アゾキシメタン（AOM）とデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）によるモデリング大腸炎関連癌

0日目に、Myerはアゾキシメタンを注射したか、あるいは翌週にOMを投与した。飲料水は、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を含む溶液に置換される。3週目に、マウスにはその後2週間にわたって水が与えられる。

このDSS水サイクルをさらに2回繰り返します。2回目のDSSサイクルの後、鏡視下内視鏡を用いてマウスの腫瘍を評価できます。

10週後、マウスを安楽死させ、結腸を採取します。結腸を洗浄し、縦方向に開きます。結腸の腫瘍サイズおよび腫瘍数を評価します。

結腸の縦断切片を3等分して包埋し、組織学的解析に供することができます。光学顕微鏡を用いて、腫瘍の数え上げと分類が可能です。本プロトコルでは、遺伝毒性物質であるOMを投与し、続いて前炎症性物質を3サイクル投与する方法について説明します。

DSSは、ヒトの潰瘍性大腸炎関連癌に見られるものと形態学的および分子的に類似した結腸腫瘍を、マウスにおいて迅速かつ一貫して誘発します。0日目に、個別にラベル付けされたマウスに尾へのマーキングまたは耳切迫を行い、各マウスのベースライン体重をテーブルに記録します。次に、各マウスに10 mg/kgのOM溶液を投与します。OMは遺伝毒性物質であるため、取り扱いの際は注意してください。7日目に、その後1週間の飲水として2.5% DSS溶液を供給します。この溶液を調製するには、DSS粉末を蒸留水に加え、溶解するまで混ぜ合わせます。

0.2 µmのセルロースアセテートフィルターでろ過した後、溶液は使用可能になります。7日間にわたってDSS溶液を継続的に供給するため、2〜3日ごとにDSSを交換してください。

この期間の後、ケージを水に戻し、2週間維持します。週に2〜3回マウスの体重を測定し、直腸出血や下痢がないか観察してください。腫瘍が大きくなったマウスでは、一時的に直腸脱が生じることがありますが、これは一般的に生存率を低下させません。

ベースラインに対する体重減少を、大腸炎の重症度の代替指標として用います。DSS投与の1サイクル完了後の1週間で、最大10%の体重減少とともに、2〜3日の下痢および血便が予想されます。屠殺前にin vivoでの腫瘍増殖を確認するため、2回目または3回目のDSSサイクルを実施することができます。

A-O-M-D-S-Sモデルは腫瘍の形成において非常に信頼性が高いため、通常このステップは不要です。この方法はマウスの腫瘍を損傷させる可能性があるため、少数のマウスのみを評価対象としてください。作業エリアには、滅菌済みリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を入れたビーカーと、空のビーカーを用意してください。

使用済みのPBSを排出するには、8から10 mLのPBSをシリンジに吸い上げ、使用ごとに内視鏡の先端に接続します。管腔内内容物をフラッシングする際は、吸入または注射による鎮静で各マウスを麻酔し、テープで尾と胸部を平らなボードに固定します。必要に応じてマウスの足底を固定してください。十分な鎮静状態であることを確認するため、親指と人差し指でマウスの下腹部をつまんで肛門を露出し、ムレン内視鏡をマウスの直腸内に挿入します。

PBSを用いて緩やかに膨張および洗浄を行い、管腔内の視認性を向上させ、糞便内容物を除去します。モニターを確認しながら、内視鏡をゆっくりと進め続けます。70日目において、A-O-M-D-S-S処置を施した各マウスは、肉眼的に確認可能な複数の結腸腫瘍を有しており、評価可能な状態であるはずです。

より大きな腫瘍を必要とする場合は、この状態まで数週間から数ヶ月遅らせることができます。ガバージュ針を取り付けたPBS充填シリンジを準備します。10%ホルマリンを充填したシリンジ、基本的な外科用はさみ、および先丸はさみを用意してください。

1% Evans Blue溶液を充填した小型シリンジと精密ピンセットを用意します。また、コールドトレイ、冷却したPBSAを入れたウェーイングボート、切断用の新しいカミソリ、および10%ホルマリンを満たした固定槽を準備します。イソフルラン投与および頸椎脱臼、またはその他の施設で承認された方法により、各マウスを安楽死させます。最終重量およびその他の測定を行います。

このタイミングで、マウスの腹側を上に向けた状態でまな板の上に置きます。腹部に70%ethanolをスプレーし、解剖領域に毛が付着しないようにします。ピンセットで腹部正中線を掴み、皮膚に小さな切開を加えて腹膜を露出させます。

緩やかな牽引を用いて皮膚を腹膜から剥離し、腹腔全体を露出させます。腹膜を切開し、この切開線を両側の肋骨縁に沿って延長します。閉じた状態でハサミを用い、小腸と結腸を側方に寄せます。

これにより腸間膜リンパ節が露出し、必要に応じて採取することができます。評価を行う際は、生殖泌尿器系を下方へ掃き出すように移動させて下行結腸と直腸を露出させ、骨盤をさらに露出させるために、必要に応じて膀胱および生殖器官を摘出します。その際、隣接する組織を損傷させないよう注意してください。

