C. elegansの追跡と行動計測

表現型解析。C. elegansの移動能力は、C. elegansの行動に関与する遺伝子やニューロンの探索において重要なツールとなります。C. elegansは、形態を変化させることで、前進、後退、および様々な種類の旋回といった定型的な移動行動を示します。これらの運動を長距離にわたり、かつ高い空間的・時間的分解能で定量化するため、我々はアガープレート上を這うC. elegansの動きを捉えるためのワームトラッカーを構築しました。

また、LabVIEWおよびMATLABで作成したカスタムプログラムを用いて、これらの動きを定量的に分離・解析するためのソフトウェアも開発しました。すべてのビデオトラッキングシステムにおける課題は、極めて高次元で膨大な量のデータが生成されることです。我々の画像処理およびデータ解析プログラムでは、虫の形状を独立成分のセットに還元することでこの課題に対処しており、虫の行動をわずか3〜4次元の関数として包括的に再構成しました。

アガープレートをファイバー光源で照射し、カメラで撮像します。このシステムはXY変換ステージに取り付けられています。ステージは標準的なステッピングモーターによって駆動され、ステッピングモーターコントローラーに接続されています。

コントローラーとカメラをコンピューターに接続し、LabVIEWで作成したカスタムプログラムで制御します。カメラでアガールプレートの表面を撮影し、明るい背景上の暗い物体を識別します。自動キャリブレーション工程のためのキャリブレーションマークは、アガー表面に穴を開けることで作成します。

ワームピックを用いて、コンピュータプログラムがリアルタイムで物体を定量化できるよう、画像品質を調整します。カメラのゲイン、明るさ、シャッタースピードを調整し、白背景に暗い物体が表示されるようにします。トラッキングプログラムで使用されるフィルタリング後の二値化画像を確認できます。

このソフトウェアには、テストオブジェクトを一定距離移動させることでキャリブレーション行列を算出する自動キャリブレーション機能が搭載されています。ピクセル単位の距離は、このキャリブレーション行列によってステッピングモーターの移動ステップ数へと校正されます。

校正後、システムは準備完了となり、倍率を変更したりカメラの位置を調整したりしない限り、再校正を行う必要はありません。線虫を囲い込み、プレートの端へ移動するのを防ぐために銅製リングを使用します。まず、リングをヒートブロックまたは同等の装置に載せて加熱してください。

リングを約1分間加熱します。リングを新しいアガープレートの上に置き、アガー表面に埋め込まれるように軽く押し付けます。また、NGMバッファーを満たしたアガープレートを使用して、L4期および若成虫期のウォームから餌の残渣を洗浄します。

線虫をNGMバッファーにピックアップした後、数分間泳がせます。洗浄した線虫のうち1匹を、トラッキングプレートのリングの中心付近に慎重に配置します。このプレートは、後にワームトラッカーに使用されます。

準備したプレートをワームトラッカーのステージに設置します。LabVIEWプログラムを起動し、必要に応じて画像の保存先、画像の種類、測定項目、カメラ設定などのオプションを選択します。ジョイスティックを使用して顕微鏡を移動させ、コンピュータ画面の視野内にワームの像が入るように調整します。

次に、trackボタンを押してトラッキングプログラムを起動させます。ここでは、リアルタイムでトラッキングされた線虫を示しています。コンピュータプログラムは、表示されているようにバイナリフィルタリングされた画像の動きを測定し、この画像をリアルタイムで計測することができます。

追跡後、ステッピングモーターの動作から全体的な軌跡の再構成を行うことができ、同時に線虫の局所的な形状変化を詳細に観察することができます。線虫は波動運動を行うことで前進します。私たちは、線虫を単一の中心曲線にスケルトン化し、この曲線を一連の角度として記述することで、これらの動きを捉えています。

次に、スケルトンを基本形状、すなわち固有ベクトルに分解します。これらの固有モードを用いることで、線虫の形状を再構成し、その動きを定量化することができます。特に最初の2つのモードを使用すると、2番目のパネルに示されているように、線虫の波動サイクルの位相位置を捉えることができます。

最初のパネルはモード1とモード2の共同分布を示しており、円形のリミットサイクルが強調されています。一方方向への位相移動は前進運動に対応し、逆方向への位相移動は後退運動に対応します。したがって、位相速度は線虫の速度に対応します。

実空間において、位相と現実世界の速度の強い相関が最後のパネルに示されています。固有モードから導出された位相速度を用いることで、目視では見逃してしまうような海 elegance 行動の微細な詳細を明らかにすることができます。例えば、位相速度と位相の共同分布から、線虫が特定の運動位相において優先的に前進状態への移行および脱出を行うことが明確に示されています。

本研究では、表面およびACAプレート上を這う線虫の行動の詳細な画像を記録する、使いやすいトラッキングシステムを実証しました。これらの画像に含まれる情報は膨大かつ高次元であるため、データを4つの基本指標に次元削減する方法も構築しました。これらの指標は、線虫の行動に関して容易に解釈することが可能です。

本研究では、低倍率での線虫の行動計測を目的として本システムを構築しました。また、遺伝的にコードされた領域を用いることで、ニューロン活動の計測にも利用可能です。システム全体の設計は柔軟であり、Doof lawやLOEsなどの他のクローリングシステムと組み合わせて使用することもできます。