Name: C. elegansの追跡と行動計測 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学ぼう、C. elegansの高解像度追跡と行動計測法。LabVIEWとMATLABを用いた独自ソフトウェアで、複雑な画像データを次元削渊し、運動パターンを定量的に解析する手法を解説します。

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1。トラッキング顕微鏡の説明<ol><li>寒天プレートは、ファイバ光源により照明とカメラで撮像される。このシステムは、X、Y移動ステージに取り付けられている。 </li><li>ステージは、ステッパ·モータ·コントローラに接続されている標準のステッパモータによって移動されています。 </li><li>コントローラとカメラがパソコンに接続されており、LabVIEWで記述されたカスタムプログラムによって制御されます。 </li><li>カメラが画像寒天プレートの表面をと明るい背景に暗いオブジェクトを識別します。 </li><li>画質は、コンピュータプログラムがリアルタイムでオブジェクトを定量化することができるように調整される。ゲイン、明るさ、カメラのシャッタースピードは、白い背景上の暗い被写体を提供するように調整することができます。 </li><li>自動キャリブレーション·プロセスのためのキャリブレーションマークがワームピックで寒天表面をつつくことによって作られています。 </li><li>追跡プログラムによって使用され、濾過し、バイナリイメージを確認することができます。 </li><li>そうftwareテスト·オブジェクトの一定の距離を移動することによってキャリブレーション行列を計算し、自動キャリブレーション機能を持っています。 </li><li>ピクセル単位の距離は、キャリブレーション行列によってステッピングモータによりとられた措置にキャリブレーションされます。 </li><li>キャリブレーションした後、システムは行く準備ができていると倍率が変更されない限り、または、カメラの位置が変更されている場合は再校正する必要はありません。 </li></ol> 2。トラッキングプレートと C の準備トラッキングのためのエレガンス <ol><li>銅リングがワームを囲い、プレートの端に移行するからそれらを維持するために使用されます。銅は、局所的な化学的バリアーを提供し、実験（&lt;1時間）の持続時間のためにそうでなければ、ワームの動きに影響を与えません。ヒートブロックまたは同等の上でそれを置くことによって、最初のリングを加熱する。 </li><li>新鮮な寒天プレート上に置きリング（1.7％バクト寒天、0.25％バクトペプトン、0.3％のNaCl、1mMのCaCl 2、1mMのMgSO 4を 、25 mMリン酸カリウム緩衝液、5μg/ mlのコレステロール）と寒天表面に埋め込むこと少し下に押します。 </li><li>食品残渣のそれらを洗浄するために、いくつかのNGMバッファー（0.3％のNaCl、1mMのCaCl 2、1mMのMgSO 4を 、25 mMリン酸カリウム緩衝液）を充填した寒天プレート上にL4の段階や若い成虫を選んでください。ワームは数分間泳ごう。 </li><li>慎重にリングの中央付近追跡プレートの上に単一のワームを置く。その後ワームトラッカー上にプレートを置きます。 </li></ol> 3。ワームトラッキング<ol><li> LabVIEWプログラムを実行し、必要に応じて（イメージの場所、画像、計測、カメラ設定の種類）オプションを選択します。 </li><li>ワームの像が視野（コンピュータ画面）になるまで、ジョイスティックを使用すると、顕微鏡を移動します。追跡プログラムを係合するように &quot;トラック&quot;を押してください。 </li><li>コンピュータプログラムは、実際には図のようにバイナリフィルタリングされた画像の動きを計測し、リアルタイムで、この画像上で測定を行うことができます</li><li>アフトワームの局所的な形状の変化を詳細に見ることができる一方で、グローバル軌道の再構築を追跡ERは、ステッピングモータの動きから作ることができる。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>ワームの形状をパラメータ化するskeletonizingスクリプト（MATLAB）を実行します。 （ 図2） </li><li>スケルトンデータの固有モードを計算します。 （ 図3,4） </li><li> 図5を表示します 。図の凡例または代表的な結果をお読みください。 </li></ol>

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).</li>
<li>de Bono, M., Maricq, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+substrates+of+complex+behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans.</a> Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).</li>
<li>Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circuit+for+navigation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).</li>
<li>Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+machine+vision+to+analyze+and+classify+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes+quantitatively%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively.</a> J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).</li>
<li>Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensionality+and+Dynamics+in+the+Behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans.</a> PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028(2008).</li>
<li>Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+modes+to+movement+in+the+behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">From modes to movement in the behavior of C. elegans.</a> PLoS One. 5 (11), e13914(2010).</li>
<li>Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imaging+system+for+standardized+quantitative+analysis+of+C.+elegans+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior.</a> BMC Bioinformatics. (5), 115(2004).</li>
<li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parallel+Worm+Tracker%3A+A+Platform+for+Measuring+Average+Speed+and+Drug-Induced+Paralysis+in+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208(2008).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li>
<li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multimodal+optical+control+of+neurons+and+muscles+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).</li>
<li>Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+imaging+of+neuronal+activity+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).</li>
<li>Wittenburg, N., Baumeister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%3A+an+approach+to+the+study+of+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

