CFTR）マクロ分子シグナリング複合体をin vitroで構築することです。これを達成するために、リコンビナントタグ融合タンパク質を細菌で発現させ、精製します。次に、CFTRまたはCFTR結合タンパク質を発現させた培養細胞から細胞溶解液を回収します。次に、CFTRと結合タンパク質をin vitroで組み合わせ、CFTRを含む高分子シグナリング複合体を構築します。その後、ウェスタンブロッティングを行い、CFTR高分子複合体の形成を確認し、評価します。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、CFTRを含む高タンパク質高分子複合体の個別の形成を直接的に検出および可視化できることです。したがって、本手法はCT Rを含む高分子複合体の形成に関する知見を提供することができます。また、本手法は、Sex C 2高分子シグナル伝達複合体などの、CFTRに関与しない非タンパク質複合体の構築にも適用可能です。最近では、この同一の手法を用いて、ケモカイン受容体CXCR 2が下流のエフェクターと物理的にタンパク質複合体を形成することを実証しました。PCRを用いて、好中球におけるPRC beta 3とwild nerve 1の相互作用を解析します。C末端のPDZモチーフを含む、最後から50〜100アミノ酸をコードするDNAを増幅させてください。対象は、cAMPトランスポーターであるMRP4、およびナトリウム水素交換因子調節因子（NHERF）のPDZ1ドメインです。次に、GST融合タンパク質を生成するために、RP4 PCR産物をpGEX-4T-1にクローニングし、NHERFのPDZ1ドメインをpET-30にクローニングします。Hisタグ融合タンパク質を生成するため、ヒートショック法により細菌を形質転換します。プロテアーゼ欠損大腸菌株を用い、ベクターに適した抗生物質を含む50 mLのLB培地にて、振盪インキュベーターを用いて37 °Cで一晩培養します。翌日、培養液を10倍に希釈し、500 mLのLuria Bertani培地（LB培地）に分注します。その後、37 °Cで振盪培養し、2時間後に0.5～1 mMのIPTGを添加して、30 °Cで4時間、組換えタンパク質の発現を誘導します。インキュベーション後、培養物を250 milliliter遠心チューブに移し、4 °Cで8,000 ×gで10分間遠心分離して細胞をペレット化します。遠心後、上清を捨て、リゾチーム、1 mg/mL 0.2% Triton X 100、およびプロテアーゼ阻害剤を含むスクロースバッファー20 millilitersを加えて細胞を溶解させ、細菌懸濁液を清潔な50 milliliter遠心チューブに移します。ロータリーシェーカーを用いて4 °Cで30分間混合します。次に、4 °Cで20,000 ×gにて30分間遠心分離します。遠心分離後、上清は透明になり、チューブの底に不溶性のAPPペレットが形成されます。透明な上清を新しい50 milliliterコニカルチューブに回収します。次に、その上清に適切なレジンを1 milliliter加えます。Aero beadsは、グルタチオン含有スクロース緩衝液中で50%スラリーとして懸濁させています。GST融合タンパク質にはAero beadsを、His S融合タンパク質にはtalon beadsを使用してください。ロータリーシェーカーを用いて4°Cで4時間混合します。その後、ビーズを800 ×gで2分間遠心分離します。次に、15 millilitersのPBSに懸濁させて洗浄し、ローテーターで2分間混合します。最後に、上清を捨てます。この工程を6回繰り返し、6回目の洗浄後に完了します。ビーズからタンパク質を溶出させるには、ビーズ1 mLに対して適切な溶出バッファーを2 mL加え、室温で10分間混合します。溶出されたタンパク質を含むビーズ全体をカラムに注ぎ、流出液を溶出タンパク質として回収します。次に、UDタンパク質を透析チューブに移します。4°Cで攪拌しながら、2 LのPBSに対して溶出タンパク質を透析します。透析後、4時間ごとにPBSを4回交換します。タンパク質を0.5〜1 mLまで濃縮します。10,000 megawatt カットオフの遠心フィルターを使用します。サンプルを 200 microliters ずつ分注します。1つを分析用に保存し、残りは保存のために minus 80 degrees Celsius で保管します。ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を決定します。BSAS標準品を用いたSDS-PAGEにより、タンパク質の品質を評価します。タンパク質の完全性が不十分な場合は、ゲルろ過やイオン交換などの二次精製手順を用いることができます。野生型flag CFTRを発現するHEK 293細胞は、付属文書に従って培養してください。細胞から培地を除去し、PBSで洗浄します。次に、細胞を溶解させるため、60 mm培養ディッシュ1枚につき500 µLの溶解バッファーを加え、4 °Cで20分間、細胞溶解物をロッキングします。ライセートを新しいマイクロ遠心チューブに転写します。次に、不溶性タンパク質を除去するため、4 °Cで16,000 ×gで15分間遠心分離し、上清を回収します。in vitroでCFTRを含む高分子複合体を組み立てるため、Bradford法によりタンパク質濃度を測定します。まず、精製したG-S-T-M-R-P four C末端50アミノ酸融合タンパク質20 µgと、0〜40 µgの範囲で量を増やした精製hiss S PD zk one融合タンパク質を、200 µLの溶解バッファーと共に1.5 mLマイクロ遠心チューブに加えます。これら2つのタンパク質をロータリーミキサーを用いて22 °Cで1〜2時間混合します。次に、グルタチオンビーズの50%スラリー20 µLをタンパク質混合液に加え、さらに1時間混合し続けます。このステップはペアワイズ結合とも呼ばれ、G-S-T-M-R-P four CT 50がSPD zk oneに結合します。ペアワイズ結合ステップに続いて、ビデオの前セクションで説明した手順に従い、野生型flag CFTRを過剰発現させたHEK 2 93細胞溶解液を準備します。複合体を溶解バッファーで2回洗浄し、各洗浄につき800 ×gで1分間遠心分離し、洗浄ごとに上澄み液を慎重に吸引してください。ビーズを底から吸引しないよう注意してください。HT K 2 93細胞ライセートをビーズに加え、4 °Cでロータリーミキサーを用いて3時間または一晩、緩やかに混合します。ライシスバッファーでビーズを3回洗浄し、前述と同様に各洗浄後に遠心分離を行い、最後の洗浄後も同様に処理します。タンパク質を溶出させるため、5xサンプルバッファーを30 µL加え、37 °Cのウォーターバスで10〜15分間インキュベートします。次に、5,000 ×gで1分間遠心分離し、ビーズを沈殿させます。続いて、溶出液のすべてを4〜15% SDS-PAGEゲルにロードし、ゲルの末端まで200 Vで電気泳動を行います。泳動後、BioRad転写装置を用い、60 Vで1.5時間、タンパク質バンドをPVDF膜に転写します。転写の完了後、5%脱脂粉乳を含むTBS tweenでメンブレンを1時間ブロッキングします。付属文書に記載されている方法でウェスタンブロッティングを行い、CFTR相互作用タンパク質を可視化してください。このビデオで説明した通り、この図に示されるように、CFTRを含む高分子シグナル伝達複合体がin vitroで構築されました。Mr.RRP four PD zk oneのC末端50アミノ酸とフルレングスのCFTRとの間で形成される高分子複合体を用い、高分子複合体形成の用量依存性を決定した。ここに示すように、中間タンパク質PD ZK oneの添加量を増加させた。複合体は用量依存的に増加し、中間タンパク質PD ZK oneがCCF TRとMr.Rrp fourの相互作用を媒介していることが示唆された。この手順を行う際は、FTR凝集が頻発するため、ウェスタンブロッティング用に調製したFTRコンテナ微小分子複合体サンプルを沸騰させないことが重要です。代わりに、本手順に従い、サンプルを37 degreeで10～15分間加熱してからゲルにロードしてください。気道上皮細胞や腸上皮細胞などの細胞における内因性CFTR複合体を評価するために、共沈殿法などの他の手法を実施することも可能です。このビデオを視聴することで、in vitroでPTC依存性CFDR高分子シグナリング複合体を構築する方法について深く理解することができます。