恥骨下枝および恥骨上枝を切断し、肛門直腸接合部を露出させます。結腸を遊離させるため、緩やかに上方向へ牽引しながら、肛門直腸接合部周囲の皮膚を切除します。腸間膜鉗子を用いて、結腸の付着部を切除または剥離します。

肛門直腸接合部の皮膚の一部を残しておくことが重要です。この領域は異形成が起こりやすいためです。盲腸の直近で、大腸を小腸から切断します。5 mLシリンジに装着した18ゲージの経口投与用針（gavage needle）を用いて、盲腸を隣接する結腸から分離します。

丸みを帯びた先端のハサミを用い、生理的な方向に液体が流出するように、結腸を氷冷PBSで洗浄します。結腸を腸間膜に沿って切開します。切開した結腸を冷やしたトレイの上に広げて固定します。

組織が凍結しないよう、トレイが十分に解凍されていることを確認してください。腫瘍をより明確に可視化するため、1%Ian Blueを指で数滴塗布します。定規を用いて腫瘍の数と大きさを評価するか、デジタル解析のために写真を撮影してください。

この時点で、RNA、タンパク質、または免疫組織化学的手法による今後の解析のために、腫瘍の小片と隣接する正常組織を切り出し、組織学的評価用に結腸の一部を残しておきます。シリンジまたは指を用いて、コールドトレイ上の残りの結腸に10% formalinを塗布し、組織を少なくとも30秒間固定させます。これにより、固定液槽への移送が容易になります。

同じトレイ上で新しい開大結腸を塗装する前に、残留したホルマリンを拭き取ってください。結腸を10%ホルマリンで満たした水槽に移し、端をピンで固定します。3時間の固定後、ホルマリンを廃棄し、70%エタノールに交換します。

結腸は70%エタノール中で無期限に保存可能です。弱熱を用いて2%アガロース溶液を調製し、ガラスプレート上に清潔なスライドを準備します。固定した結腸を3等分に切断し、使用しない部分はエタノール槽に戻します。

2枚のカミソリを使用して、切片を均一なサイズに切り揃えます。結腸切片と層を、清潔なスライド上のアガーに包埋します。次の結腸についてもこの工程を繰り返します。

切除したセグメントから余分なアガーを取り除き、埋入した結腸をカセットに入れ、ヘマトキシリン・エオジン染色による処理および染色を行う。図1に、大腸炎関連癌誘導のプロトコルを示す。図2に、OMおよびDSS投与期間中のベースラインに対するマウスの体重変化を示す。

各DSSサイクルの後の1週間で、マウスは体重の5〜10%を減少させます。本実験における体重減少は、大腸炎の重症度を示す代替マーカーとなります。図3は、A-O-M-D-S-S投与50日目における、ムレン内視鏡で観察した遠位結腸の腫瘍の様子を示しています。

パネルBおよびCにおいて、正常な結腸と比較して、遠位結腸の管腔を閉塞している複数のポリープ状腫瘤に注目してください。パネルaの図4は、腫瘍のマクロな外観を示す、縦方向に切開したマウス結腸です。遠位結腸における腫瘍負荷の高さと、腫瘍の増殖がほとんど見られない近位結腸の特徴的な質感に注目してください。

図5は、lcおよびブルー染色の適用によって強調された腫瘍を示しています。染料が結腸の正常な組織構造だけでなく、個々の腫瘍の境界をどのように強調しているかに注目してください。このような染色は、定規やデジタル測定による腫瘍領域の正確な計測に有用です。

図6は、OMおよびDSSで処理したマウス1匹あたりの平均腫瘍数の代表的な分布を示しています。ほとんどの腫瘍は遠位結腸に位置し、サイズが2 mm未満であることに注意してください。図7は、カセットに入った結腸のパラフィン包埋縦断切片と、H&E染色スライドを示しています。

残留したSおよびブルー染色は、H&E染色の妨げにならないことに留意してください。スライド画像上の大きな腫瘍に丸印を付けています。遠位、中間、近位という区分は、盲腸から肛門までの結腸全体を3等分に切断した結果によるものです。

図8は、遠位結腸におけるOMおよびDSS投与により生じた腫瘍の代表的な組織像を示しています。提示された顕微鏡写真は、HおよびE、B-R-D-U、およびbeta-cateninで染色されており、ヒトの結腸腺がん Tops に類似した異形成変化が認められます。本ビデオでは、OMの単回投与に続き、DSSを7日間投与するサイクルを3回繰り返すことで、炎症誘発性のマウス結腸腫瘍形成を実現するプロトコルを実演しました。

10週間にわたるこのモデルでは、ヒトの潰瘍性大腸炎関連癌で起こるものと組織学的および分子的に酷似した変化を伴う腫瘍が誘発され、本疾患における腫瘍形成および化学予防の研究に非常に有用なモデルとなります。