PDZ-依存性のCFTRの高分子シグナル伝達複合体のin vitroでの解析で

この手順の全体的な目的は、PDZ依存的な嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（CFTR）マクロ分子シグナリング複合体をin vitroで構築することです。これを達成するために、リコンビナントタグ融合タンパク質を細菌で発現させ、精製します。次に、CFTRまたはCFTR結合タンパク質を発現させた培養細胞から細胞溶解液を回収します。

次に、CFTRと結合タンパク質をin vitroで組み合わせ、CFTRを含む高分子シグナリング複合体を構築します。その後、ウェスタンブロッティングを行い、CFTR高分子複合体の形成を確認し、評価します。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、CFTRを含む高タンパク質高分子複合体の個別の形成を直接的に検出および可視化できることです。

したがって、本手法はCT Rを含む高分子複合体の形成に関する知見を提供することができます。また、本手法は、Sex C 2高分子シグナル伝達複合体などの、CFTRに関与しない非タンパク質複合体の構築にも適用可能です。最近では、この同一の手法を用いて、ケモカイン受容体CXCR 2が下流のエフェクターと物理的にタンパク質複合体を形成することを実証しました。

PCRを用いて、好中球におけるPRC beta 3とwild nerve 1の相互作用を解析します。C末端のPDZモチーフを含む、最後から50〜100アミノ酸をコードするDNAを増幅させてください。対象は、cAMPトランスポーターであるMRP4、およびナトリウム水素交換因子調節因子（NHERF）のPDZ1ドメインです。

次に、GST融合タンパク質を生成するために、RP4 PCR産物をpGEX-4T-1にクローニングし、NHERFのPDZ1ドメインをpET-30にクローニングします。Hisタグ融合タンパク質を生成するため、ヒートショック法により細菌を形質転換します。プロテアーゼ欠損大腸菌株を用い、ベクターに適した抗生物質を含む50 mLのLB培地にて、振盪インキュベーターを用いて37 °Cで一晩培養します。

翌日、培養液を10倍に希釈し、500 mLのLuria Bertani培地（LB培地）に分注します。その後、37 °Cで振盪培養し、2時間後に0.5～1 mMのIPTGを添加して、30 °Cで4時間、組換えタンパク質の発現を誘導します。

インキュベーション後、培養物を250 milliliter遠心チューブに移し、4 °Cで8,000 ×gで10分間遠心分離して細胞をペレット化します。遠心後、上清を捨て、リゾチーム、1 mg/mL 0.2% Triton X 100、およびプロテアーゼ阻害剤を含むスクロースバッファー20 millilitersを加えて細胞を溶解させ、細菌懸濁液を清潔な50 milliliter遠心チューブに移します。

ロータリーシェーカーを用いて4 °Cで30分間混合します。次に、4 °Cで20,000 ×gにて30分間遠心分離します。遠心分離後、上清は透明になり、チューブの底に不溶性のAPPペレットが形成されます。

透明な上清を新しい50 milliliterコニカルチューブに回収します。次に、その上清に適切なレジンを1 milliliter加えます。Aero beadsは、グルタチオン含有スクロース緩衝液中で50%スラリーとして懸濁させています。

GST融合タンパク質にはAero beadsを、His S融合タンパク質にはtalon beadsを使用してください。ロータリーシェーカーを用いて4°Cで4時間混合します。その後、ビーズを800 ×gで2分間遠心分離します。

次に、15 millilitersのPBSに懸濁させて洗浄し、ローテーターで2分間混合します。最後に、上清を捨てます。この工程を6回繰り返し、6回目の洗浄後に完了します。

ビーズからタンパク質を溶出させるには、ビーズ1 mLに対して適切な溶出バッファーを2 mL加え、室温で10分間混合します。溶出されたタンパク質を含むビーズ全体をカラムに注ぎ、流出液を溶出タンパク質として回収します。次に、UDタンパク質を透析チューブに移します。

4°Cで攪拌しながら、2 LのPBSに対して溶出タンパク質を透析します。透析後、4時間ごとにPBSを4回交換します。タンパク質を0.5〜1 mLまで濃縮します。

10,000 megawatt カットオフの遠心フィルターを使用します。サンプルを 200 microliters ずつ分注します。1つを分析用に保存し、残りは保存のために minus 80 degrees Celsius で保管します。

ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を決定します。BSAS標準品を用いたSDS-PAGEにより、タンパク質の品質を評価します。タンパク質の完全性が不十分な場合は、ゲルろ過やイオン交換などの二次精製手順を用いることができます。

野生型flag CFTRを発現するHEK 293細胞は、付属文書に従って培養してください。細胞から培地を除去し、PBSで洗浄します。次に、細胞を溶解させるため、60 mm培養ディッシュ1枚につき500 µLの溶解バッファーを加え、4 °Cで20分間、細胞溶解物をロッキングします。

ライセートを新しいマイクロ遠心チューブに転写します。次に、不溶性タンパク質を除去するため、4 °Cで16,000 ×gで15分間遠心分離し、上清を回収します。in vitroでCFTRを含む高分子複合体を組み立てるため、Bradford法によりタンパク質濃度を測定します。

まず、精製したG-S-T-M-R-P four C末端50アミノ酸融合タンパク質20 µgと、0〜40 µgの範囲で量を増やした精製hiss S PD zk one融合タンパク質を、200 µLの溶解バッファーと共に1.5 mLマイクロ遠心チューブに加えます。これら2つのタンパク質をロータリーミキサーを用いて22 °Cで1〜2時間混合します。次に、グルタチオンビーズの50%スラリー20 µLをタンパク質混合液に加え、さらに1時間混合し続けます。

このステップはペアワイズ結合とも呼ばれ、G-S-T-M-R-P four CT 50がSPD zk oneに結合します。ペアワイズ結合ステップに続いて、ビデオの前セクションで説明した手順に従い、野生型flag CFTRを過剰発現させたHEK 2 93細胞溶解液を準備します。複合体を溶解バッファーで2回洗浄し、各洗浄につき800 ×gで1分間遠心分離し、洗浄ごとに上澄み液を慎重に吸引してください。

ビーズを底から吸引しないよう注意してください。HT K 2 93細胞ライセートをビーズに加え、4 °Cでロータリーミキサーを用いて3時間または一晩、緩やかに混合します。ライシスバッファーでビーズを3回洗浄し、前述と同様に各洗浄後に遠心分離を行い、最後の洗浄後も同様に処理します。

タンパク質を溶出させるため、5xサンプルバッファーを30 µL加え、37 °Cのウォーターバスで10〜15分間インキュベートします。次に、5,000 ×gで1分間遠心分離し、ビーズを沈殿させます。続いて、溶出液のすべてを4〜15% SDS-PAGEゲルにロードし、ゲルの末端まで200 Vで電気泳動を行います。泳動後、BioRad転写装置を用い、60 Vで1.5時間、タンパク質バンドをPVDF膜に転写します。

転写の完了後、5%脱脂粉乳を含むTBS tweenでメンブレンを1時間ブロッキングします。付属文書に記載されている方法でウェスタンブロッティングを行い、CFTR相互作用タンパク質を可視化してください。このビデオで説明した通り、この図に示されるように、CFTRを含む高分子シグナル伝達複合体がin vitroで構築されました。

Mr.RRP four PD zk oneのC末端50アミノ酸とフルレングスのCFTRとの間で形成される高分子複合体を用い、高分子複合体形成の用量依存性を決定した。ここに示すように、中間タンパク質PD ZK oneの添加量を増加させた。複合体は用量依存的に増加し、中間タンパク質PD ZK oneがCCF TRとMr.Rrp fourの相互作用を媒介していることが示唆された。

この手順を行う際は、FTR凝集が頻発するため、ウェスタンブロッティング用に調製したFTRコンテナ微小分子複合体サンプルを沸騰させないことが重要です。代わりに、本手順に従い、サンプルを37 degreeで10～15分間加熱してからゲルにロードしてください。気道上皮細胞や腸上皮細胞などの細胞における内因性CFTR複合体を評価するために、共沈殿法などの他の手法を実施することも可能です。

このビデオを視聴することで、in vitroでPTC依存性CFDR高分子シグナリング複合体を構築する方法について深く理解することができます。