運動や自然な行動の研究では、データ削減技術を持つパートナーで非侵襲追跡技術を必要とします。ここでは、Cの詳細な画像を記録·トラッキング·システムを使用して簡単に実証されているそれは寒天プレートの表面にクロールとしてelegansは動作。これらの画像に含まれる情報の量が膨大かつ高次元であるので、我々はまた、4つだけ根本的な対策にデータの次元数を削減するための方法を開発した。これらの措置は、包括的であり、ワームの動作に関して解釈するのは簡単です。この仕事のために我々は、その波動サイクル、肉眼で行うことは困難である測定のさまざまなポイントで優先的に前方と後方の状態の間、そのワームの遷移を示しています。この作品は、測定することができますまたは神経ACTIを調節するシステムにも低倍率8,9,10時の虫の挙動を測定するために開発されたシステムを追跡するに相補的であり、遺伝的にコードされた試薬の11,12を使用して VITY。 単一生物の追跡は動作の定量化のための強力な方法であるが技術にはいくつ...

<table border="1"><tbody><tr><td>パーツの名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント（オプション） </td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>バスラー</td><td> A601f </td><td></td></tr><tr><td>レンズ</td><td>エドモンド·オプティクス</td><td> MMSシリーズ</td><td></td></tr><tr><td>ファイバー照明</td><td>ドーランジェンナー</td><td> DC-950H </td><td></td></tr><tr><td>並進ステージ</td><td>デルトロン</td><td> LS3-4 </td><td></td></tr><tr><td>ステッピングモータ</td><td>米国のデジタル</td><td> MS23C </td><td></td></tr><tr><td>ステッピングモータ駆動</td><td>ヤモリ</td><td> G201 </td><td></td></tr><tr><td>ステッピングモータ制御</td><td> SimpleStep </td><td> SSXYZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>すべてのプログラミング·コードが入手可能です。対応する著者にリクエストメールを送ってください。 </td></tr></tbody></table>

c. elegansの追跡と行動計測

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

我々は、Cの運動器官の挙動を定量化する計測機器、画像処理、データ解析技術を開発しましたエレガンスそれは寒天プレートの表面にはクロールのように。行動、Cの遺伝的、生化学的、および神経基盤の研究のためそれは顕微鏡に従順で、遺伝的に扱いやすい、タクシー、学習、社会的相互作用1,2含む複雑な行動の数を示していますのでelegansは理想的な生物である。彼らは寒天プレート上でクロールのようにワームの動きを追跡に基づいた行動分析は、感覚行動3、移動4、および一般的な変異表現型5の研究に特に有用であった。我々のシステムは、ワームは、機械的な刺激がワームには送信されません確実に静止寒天プレート上にクロールしているように、カメラと照明システムの設置場所を移動することによって動作します。私たちの追跡システムは使いやすいですし、半自動校正機能を備えています。茶すべてのビデオトラッキングシステムのllengeは、それが本質的に高い次元で大量のデータを生成することです。当社の画像処理やデータ解析プログラムでは、総合的に唯一の3から4次元6,7の関数としてワームの挙動を再現する独立したコンポーネントのセットにワームの形状を減らすことで、この課題に対処する。プロセスの例として、我々はこのワームは、位相特異的な方法で、その反転状態に出入りすることを示している。

例：採餌、C. elegansの前方からの遷移が頻繁に前進運動の状態に戻る前に再配向を（オメガターン）を行うと、動きを逆転させる。この移行を定量化する動きの採餌パターンを理解する上で、また、ワームのモータ制御に重要である。歩行動作の微妙な詳細を明らかにする力は私たちのトラッカーデバイスを使用して見ることができます。 例として、我々は逆にして、約30分間寒天プレート上に自由にクロールワームの高解像度の画像をキャプチャすることにより、転移を転送するために逆に楽しみに見てください。実行されます。固有モード解析（ 図3）は、私たちがワームの波動運動の位相を測定することができます。順に位相測定は、私たちはワームと遷移します （ 図4）を逆に前方の速度を計算することができます。ワームの速度と位相の同時確率をプロットすることにより、我々はそのトランス見ることができます順方向および逆方向の優遇相（ 図5a）との間に起こる確率ition。我々は逆に...

私たちは、記録し、定量化することができるビデオレートトラッキング顕微鏡システムを開発した<em&gt; Cエレガンス</em高分解能と高速走行時の&gt;振る舞い。我々はまた、完全にワームの形状を表す測定値の基本的なセットにワーム画像の次元を削減するための計算手法を開発しました。