in-vitro-analysis-pdz-dependent-cftr-macromolecular-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

そのターゲットの脂質とタンパク質の相互作用をテストするために我々は、MACSとターゲットの脂質とアネキシンV結合ホスファチジルセリンから合成されたアネキシンV...

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

一回膜貫通ドメイン（TMDS）のオリゴマー化の傾向を評価するための効率的な手順が説明されています。 ToxRに融合されたTMDからなるキメラタンパク質は、大腸菌のレポーター株に発現されています。...

ToxRアッセイによって決定される膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析は、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量方法を提供するものである。この方法は、マッピング·タンパク質結合部位およびタンパク質 -...

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

異種発現および嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）の精製は、重大な課題および嚢胞性線維症のための薬物療法の開発における制限因子である。このプロトコルは、機能的および構造的研究に適しCFTRのミリグラム量の単離のための2つの方法について説明します。...

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

ここで説明すると、嚢胞性線維症における欠陥があるこの塩素チャネル、のための活動を維持して精製野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成するための迅速かつ効果的な手続きである。 CFTRによって媒介され、再構成プロテオリポソー​​ムからヨウ化物流出は、チャネル活性の研究や小分子の効果を可能にする。...

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

我々 は開いた区域の脂質の心と私の自己組織化アッセイの in vitroのプロトコルを提供します。さらに、我々 は反応閉じ込めによる生体内での条件を模倣する脂質被覆 PDMS microcompartments...

体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル...

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

ここで折りたたみ、トランスポート、および生きているセルで続かれるべき蛋白質の分解の速度論的解析を可能にする一般的なパルス追跡法のためのプロトコルについて述べる。...

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

このプロトコルは、細胞環境において受容体に結合するアデニンヌクレオチドをリアルタイムで測定する方法を提示する。結合は、トリニトロフェニルヌクレオチド誘導体と非標準的な蛍光アミノ酸で標識されたタンパク質との間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)として測定されます。...

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

学ぶ CFTR高分子シグナル伝達複合体のin vitro組み立て法。組換えタグ融合タンパク質を細菌で発現・精製し、CFTRと結合タンパク質を組み合わせて複合体を形成する。ウェスタンブロッティングで可視化できる。

PDZ-依存性のCFTRの高分子シグナル伝達複合体のin vitroでの解析で

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