C. elegansの追跡と行動計測

私たちは、C. elegansが...上で這う際の移動行動を定量化するための、計測機器、画像処理、およびデータ解析技術を開発しました。

表現型解析。C. elegansの移動能力は、C. elegansの行動に関与する遺伝子やニューロンの探索において重要なツールとなります。C. elegansは、形態を変化させることで、前進、後退、および様々な種類の旋回といった定型的な移動行動を示します。これらの運動を長距離にわたり、かつ高い空間的・時間的分解能で定量化するため、我々はアガープレート上を這うC. elegansの動きを捉えるためのワームトラッカーを構築しました。また、LabVIEWおよびMATLABで作成したカスタムプログラムを用いて、これらの動きを定量的に分離・解析するためのソフトウェアも開発しました。すべてのビデオトラッキングシステムにおける課題は、極めて高次元で膨大な量のデータが生成されることです。我々の画像処理およびデータ解析プログラムでは、虫の形状を独立成分のセットに還元することでこの課題に対処しており、虫の行動をわずか3〜4次元の関数として包括的に再構成しました。アガープレートをファイバー光源で照射し、カメラで撮像します。このシステムはXY変換ステージに取り付けられています。ステージは標準的なステッピングモーターによって駆動され、ステッピングモーターコントローラーに接続されています。コントローラーとカメラをコンピューターに接続し、LabVIEWで作成したカスタムプログラムで制御します。カメラでアガールプレートの表面を撮影し、明るい背景上の暗い物体を識別します。自動キャリブレーション工程のためのキャリブレーションマークは、アガー表面に穴を開けることで作成します。ワームピックを用いて、コンピュータプログラムがリアルタイムで物体を定量化できるよう、画像品質を調整します。カメラのゲイン、明るさ、シャッタースピードを調整し、白背景に暗い物体が表示されるようにします。トラッキングプログラムで使用されるフィルタリング後の二値化画像を確認できます。このソフトウェアには、テストオブジェクトを一定距離移動させることでキャリブレーション行列を算出する自動キャリブレーション機能が搭載されています。ピクセル単位の距離は、このキャリブレーション行列によってステッピングモーターの移動ステップ数へと校正されます。校正後、システムは準備完了となり、倍率を変更したりカメラの位置を調整したりしない限り、再校正を行う必要はありません。線虫を囲い込み、プレートの端へ移動するのを防ぐために銅製リングを使用します。まず、リングをヒートブロックまたは同等の装置に載せて加熱してください。リングを約1分間加熱します。リングを新しいアガープレートの上に置き、アガー表面に埋め込まれるように軽く押し付けます。また、NGMバッファーを満たしたアガープレートを使用して、L4期および若成虫期のウォームから餌の残渣を洗浄します。線虫をNGMバッファーにピックアップした後、数分間泳がせます。洗浄した線虫のうち1匹を、トラッキングプレートのリングの中心付近に慎重に配置します。このプレートは、後にワームトラッカーに使用されます。準備したプレートをワームトラッカーのステージに設置します。LabVIEWプログラムを起動し、必要に応じて画像の保存先、画像の種類、測定項目、カメラ設定などのオプションを選択します。ジョイスティックを使用して顕微鏡を移動させ、コンピュータ画面の視野内にワームの像が入るように調整します。次に、trackボタンを押してトラッキングプログラムを起動させます。ここでは、リアルタイムでトラッキングされた線虫を示しています。コンピュータプログラムは、表示されているようにバイナリフィルタリングされた画像の動きを測定し、この画像をリアルタイムで計測することができます。追跡後、ステッピングモーターの動作から全体的な軌跡の再構成を行うことができ、同時に線虫の局所的な形状変化を詳細に観察することができます。線虫は波動運動を行うことで前進します。私たちは、線虫を単一の中心曲線にスケルトン化し、この曲線を一連の角度として記述することで、これらの動きを捉えています。次に、スケルトンを基本形状、すなわち固有ベクトルに分解します。これらの固有モードを用いることで、線虫の形状を再構成し、その動きを定量化することができます。特に最初の2つのモードを使用すると、2番目のパネルに示されているように、線虫の波動サイクルの位相位置を捉えることができます。最初のパネルはモード1とモード2の共同分布を示しており、円形のリミットサイクルが強調されています。一方方向への位相移動は前進運動に対応し、逆方向への位相移動は後退運動に対応します。したがって、位相速度は線虫の速度に対応します。実空間において、位相と現実世界の速度の強い相関が最後のパネルに示されています。固有モードから導出された位相速度を用いることで、目視では見逃してしまうような海 elegance 行動の微細な詳細を明らかにすることができます。例えば、位相速度と位相の共同分布から、線虫が特定の運動位相において優先的に前進状態への移行および脱出を行うことが明確に示されています。本研究では、表面およびACAプレート上を這う線虫の行動の詳細な画像を記録する、使いやすいトラッキングシステムを実証しました。これらの画像に含まれる情報は膨大かつ高次元であるため、データを4つの基本指標に次元削減する方法も構築しました。これらの指標は、線虫の行動に関して容易に解釈することが可能です。本研究では、低倍率での線虫の行動計測を目的として本システムを構築しました。また、遺伝的にコードされた領域を用いることで、ニューロン活動の計測にも利用可能です。システム全体の設計は柔軟であり、Doof lawやLOEsなどの他のクローリングシステムと組み合わせて使用することもできます。

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放射状運動アッセイを用いたC.エレガンスモデルにおける運動障害の評価

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